熒光分析法
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《儀器分析法概述》
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熒光分析法
某些物質(zhì)受紫外光或可見光照射激發(fā)后能發(fā)射出比激發(fā)光波長較長的熒光。
(一)熒光的產(chǎn)生一此化學(xué)物質(zhì)能從外界吸收并儲存能量(如光能、化學(xué)能等)而進入激發(fā)態(tài)，當其從激發(fā)態(tài)再回復(fù)到基態(tài)時，過剩的能量可以電磁輻射的形式放射(即發(fā)光)。熒光發(fā)射的特點是：可產(chǎn)生熒光的分子或原子在接受能量后即刻引起發(fā)光；而一旦停止供能，發(fā)光(熒光)現(xiàn)象也隨之在瞬間內(nèi)消失。
可以引起發(fā)熒光的能量種類很多，由光激發(fā)所引起的熒光稱為致熒光。由化學(xué)應(yīng)所引起的稱為化學(xué)熒光，由X線或陰極射線引起的分別稱為X線熒光或陰極射線熒光。熒光免疫技術(shù)一般應(yīng)用致熒光物質(zhì)進行標記。
(二)熒光效率熒光分子不會將全部吸收的光能都轉(zhuǎn)變成熒光，總或多或少地以其他形式釋放。熒光效率是指熒光分子將吸收的光能轉(zhuǎn)變成熒光的百分率，與發(fā)射熒光光量子的數(shù)值成正比。
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熒光效率＝發(fā)射熒光的光量分子數(shù)(熒光強度)/吸收光的光量子數(shù)(激發(fā)光強度)
發(fā)射熒光的光量子數(shù)亦即熒光強度，除受激發(fā)光強度影響外，也與激發(fā)光的波長有關(guān)。各個熒光分子有其特定的吸收光譜和發(fā)射光譜(熒光光譜)，即在某一特定波長處有最大吸收峰和最大發(fā)射峰。選擇激發(fā)光波長量接近于熒光分子的最大吸收峰波長，且測定光波量接近于最大發(fā)射光波峰時，得到的熒光強度也最大。
(三)熒光的猝滅熒光分子的輻射能力在受到激發(fā)光較長時間的照射后會減弱甚至猝滅
，這是由于激發(fā)態(tài)分子的電子不能回復(fù)到基態(tài)，所吸收的能量無法以熒光的形式發(fā)射。一些化合物有天然的熒光猝滅作用而被用作猝滅劑，以消除不需用的熒光。因此熒光物質(zhì)的保存應(yīng)注意避免光(特別是紫外光)的直接照射和與其他化合物的接觸。在熒光抗體技術(shù)中常用一些非熒的色素物質(zhì)如亞甲藍、堿性復(fù)紅。伊文思藍或低濃度的過錳酸鉀、碘溶液等對標本進行得當復(fù)染，以減弱非特異性熒光本質(zhì)，使特異熒光更突出顯示。
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物質(zhì)的激發(fā)光譜和熒光發(fā)射光譜，可以用作該物質(zhì)的定性分析。當激發(fā)光強度、波長、所用溶劑及溫度等條件固定時，物質(zhì)在一定濃度范圍內(nèi)，其發(fā)射光強度與溶液中該物質(zhì)的濃度成正比關(guān)系，可以用作定量分析。熒光分析法的靈敏度一般較紫外分光光度法或比色法為高，濃度太大的溶液會有“自熄滅”作用，以及由于在液面附近溶液會吸收激發(fā)光，使發(fā)射光強度下降，導(dǎo)致發(fā)射光強度與濃度不成正比，故熒光分析法應(yīng)在低濃度溶液中進行。 所用的儀器為熒光計或熒光分光光度計，按各藥品項下的規(guī)定，選定激發(fā)光波長和發(fā)射光波長，并配制對照品溶液和供試品溶液。 由于不易測定絕對熒光強度，故熒光分析法都是在一定條件下，用對照品溶液測得濃度的線性范圍后，再在每次測定前，用一定濃度的對照品溶液校定儀器的靈敏度；然后在相同的條件下，讀取對照品溶液及其試劑空白與供試品溶液及其試劑空白的讀數(shù)，用下式計算供試品濃度： R<[i]>-R<[ib]> C<[i]>＝──×C<[r]> R<[r]>-R<[rb]> 式中 C<[i]>為供試品溶液的濃度； C<[r]>為對照品溶液的濃度； R<[i]>為供試品溶液的讀數(shù)； R<[ib]>為供試品溶液試劑空白的讀數(shù)； R<[r]>為對照品溶液的讀數(shù)； R<[rb]>為對照品溶液試劑空白的讀數(shù)。 因熒光分析法中的濃度與讀數(shù)的線性較窄，故(R<[i]>-R<[ib]>)/(R<[r]>-R<[rb]>)應(yīng)為0.50～2.0；如有超過，應(yīng)在調(diào)節(jié)溶液濃度后再測。 對易被光分解的品種 ,可選擇一種激發(fā)光和發(fā)射光波長與之近似而對光穩(wěn)定的物質(zhì)溶液，例如藍色熒光可用硫酸奎寧的稀硫酸溶液，黃綠色熒光可用熒光素鈉水溶液，紅色熒光可用羅丹明B水溶液等,先與對照品溶液比較測定其讀數(shù)關(guān)系，并在測定供試品溶液時用以代替對照品溶液，以校定儀器的靈敏度。 熒光分析法因靈敏度高，故干擾因素也多。溶劑不純會帶入較大誤差，應(yīng)先作空白檢查，必要時，應(yīng)用玻璃磨口蒸餾器蒸餾后再用。溶液中的懸浮物對光有散射作用，必要時，應(yīng)用垂熔玻璃濾器濾過或用離心法除去。所用的玻璃儀器與測定池等也必須保持高度潔凈。溫度對熒光強度有較大的影響，測定時應(yīng)控制溫度一致。溶液中的溶氧有降低熒光作用，必要時可在測定前通入惰性氣體除氧。
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色譜法
色譜法(又稱層析法)根據(jù)其分離原理可分為：吸附色譜、分配色譜、離子交換色譜與排阻色譜等。吸附色譜法是利用被分離物質(zhì)在吸附劑上被吸附能力的不同，用溶劑或氣體洗脫使組分分離；常用的吸附劑有氧化鋁、硅膠、聚酰胺等有吸附活性的物質(zhì)。分配色譜是利用被分離物質(zhì)在兩相中分配系數(shù)的不同使組分分離；其中一相被涂布或鍵合在固體載體上，稱為固定相,另一相為液體或氣體,稱為流動相。常用的載體有硅膠、硅藻土、硅鎂型吸附劑與纖維素粉等。離子交換色譜是利用被分離物質(zhì)在離子交換樹脂上交換能力的不同使組分分離；常用的有不同強度的陽、陰離子交換樹脂，流動相為水或含有機溶劑的緩沖液。分子排阻色譜法又稱凝膠色譜法，是利用被分離物質(zhì)分子量大小的不同導(dǎo)致在填料上滲透程度不同使組分分離；常用的填料有分子篩、葡聚糖凝膠、微孔聚合物、微孔硅膠或玻璃珠等，根據(jù)固定相和供試品的性質(zhì)選用水或有機溶劑作為流動相。 色譜法又可根據(jù)分離方法分為：紙色譜法、薄層色譜法、柱色譜法、氣相色譜法、高效液相色譜法等。所用溶劑應(yīng)與供試品不起化學(xué)反應(yīng),純度要求較高。分析時的溫度,除氣相色譜法或另有規(guī)定外，系指在室溫操作。分離后各成分的檢出，應(yīng)采用各品種項下所規(guī)定的方法。采用紙色譜法、薄層色譜法或柱色譜法分離有色物質(zhì)時，可根據(jù)其色帶進行區(qū)分，分離無色物質(zhì)時，可在短波(254nm)或長波(365nm)紫外光燈下檢視，其中紙色譜或薄層色譜也可噴以顯色劑使之顯色，或在薄層色譜中用加有熒光物質(zhì)的薄層硅膠，采用熒光猝滅法檢視；柱色譜法、氣相色譜法和高效液相色譜法可用接于色譜柱出口處的各種檢測器檢測；柱色譜法還可分部收集流出液后用適宜方法測定。, 百拇醫(yī)藥
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