細(xì)菌內(nèi)毒素檢查方法
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細(xì)菌內(nèi)毒素檢查方法
(一)概述
本法系利用鱟試劑與細(xì)菌內(nèi)毒素產(chǎn)生凝集的反應(yīng)機(jī)理，以判斷供試品中細(xì)菌內(nèi)毒素的限量是否符合規(guī)定的一種方法。
細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品系自大腸桿菌提取精制得到內(nèi)毒素。以細(xì)菌內(nèi)毒素國際標(biāo)準(zhǔn)品為基準(zhǔn)物，以過協(xié)作標(biāo)定，使標(biāo)準(zhǔn)品單位與國際標(biāo)準(zhǔn)品單位含義一致。用于標(biāo)定細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品和促裁鱟試劑靈敏度。
細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品系以細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品為基準(zhǔn)物進(jìn)行標(biāo)定，確定基重量的相當(dāng)效價(jià)。每1mg工作標(biāo)準(zhǔn)品效價(jià)應(yīng)不小于2EU，不大于50EU，并具備均一性和穩(wěn)定性的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。效價(jià)測定方法如下：每批工作標(biāo)準(zhǔn)品至少取4支樣品，使用同一批號鱟試劑、同1支標(biāo)準(zhǔn)品。每支工作標(biāo)準(zhǔn)品按重量、標(biāo)準(zhǔn)品按單位，分別用內(nèi)毒素檢查用水*稀釋制備一系列2倍稀釋度的內(nèi)毒素溶液，與鱟試劑反應(yīng)，當(dāng)4支工作標(biāo)準(zhǔn)品的反應(yīng)終點(diǎn)的對數(shù)均值的標(biāo)準(zhǔn)差(S)小于0.365時(shí)，計(jì)算4支工作標(biāo)準(zhǔn)品的反應(yīng)終點(diǎn)的幾何平均值(以ng/mg表示)及標(biāo)準(zhǔn)品的反應(yīng)終點(diǎn)值以(以EU/mg表示)，按下式計(jì)算。
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(二)試驗(yàn)準(zhǔn)備
本法所用的器皿需經(jīng)處理，除去可能存在的外源性內(nèi)毒素常用250℃干烤30分鐘或180℃干烤2小時(shí)，也可用其他適宜方法。試驗(yàn)操作過程應(yīng)防止微生物的污染。
試驗(yàn)前需核對使用批號鱟試劑的靈敏度標(biāo)示值，應(yīng)符合規(guī)定。裝量加入配帶的鱟試劑溶劑。溶解后，為鱟試劑溶液，備用。
供試品的稀釋：使用批號鱟試劑的靈敏度標(biāo)示值小于供試品的內(nèi)毒限量時(shí)，按下式計(jì)算，用內(nèi)毒素檢查用水*將供試劑品稀釋后進(jìn)行檢查。
供試品的稀釋倍數(shù)＝X/λ
X：供試品的內(nèi)毒素限量內(nèi)毒素限量(EU/ml)
λ：供試品鱟度劑靈敏度標(biāo)示值(EU/ml)
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(三)檢查
裝有0.1ml鱟試劑溶液的10×75mm試管(或0.1ml/支規(guī)格的鱟試劑原安瓿)4支，其中2支加入0.1ml供試品作為試品管，1支加入2λ內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品0.1ml作為陽性對照管，1支加入配帶的鱟試劑溶液0.1ml作為陰性對照管。將試管輕輕混勻后，封閉管口，垂直放入37±1℃水浴中，保溫60±2分鐘。保溫過程和拿取試管要小心，避免因受到振動造成陰性結(jié)果。
(四)結(jié)果判斷
將試管從水浴中輕輕取出，緩緩倒轉(zhuǎn)1800時(shí)，管內(nèi)凝膠不變形，不從管壁滑脫者為陽性記錄為(+)凝膠不能保持完整并從管壁滑脫者為陰性，記錄為(一)。供試品2管如為(一)，應(yīng)認(rèn)為符合規(guī)定，不再進(jìn)行熱原檢查法(家兔法)試驗(yàn)。如2管均為(+)，應(yīng)認(rèn)為不符合規(guī)定。如2管中1管為(+)，1管為(一)，按述方法另取4支供試品管復(fù)試，4管中有1管為(+)即認(rèn)為不符合規(guī)定。除正文另有規(guī)定外，有符合規(guī)定的供試品應(yīng)再以熱原檢查法(家兔法)試驗(yàn)，并根據(jù)的結(jié)果判定。
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供試品細(xì)菌內(nèi)毒素的限量應(yīng)符合各品種正文下的規(guī)定。
陽性對照為(一)或陰性對照為(+)，試驗(yàn)無效。
附
滅菌注射用水、注射用水、氯化鈉注射液、5%和10%葡萄糖注射液細(xì)菌內(nèi)毒素檢查。
【細(xì)菌內(nèi)毒素】取本品，依法檢查，供試品細(xì)菌內(nèi)毒素的限量不應(yīng)超過1EU/ml。如超過1EU/ml，需經(jīng)熱原檢查法(家兔法)判定。
鱟試劑標(biāo)準(zhǔn)
本品為鱟科動物東方鱟的血液變形細(xì)胞溶解物的無菌冷凍干燥品。
本品含能被微量細(xì)菌內(nèi)毒素激活的凝固酶原，凝固蛋白原其靈敏度以細(xì)菌內(nèi)毒標(biāo)準(zhǔn)品或工作標(biāo)準(zhǔn)品測定，應(yīng)為標(biāo)示量的50%-200%。
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(一)性狀
本品為白色或類白色凍干塊或粉末，在水生生理鹽水中易溶。
(二)鑒別
1.取本品按裝量加水溶解后，加茚三酮試液《中國藥典1990年版》(二部附錄162頁)0.25ml，加熱煮沸1-2分鐘，顯藍(lán)色紫色。
2.取本品按裝量加水溶解后，再加水適當(dāng)稀釋，照分光光度法《中國藥典1990年版》(二部附錄24頁)測定，在270±1nm的波長處有單一吸收峰。
3.取本品按裝量加入內(nèi)毒檢查用水溶解后，吸取0.1ml加入0.1ml細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品或標(biāo)準(zhǔn)品50EU，混勻后，于37℃水浴中放置1小時(shí)，有凝膠形成。
(三)檢查
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干燥失重：取本品約0.1在g
，在66℃減壓干燥至恒得，減失重量不得過5%(中國藥典1990年版二部附錄55頁)。
自身凝集：取本品4支，按裝量加入配帶的鱟試劑溶劑，溶解后，分別從每支取0.1ml，再分別加入配帶的鱟試劑溶劑0.1ml，混勻后，于37±1℃水浴中放置4小時(shí)，不得形成凝膠，若有2管以上形成凝膠，判為不合格；若僅有1管形成凝膠，照同樣方法，另取8支重復(fù)檢查，8支均不得形成凝膠。
緩沖能力：任意取5%、10%葡萄糖注射液，氯化鈉注射液無菌注射用水或注射用水適量，加稀鹽酸調(diào)節(jié)pH使供試品溶液pH值為2.90-3.00，取此溶液適量與等量鱟試劑溶解液混勻，重復(fù)測定，pH值應(yīng)為6.00-8.00。
(四)靈敏度測定
預(yù)測：
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1.取細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品1支，按說明溶解燕稀稀釋成1→8等比系列稀釋液。
2.取同一批鱟試劑若干支，分別按標(biāo)示量加入配帶的試劑溶劑制成鱟試劑溶液。取10×75mm試管若干支，分別加入0.1
ml鱟試劑溶液，加入內(nèi)毒素稀釋液0.1
ml ，每一稀釋液最少作2管，同時(shí)作2管陰性對照。輕輕振動上述試管混勻內(nèi)容物，封閉管口，置37±1℃水浴中。保溫60±2分鐘觀察結(jié)果，確定本批鱟試劑靈敏范圍，2管陰性對照不得出現(xiàn)陽性結(jié)果。
測定：根據(jù)預(yù)測得到的靈敏范圍，將細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品以1→2等比稀釋，選擇能出現(xiàn)陽性和陰性結(jié)果的4個邊疆稀釋液，每一稀釋液作4管，且其最高濃度的4管應(yīng)均為陽性最低溶液的4管應(yīng)均為陰性，同上述操作，記錄反應(yīng)結(jié)果，計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)差(s)
, http://www.www.srpcoatings.com X為4組反應(yīng)終點(diǎn)的數(shù)對值,n為4
當(dāng)s<0.365時(shí)，按下式計(jì)算本批鱟試劑靈敏度(λ)
當(dāng)s<0.365時(shí)測定無效，應(yīng)檢查出現(xiàn)差異原因，并重新測定。
(五)用途
用于細(xì)菌內(nèi)毒素檢查。
(六)規(guī)格
(1)0.1ml；(2)0.5ml。
(七)貯藏
遮光，在冷處保存。有效期暫定1年。
*系指其內(nèi)毒素含量不超過0.006EU/ml的注射用水。, http://www.www.srpcoatings.com
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