分光光度法
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《儀器分析法概述》
儀器分析法 | ||||
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分光光度法
分光光度法是通過測定被測物質(zhì)在特定波長處或一定波長范圍內(nèi)光的吸收度，對(duì)該物質(zhì)進(jìn)行定性和定量分析的方法。 常用的波長范圍為：(1)200～400nm的紫外光區(qū),(2)400～760nm的可見光區(qū),(3)2.5～25μm(按波數(shù)計(jì)為4000cm<-1>～400cm<-1>)的紅外光區(qū)。所用儀器為紫外分光光度計(jì)、可見光分光光度計(jì)(或比色計(jì))、紅外分光光度計(jì)或原子吸收分光光度計(jì)。為保證測量的精密度和準(zhǔn)確度，所有儀器應(yīng)按照國家計(jì)量檢定規(guī)程或本附錄規(guī)定，定期進(jìn)行校正檢定。 單色光輻射穿過被測物質(zhì)溶液時(shí)，被該物質(zhì)吸收的量與該物質(zhì)的濃度和液層的厚度(光路長度)成正比，其關(guān)系如下式： 1 A=log ─ =ECL T 式中 A 為吸收度； T 為透光率； E 為吸收系數(shù)，采用的表示方法是(E1% 1cm),即吸收度換算成溶液濃度為1%(g/ml)，液層厚度為1cm的數(shù)值； C 為100ml溶液中所含被測物質(zhì)的重量，g(按干燥品或無水物計(jì)算)； L 為液層厚度 ，cm。 物質(zhì)對(duì)光的選擇性吸收波長，以及相應(yīng)的吸收系數(shù)是該物質(zhì)的物理常數(shù)。當(dāng)已知某純物質(zhì)在一定條件下的吸收系數(shù)后,可用同樣條件將該供試品配成溶液，測定其吸收度,即可由上式計(jì)算出供試品中該物質(zhì)的含量。在可見光區(qū)，除某些物質(zhì)對(duì)光有吸收外，很多物質(zhì)本身并沒有吸收,但可在一定條件下加入顯色試劑或經(jīng)過處理使其顯色后再測定,故又稱比色分析。由于顯色時(shí)影響呈色深淺的因素較多，且常使用單色光純度較差的儀器，故測定時(shí)應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)品或?qū)φ掌吠瑫r(shí)操作。
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薄層色譜法
薄層色譜法，系將適宜的固定相涂布于玻璃板、塑料或鋁基片上，成一均勻薄層。待點(diǎn)樣、展開后，與適宜的對(duì)照物按同法所得的色譜圖作對(duì)比，用以進(jìn)行藥品的鑒別、雜質(zhì)檢查或含量測定的方法。
1.儀器與材料 (1) 玻板
除另有規(guī)定外，用5cm×20cm，10cm×20cm或20cm×20cm的規(guī)格,要求光滑、平整，洗凈后不附水珠，晾干。
(2) 固定相或載體
最常用的有硅膠G、硅膠GF<[254]>
、硅膠H、 硅膠HF<[254]>,其次有硅藻土、硅藻土G、氧化鋁、氧化鋁G、微晶纖維素、微晶纖維素F<[254]>等。
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其顆粒大小,一般要求直徑為10～40μm。薄層涂布,一般可分無粘合劑和含粘合劑兩種;前者系將固定相直接涂布于玻璃板上,后者系在固定相中加入一定量的粘合劑，一般常用10～15%煅石膏(CaSO4.2H2O在140℃烘4小時(shí))，混勻后加水適量使用，或用羧甲基纖維素鈉水溶液(0.5～0.7%)適量調(diào)成糊狀，均勻涂布于玻璃板上。也有含一定固定相或緩沖液的薄層。
(3) 涂布器
應(yīng)能使固定相或載體在玻璃板上涂成一層符合厚度要求的均勻薄層。
(4) 點(diǎn)樣器 同紙色譜法項(xiàng)下。
(5) 展開室
應(yīng)使用適合薄層板大小的玻璃制薄層色譜展開缸，并有嚴(yán)密的蓋子，除另有規(guī)定外，底部應(yīng)平整光滑，應(yīng)便于觀察。
, http://www.www.srpcoatings.com 2.操作方法 (1) 薄層板制備
除另有規(guī)定外,將1份固定相和3份水在研缽中向一方向研磨混合,去除表面的氣泡后，倒入涂布器中,在玻板上平穩(wěn)地移動(dòng)涂布器進(jìn)行涂布(厚度為0.2～0.3mm)，取下涂好薄層的玻板，置水平臺(tái)上于室溫下晾干，后在110℃烘30分鐘，即置有干燥劑的干燥箱中備用。使用前檢查其均勻度(可通過透射光和反射光檢視)。
(2) 點(diǎn)樣
除另有規(guī)定外，用點(diǎn)樣器點(diǎn)樣于薄層板上，一般為圓點(diǎn)，點(diǎn)樣基線距底邊2.0cm，樣點(diǎn)直徑及點(diǎn)間距離同紙色譜法,點(diǎn)間距離可視斑點(diǎn)擴(kuò)散情況以不影響檢出為宜。點(diǎn)樣時(shí)必須注意勿損傷薄層表面。
(3) 展開
展開室如需預(yù)先用展開劑飽和，可在室中加入足夠量的展開劑，并在壁上貼二條與室一樣高、寬的濾紙條，一端浸入展開劑中，密封室頂?shù)纳w，使系統(tǒng)平衡或按正文規(guī)定操作。
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將點(diǎn)好樣品的薄層板放入展開室的展開劑中,浸入展開劑的深度為距薄層板底邊0.5～1.0cm(切勿將樣點(diǎn)浸入展開劑中),密封室蓋,待展開至規(guī)定距離(一般為10～15cm),取出薄層板，晾干，按各品種項(xiàng)下的規(guī)定檢測。
(4)
如需用薄層掃描儀對(duì)色譜斑點(diǎn)作掃描檢出，或直接在薄層上對(duì)色譜斑點(diǎn)作掃描定量，則可用薄層掃描法。
薄層掃描的方法，除另有規(guī)定外，可根據(jù)各種薄層掃描儀的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)及使用說明，結(jié)合具體情況，選擇吸收法或熒光法，用雙波長或單波長掃描。由于影響薄層掃描結(jié)果的因素很多，故應(yīng)在保證供試品的斑點(diǎn)在一定濃度范圍內(nèi)呈線性的情況下，將供試品與對(duì)照品在同一塊薄層上展開后掃描，進(jìn)行比較并計(jì)算定量，以減少誤差。各種供試品，只有得到分離度和重現(xiàn)性好的薄層色譜，才能獲得滿意的結(jié)果。
層析技術(shù)的應(yīng)用
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一、層析技術(shù)的原理和分類
(一)層析技術(shù)的原理
層析法是目前廣泛應(yīng)用的一種分離技術(shù)。本世紀(jì)初俄國植物學(xué)家M.Tswett發(fā)現(xiàn)并使用這一技術(shù)證明了植物的葉子中不僅有葉綠素還含有其它色素�，F(xiàn)在層析法已成為生物化學(xué)、分子生物學(xué)及其它學(xué)科領(lǐng)域有效的分離分析工具之一。
層析法是利用不同物質(zhì)理化性質(zhì)的差異而建立起來的技術(shù)。所有的層析系統(tǒng)都由兩個(gè)相組成：一是固定相，它或者是固體物質(zhì)或者是固定于固體物質(zhì)上的成分；另一是流動(dòng)相，即可以流動(dòng)的物質(zhì)，如水和各種溶媒。當(dāng)待分離的混合物隨溶媒(流動(dòng)相)通過固定相時(shí)，由于各組份的理化性質(zhì)存在差異，與兩相發(fā)生相互作用(吸附、溶解、結(jié)合等)的能力不同，在兩相中的分配(含量對(duì)比)不同，而且隨溶媒向前移動(dòng)，各組份不斷地在兩相中進(jìn)行再分配。與固定相相互作用力越弱的組份，隨流動(dòng)相移動(dòng)時(shí)受到的阻滯作用小，向前移動(dòng)的速度快。反之，與固定相相互作用越強(qiáng)的組份，向前移動(dòng)速度越慢。分部收集流出液，可得到樣品中所含的各單一組份，從而達(dá)到將各組份分離的目的。
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(二)層析法分類見表
(三)層析法的特點(diǎn)與應(yīng)用
表按兩相所處狀態(tài)分類
流動(dòng)相 | |||
液體 | 氣體 | ||
, 百拇醫(yī)藥 液體 | 液-液層析法 | 氣-液層析法 | |
固定相 | |||
固體 | 液-固層析法 | 氣-固層析法 | |
層析法是根據(jù)物質(zhì)的理化性質(zhì)不同而建立的分離分析方法。根據(jù)層析峰的位置及峰高或峰面積，可以定性及定量。層析法與光學(xué)、電學(xué)或電化學(xué)儀器連用，可檢測出層析后各組份的濃度或質(zhì)量，同時(shí)繪出層析圖。層析儀與電子計(jì)算機(jī)聯(lián)用，可使操作及數(shù)據(jù)處理自動(dòng)化，大大縮短分析時(shí)間。由于層析法具有分辨率高、靈敏度高、選擇性好、速度快等特點(diǎn)，因此適用于雜質(zhì)多、含量少的復(fù)雜樣品分析，尤其適用于生物樣品的分離分析。近年來，已成為生物化學(xué)及分子生物學(xué)常用的分析方法。在醫(yī)藥衛(wèi)生、環(huán)境化學(xué)、高分子材料、石油化工等方面也得到了廣泛的應(yīng)用。
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表 按層析原理分類
名稱 | 分離原理 |
吸附層析法 | 組份在吸附劑表面吸附固定相是固體吸附劑，各能力不同 |
分配層析法 | 各組份在流動(dòng)相和靜止液相(固相)中的分配系數(shù)不同 |
, 百拇醫(yī)藥 離子交換層析法 | 固定相是離子交換劑，各組份與離子交換劑親和力不同 |
凝膠層析法 | 固定相是多孔凝膠，各組份的分子大小不同，因而在凝膠上受阻滯的程度不同 |
親和層析法 | 固定相只能與一種待分離組份專一結(jié)合，以此和無親和力的其它組份分離 |
表 按操作形式不同分類
, http://www.www.srpcoatings.com 名稱 | 操作形式 |
柱層析法 | 固定相裝于柱內(nèi)，使樣品沿著一個(gè)方向前移而達(dá)分離 |
薄層層析法 | 將適當(dāng)粘度的固定相均勻涂鋪在薄板上，點(diǎn)樣后用流動(dòng)相展開，使各組份分離 |
紙層析法 | , http://www.www.srpcoatings.com 用濾紙作液體的載體，點(diǎn)樣后用流動(dòng)相展開，使各組份分離 |
薄膜層析法 | 將適當(dāng)?shù)母叻肿佑袡C(jī)吸附劑制成薄膜，以類似紙層析方法進(jìn)行物質(zhì)的分離 |
二、層析法實(shí)驗(yàn)技術(shù)
(一)凝膠層析法
凝膠層析又稱分子篩過濾、排阻層析等。它的突出優(yōu)點(diǎn)是層析所用的凝膠屬于惰性載體，不帶電荷，吸附力弱，操作條件比較溫和，可在相當(dāng)廣的溫度范圍下進(jìn)行，不需要有機(jī)溶劑，并且對(duì)分離成分理化性質(zhì)的保持有獨(dú)到之處。對(duì)于高分子物質(zhì)有很好的分離效果。
⒈凝膠的選擇
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根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康牟煌x擇不同型號(hào)的凝膠。如果實(shí)驗(yàn)?zāi)康氖菍悠分械拇蠓肿游镔|(zhì)和小分子物質(zhì)分開，由于它們?cè)诜峙湎禂?shù)上有顯著差異，這種分離又稱組別分離，一般可選用Sephadex
G-25和G-50，對(duì)于小肽和低分子量的物質(zhì)(1000-5000)的脫鹽可使用Sephadex
G-10，G-15及Bio-Gel-p-2或4。如果實(shí)驗(yàn)?zāi)康氖菍悠分幸恍┓肿恿勘容^近似的物質(zhì)進(jìn)行分離，這種分離又叫分級(jí)分離。一般選用排阻限度略大于樣品中最高分子量物質(zhì)的凝膠，層析過程中這些物質(zhì)都能不同程度地深入到凝膠內(nèi)部，由于Kd不同，最后得到分離。
⒉柱的直徑與長度根據(jù)經(jīng)驗(yàn)，組別分離時(shí)，大多采用2-30cm長的層析柱，分級(jí)分離時(shí)，一般需要100cm左右長的層析柱，其直徑在1-5cm范圍內(nèi)，小于1cm產(chǎn)生管壁效應(yīng)，大于5cm則稀釋現(xiàn)象嚴(yán)重。長度L與直徑D的比值L/D一般宜在7-10之間，但對(duì)移動(dòng)慢的物質(zhì)宜在30-40之間。
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⒊凝膠柱的制備
凝膠型號(hào)選定后，將干膠顆粒懸浮于5-10倍量的蒸餾水或洗脫液中充分溶脹，溶脹之后將極細(xì)的小顆粒傾瀉出去。自然溶脹費(fèi)時(shí)較長，加熱可使溶脹加速，即在沸水浴中將濕凝膠漿逐漸升溫至近沸，1-2小時(shí)即可達(dá)到凝膠的充分脹溶。加熱法既可節(jié)省時(shí)間又可消毒。
凝膠的裝填：將層析柱與地面垂直固定在架子上，下端流出口用夾子夾緊，柱頂可安裝一個(gè)帶有攪拌裝置的較大容器，柱內(nèi)充滿洗脫液，將凝膠調(diào)成較稀薄的漿頭液盛于柱頂?shù)娜萜髦�，然后在微微地�(cái)嚢柘率鼓z下沉于柱內(nèi)，這樣凝膠粒水平上升，直到所需高度為止，拆除柱頂裝置，用相應(yīng)的濾紙片輕輕蓋在凝膠床表面。稍放置一段時(shí)間，再開始流動(dòng)平衡，流速應(yīng)低于層析時(shí)所需的流速。在平衡過程中逐漸增加到層析的流速，千萬不能超過最終流速。平衡凝膠床過夜，使用前要檢查層析床是否均勻，有無“紋路”或氣泡，或加一些有色物質(zhì)來觀察色帶的移動(dòng)，如帶狹窄、均勻平整說明層析柱的性能良好，色帶出現(xiàn)歪曲、散亂、變寬時(shí)必須重新裝柱。
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⒋加樣和洗脫
凝膠床經(jīng)過平衡后，在床頂部留下數(shù)亳升洗脫液使凝膠床飽和，再用滴管加入樣品。一般樣品體積不大于凝膠總床體積的5%-10%。樣品濃度與分配系數(shù)無關(guān)，故樣品濃度可以提高，但分子量較大的物質(zhì)，溶液的粘度將隨濃度增加而增大，使分子運(yùn)動(dòng)受限，故樣品與洗脫液的相對(duì)粘度不得超過1.5-2。樣品加入后打開流出口，使樣品滲入凝膠床內(nèi)，當(dāng)樣品液面恰與凝膠床表面相平時(shí)，再加入數(shù)毫升洗脫液中洗管壁，使其全部進(jìn)入凝膠床后，將層析床與洗脫液貯瓶及收集器相連，預(yù)先設(shè)計(jì)好流速，然后分部收集洗脫液，并對(duì)每一餾份做定性、定量測定。
⒌凝膠柱的重復(fù)使用、凝膠回收與保存
一次裝柱后可以反復(fù)使用，不必特殊處理，并不影響分離效果。為了防止凝膠染菌，可在一次層析后加入0.02%的疊氮鈉，在下次層析前應(yīng)將抑菌劑除去，以免干擾洗脫液的測定。
如果不再使用可將其回收，一般方法是將凝膠用水沖洗干凈濾干，依次用70%、90%、95%乙醇脫水平衡至乙醇濃度達(dá)90%以上，濾干，再用乙醚洗去乙醇、濾干、干燥保存。濕態(tài)保存方法是凝膠漿中加入抑菌劑或水沖洗到中性，密封后高壓滅菌保存。
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⒍凝膠層析的應(yīng)用
⑴脫鹽：高分子(如蛋白質(zhì)、核酸、多糖等)溶液中的低分子量雜質(zhì)，可以用凝膠層析法除去，這一操作稱為脫鹽。本法脫鹽操作簡便、快速、蛋白質(zhì)和酶類等在脫鹽過程中不易變性。適用的凝膠為SephadexG-10、15、25或Bio-Gel-p-2、4、6。柱長與直徑之比為5-15，樣品體積可達(dá)柱床體積的25%-30%，為了防止蛋白質(zhì)脫鹽后溶解度降低會(huì)形成沉淀吸附于柱上，一般用醋酸銨等揮發(fā)性鹽類緩沖液使層析柱平衡，然后加入樣品，再用同樣緩沖液洗脫，收集的洗脫液用冷凍干燥法除去揮發(fā)性鹽類。
⑵用于分離提純：凝膠層析法已廣泛用于酶、蛋白質(zhì)、氨基酸、多糖、激素、生物堿等物質(zhì)的分離提純。凝膠對(duì)熱原有較強(qiáng)的吸附力，可用來去除無離子水中的致熱原制備注射用水。
⑶測定高分子物質(zhì)的分子量：用一系列已知分子量的標(biāo)準(zhǔn)品放入同一凝膠柱內(nèi)，在同一條件下層析，記錄每一分鐘成分的洗脫體積，并以洗脫體積對(duì)分子量的對(duì)數(shù)作圖，在一定分子量范圍內(nèi)可得一直線，即分子量的標(biāo)準(zhǔn)曲線。測定未知物質(zhì)的分子量時(shí)，可將此樣品加在測定了標(biāo)準(zhǔn)曲線的凝膠柱內(nèi)洗腫后，根據(jù)物質(zhì)的洗脫體積，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出它的分子量。
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⑷高分子溶液的濃縮：通常將SephadexG-25或50干膠投入到稀的高分子溶液中，這時(shí)水分和低分子量的物質(zhì)就會(huì)進(jìn)入凝膠粒子內(nèi)部的孔隙中，而高分子物質(zhì)則排阻在凝膠顆粒之外，再經(jīng)離心或過濾，將溶脹的凝膠分離出去，就得到了濃縮的高分子溶液。
(二)離子交換層析法
離子交換層析法是以具有離子交換性能的物質(zhì)作固定相，利用它與流動(dòng)相中的離子能進(jìn)行可逆的交換性質(zhì)來分離離子型化合物的一種方法。
⒈離子交換劑預(yù)處理和裝柱
對(duì)于離子交換纖維素要用流水洗去少量碎的不易沉淀的顆粒，以保證有較好的均勻度，對(duì)于已溶脹好的產(chǎn)品則不必經(jīng)這一步驟。溶脹的交換劑使用前要用稀酸或稀堿處理，使之成為帶H+或OH-的交換劑型。陰離子交換劑常用“堿-酸-堿”處理，使最終轉(zhuǎn)為-OH-型或鹽型交換劑；對(duì)于陽離子交換劑則用“酸-堿-酸”處理，使最終轉(zhuǎn)為-H-型交換劑。洗滌好的纖維素使用前必須平衡至所需的pH和離子強(qiáng)度。已平衡的交換劑在裝柱前還要減壓除氣泡。為了避免顆粒大小不等的交換劑在自然沉降時(shí)分層，要適當(dāng)加壓裝柱，同時(shí)使柱床壓緊，減少死體積，有利于分辨率的提高。柱子裝好后再用起始緩沖液淋洗，直至達(dá)到充分平衡方可使用。
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⒉加樣與洗脫
加樣：層析所用的樣品應(yīng)與起始緩沖液有相同的pH和離子強(qiáng)度，所選定的pH值應(yīng)落在交換劑與被結(jié)合物有相反電荷的范圍，同時(shí)要注意離子強(qiáng)度應(yīng)低，可用透析、凝膠過濾或稀釋法達(dá)此目的。樣品中的不溶物應(yīng)在透析后或凝膠過濾前，以離心法除去。為了達(dá)到滿意的分離效果，上樣量要適當(dāng)，不要超過柱的負(fù)荷能力。柱的負(fù)荷能力可用交換容量來推算，通常上樣量為交換劑交換總量的1%-5%。
洗脫：已結(jié)合樣品的離子交換前，可通過改變?nèi)芤旱膒H或改變離子強(qiáng)度的方法將結(jié)合物洗脫，也可同時(shí)改變pH與離子強(qiáng)度。為了使復(fù)雜的組份分離完全，往往需要逐步改變pH或離子強(qiáng)度，其中最簡單的方法是階段洗脫法，即分次將不同pH與離子強(qiáng)度的溶液加入，使不同成分逐步洗脫。由于這種洗脫pH與離子強(qiáng)度的變化大，使許多洗脫體積相近的成分同時(shí)洗脫，純度較差，不適宜精細(xì)的分離。最好的洗脫方法是連續(xù)梯度洗脫，洗脫裝置見圖16-6。兩個(gè)容器放于同一水平上，第一個(gè)容器盛有一定pH的緩沖液，第二個(gè)容器含有高鹽濃度或不同pH的緩沖液，兩容器連通，第一個(gè)容器與柱相連，當(dāng)溶液由第一容器流入柱時(shí)，第二容器中的溶液就會(huì)自動(dòng)來補(bǔ)充，經(jīng)攪拌與第一容器的溶液相混合，這樣流入柱中的緩沖液的洗脫能力即成梯度變化。第一容器中任何時(shí)間的濃度都可用下式進(jìn)行計(jì)算：
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C＝C2-(C2-C1)(1-V)A2/A1
式中A1、A2分別代表兩容器的截面積：C1、C2分別表示容器中溶液的濃度；V為流出體積對(duì)總體積之比。當(dāng)A1＝A2時(shí)為線性梯度，當(dāng)A1>A2時(shí)為凹形梯度，A1>A2時(shí)為凸形梯度。
洗脫時(shí)應(yīng)滿足以下要求：①洗脫液體積應(yīng)足夠大，一般要幾十倍于床體積，從而使分離的各峰不致于太擁擠。②梯度的上限要足夠高，使緊密吸附的物質(zhì)能被洗脫下來。③梯度不要上升太快，要恰好使移動(dòng)的區(qū)帶在快到柱末端時(shí)達(dá)到解吸狀態(tài)。目的物的過早解吸，會(huì)引起區(qū)帶擴(kuò)散；而目的物的過晚解吸會(huì)使峰形過寬。
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⒊洗脫餾份的分析
按一定體積(5-10ml/管)收集的洗脫液可逐管進(jìn)行測定，得到層析圖譜。依實(shí)驗(yàn)?zāi)康牡牟煌�，可采用適宜的檢測方法(生物活性測定、免疫學(xué)測定等)確定圖譜中目的物的位置，并回收目的物。
⒋離子交換劑的再生與保存
離子交換劑可在柱上再生。如離子交換纖維素可用2mol/:
NaCl淋洗柱，若有強(qiáng)吸附物則可用0.1mol/L
NaOH洗柱；若有脂溶性物質(zhì)則可用非離子型去污劑洗柱后再生，也可用乙醇洗滌，其順序?yàn)椋?.5mol/L
NaOH-水-乙醇-水-20%NaOH-水。保存離子交換劑時(shí)要加防腐劑。對(duì)陰離子交換劑宜用0.002%氯已定(洗必泰)，陽離子交換劑可用乙基硫柳汞(0.005%)。有些產(chǎn)品建立用0.02%疊氮鈉。
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⒌離子交換層析的應(yīng)用
離子交換層析技術(shù)已廣泛用于各學(xué)科領(lǐng)域。在生物化學(xué)及臨床生化檢驗(yàn)中主要用于分離氨基酸、多肽及蛋白質(zhì)，也可用于分離核酸、核苷酸及其它帶電荷的生物分子。
(三)高效液相層析法
高效液相層析法(HPLC)是近二十年來發(fā)展起來的一項(xiàng)新穎快速的分離技術(shù)。它是在經(jīng)典液相層析法基礎(chǔ)上，引進(jìn)了氣相層析的理論具有氣相層析的全部優(yōu)點(diǎn)。由于HPLC分離能力強(qiáng)、測定靈敏度高，可在室溫下進(jìn)行，應(yīng)用范圍極廣，無論是極性還是非極性，小分子還是大分子，熱穩(wěn)定還是不穩(wěn)定的化合物均可用此法測定。對(duì)蛋白質(zhì)、核酸、氨基酸、生物堿、類固醇和類脂等尤為有利。
高效液相層析法的基本概念和分離理論與經(jīng)典的液相色譜法及氣相色譜法一致，因而其塔板理論及動(dòng)力學(xué)理論等都可用于高效液相層析。
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⒈高效液相層析儀
典型的高效液相層析儀包括輸液系統(tǒng)、層析柱與檢測系統(tǒng)三部分。流動(dòng)相用一高壓泵輸入。這種高壓泵應(yīng)滿足以下條件：①流量恒定，無脈動(dòng)，并有較大的調(diào)節(jié)范圍。②能抗溶劑腐蝕。③有較高的輸出壓力，一般要達(dá)到15～300kg/c，也有的高達(dá)800kg/c。④泵的死體積要小。梯度洗脫裝置必須具備兩臺(tái)高壓泵，一臺(tái)輸送強(qiáng)溶劑，一臺(tái)輸送弱溶劑，兩泵運(yùn)轉(zhuǎn)速度用電腦控制，并可按一定的要求改變流動(dòng)相的組成，以改善分離效果。一般用微量注射器直接進(jìn)樣，也可采用六通閥門進(jìn)樣。HPLC中所用的檢測器最多應(yīng)用的是紫外吸收檢測，靈敏度可達(dá)ng水平。此外，還有熒光檢測器、示差析光檢測器、電化學(xué)檢測器等。
⒉HPLC的類型與應(yīng)用
⑴液-固吸附層析：固定相是具有吸附活性的吸附劑，常用的有硅膠、氧化鋁、高分子有機(jī)酸或聚酰胺凝膠等。液-固吸附層析中的流動(dòng)相依其所起的作用不同，分為“底劑”和洗脫劑兩類，底劑起決定基本色譜的分離作用，洗脫劑起調(diào)節(jié)試樣組份的滯留時(shí)間長短，并對(duì)試樣中某幾個(gè)組份具有選擇性作用。流動(dòng)相中底劑與洗脫劑成分的組合和選擇，直接影響色譜的分離情況，一般底劑為極性較低的溶劑，如正已烷、環(huán)已烷、戊烷、石油醚等，洗脫劑則根據(jù)試樣性質(zhì)選用針對(duì)性溶劑，如醚、酯、酮、醇和酸等。本法可用于分離異構(gòu)體、抗氧化劑與維生素等。
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⑵液-液分配層析：固定相為單體固定液構(gòu)成。將固定液的官能團(tuán)結(jié)合在薄殼或多孔型硅膠上，經(jīng)酸洗、中和、干燥活化、使表面保持一定的硅羥基。這種以化學(xué)鍵合相為固定相的液-液層析稱為化學(xué)鍵合相層析。另一種利用離子對(duì)原理的液-液分配層析為離子對(duì)層析。化學(xué)鍵合層析分：①極性鍵合相層析：固定相為極性基團(tuán)，氰基、氨基及雙羥基三種。流動(dòng)相為非極性或極性較小的溶劑。極性小的組份先出峰，極性大的后出峰，這稱為正相層析法，適用于分離極性化合物。②非極性鍵合相層析：固定相為非極性基團(tuán)，如十八烷基(C18)、辛烷基(C8)、甲基與苯基等，流動(dòng)相用強(qiáng)極性溶劑，如水、醇、乙腈或無機(jī)鹽緩沖液。最常用的是不同比例的水和甲醇配制的混合溶劑，水不僅起洗脫作用還可掩蓋載體表面的硅羥基，防止因吸附而至的拖尾現(xiàn)象。極性大的組份先出峰，極性小的組份后出峰，恰好與正相法相反，故稱反相層析。本法適用于小分子物質(zhì)的分離，如肽、核苷酸、糖類、氨基酸的衍生物等。離子對(duì)分配層析分：①正相離子對(duì)層析：此法常以水吸附在硅膠上作為固定相，把與分離組份帶相反電荷的配對(duì)離子以一定濃度溶于水或緩沖液涂漬在硅膠上。流動(dòng)相為極性較低的有機(jī)溶劑。在層析過程中，待分離的離子與水相中配對(duì)離子形成中性離子對(duì)，在水相和有機(jī)相中進(jìn)行分配，而達(dá)到分離。本法優(yōu)點(diǎn)是流動(dòng)相選擇余地大，缺點(diǎn)是固定相易流失。②反向離子對(duì)層析：固定相是疏水性鍵合硅膠，如C18鍵合相，待分離離子和帶相反電荷的配對(duì)離子同時(shí)存在于強(qiáng)極性的流動(dòng)相中，生成的中性離子對(duì)在流動(dòng)相和鍵合相之間進(jìn)行分配，而得到分離。本法優(yōu)點(diǎn)是固定相不存在流失問題、流動(dòng)相含水或緩沖液更適用于電離性化合物的分離。
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⑶離子交換層析：原理與普通離子交換相同。在離子交換HPLC中，固定相多用離子性鍵合相，故本法又稱離子性鍵合相層析。流動(dòng)相主要是水溶液，pH值最好在被分離酸、堿的pK值附近。
(四)親和層析法
親和層析是利用待分離物質(zhì)和它的特異性配體間具有特異的親和力，從而達(dá)到分離目的的一類特殊層析技術(shù)。
具有專一親和力的生物分子對(duì)主要有：抗原與抗體、DNA與互補(bǔ)DNA或RNA、酶與它的底物或競爭性抑制劑、激素(或藥物)與它們的受體、維生素和它的特異結(jié)合蛋白、糖蛋白與它相應(yīng)的植物凝集素等。可親和的一對(duì)分子中的一方以共價(jià)鍵形式與不溶性載體相連作為固定相吸附劑，當(dāng)含有混合組份的樣品通過此固定相時(shí)，只有和固定相分子有特異親和力的物質(zhì)，才能被固定相吸附結(jié)合，其它沒有親和力的無關(guān)組份就隨流動(dòng)相流出，然后改變流動(dòng)組成份，將結(jié)合的親和物洗脫下來。親和層析中所用的載體稱為基質(zhì)，與基質(zhì)共價(jià)連接的化合物稱配基。
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親和層析純化過程簡單、迅速，且分離效率高。對(duì)分離含量極少又不穩(wěn)定的活性物質(zhì)尤為有效。但本法必須針對(duì)某一分離對(duì)象，制備專一的配基和尋求層析的穩(wěn)定條件，因此親和層析的應(yīng)用范圍受到了一定的限制。
親和層析可用于純化生物大分子：稀溶液的濃縮；不穩(wěn)定蛋白質(zhì)的貯藏；從純化的分子中除去殘余的污染物；用免疫吸附劑吸附純化對(duì)此尚無互補(bǔ)配體的生物大分子；分離核酸是親和層析應(yīng)用的一個(gè)重要方面。
應(yīng)用實(shí)例：2-胰凝乳蛋白酶的提純
⒈親和吸附劑(Σ-氨基-N-乙酰-D-色氨酸)的制備
取一定體積的Sepharose4B加100mgCNBr。攪拌混合物，滴加2-8mol/L
NaOH，使溶液pH維持在11.0。20℃左右，8-12分鐘完成反應(yīng)。在布氏漏斗中抽濾活化的瓊脂糖，然后用20倍體積冷的0.1mol/L
, 百拇醫(yī)藥
NaHCO3(pH9.0)溶液洗滌。將上述活化的Sepharose4B與等體積0.1mol/L
NaHCO3(pH9.0并在冰箱中預(yù)冷)溶液混合，接著迅速加入α-胰蛋白酶抑制劑(Σ-氨基-N-乙酰-色氨酸甲酯)。抑制劑的最大用量為每毫升Sepharose
4B 65μmol/L。4℃緩慢攪拌約24小時(shí)，而后再用水和緩沖液反復(fù)地洗至沒有游離的抑制劑為止。制得的親和吸附劑在50mmol/L
Tris-HCl緩沖液(pH8.0)中保存?zhèn)溆谩?br/>
⒉分離
親和吸附劑裝柱后用50mmol/L
Tris-HCl(pH8.0)緩沖液平衡(室溫)。樣品溶于同樣緩沖液中并上柱，再應(yīng)用同樣緩沖液淋洗柱子。流速為30-60ml/小時(shí)，直至280nm無光吸收時(shí)停止洗滌，然后改用0.2mol/L醋酸緩沖液(pH3.0)洗脫。
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(五)聚焦層析法
聚焦層析是一種操作簡單、廉價(jià)的層析技術(shù)。它的原理是根據(jù)各種蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)不同進(jìn)行分離的過程，因此本方法具有高分辨、高度濃縮和高度專一等特點(diǎn)。聚焦層析所用的凝膠首先用高pH溶液平衡，然后用多元緩沖液進(jìn)行洗脫，多元緩沖液pH呈梯度下降。
聚焦層析所用凝膠主要有兩種：MONOP和多元緩沖液交換劑(PBE)。其中MONOP是帶孔小珠，孔中被帶正電荷的胺基填充，適用于高效聚焦層析。多元緩沖液交換劑是一種交換凝膠，適用作普通聚焦層析的介質(zhì)。各種凝膠性質(zhì)見表。
表 聚焦層析技術(shù)數(shù)據(jù)
凝膠名稱 | , 百拇醫(yī)藥 pH范圍 | 洗脫 |
MONOP | 11-8 | Pharmalyte 8-10.5 |
PBE | 11-8 | Pharmalyte , 百拇醫(yī)藥 8-10.5 |
MONOP | 9-6 | 多元緩沖液96 |
PBE 94 | 7-4 | 多元緩沖液74 |
PBE94 | , 百拇醫(yī)藥 7-4 | 多元緩沖液74 |
NONOP可制成兩種高效液相柱：MONOP
HR5/5(1ml)，和MONOP
HR5/20(5ml)。使用時(shí)根據(jù)樣品復(fù)雜性選擇相應(yīng)的柱。HR5/5分辨率為pI>0.2，HR5/20
pI>0.02。
多元緩沖液交換劑PBE，屬珠狀交換劑凝膠，有PBE
118(pH11-8)和PBE(pH9-4)。在聚焦層析時(shí)，通過使用不同的洗脫液，可使交換容量發(fā)生改變，并且使pH達(dá)到更廣的范圍。, http://www.www.srpcoatings.com
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