熱原檢查法
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《制劑檢查法概述》
制劑檢查法 | |||
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| 溶液顏色檢查法 | 澄清度檢查法 | 易炭化物檢查法 | 酸敗度檢查法 |
| 熾灼殘?jiān)鼨z查法 | 大分子右旋糖酐檢查法 | 崩解時(shí)限檢查法 | 含量均勻度檢查法 |
| 熱原檢查法 | 微生物限度檢查法 | 無菌檢查法 | 相對(duì)密度測(cè)定法 |
| 餾程測(cè)定法 | 溶出度測(cè)定法 | 水分測(cè)定法 | 氧瓶燃燒法 |
| 乙醇量測(cè)定法 | 羥丙氧基測(cè)定法 | 甲氧基測(cè)定法 | 干燥失重測(cè)定法 |
| 氮測(cè)定法 | 熔點(diǎn)測(cè)定法 | 凝點(diǎn)測(cè)定法 | 電泳法 |
| 有機(jī)溶劑殘留量測(cè)定法 | 細(xì)菌內(nèi)毒素檢查方法 | ||
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熱原檢查法
本法系將一定劑量的供試品，靜脈注入家兔體內(nèi)，在規(guī)定時(shí)間內(nèi)，觀察家兔體溫升高的情況，以判定供試品中所含熱原的限度是否符合規(guī)定。
供試用家兔
供試用的家兔應(yīng)健康無傷，體重1.7～3.0kg，雌兔應(yīng)無孕。預(yù)測(cè)體溫前7日即應(yīng)用同一飼料飼養(yǎng),在此期間內(nèi)，體重應(yīng)不減輕，精神、食欲、排泄等不得有異�，F(xiàn)象。未經(jīng)使用于熱原檢查的家兔；或供試品判定為符合規(guī)定，但組內(nèi)升溫達(dá)0.6℃
的家兔；或供試品判定為不符合規(guī)定,但其組內(nèi)家兔平均升溫未達(dá)0.8℃，且已休息兩周以上的家兔；或三周內(nèi)未曾使用的家兔，均應(yīng)在檢查供試品前3～7日內(nèi)預(yù)測(cè)體溫，進(jìn)行挑選。挑選試驗(yàn)的條件與檢查供試品時(shí)相同，僅不注射藥液，每隔1小時(shí)測(cè)量體溫1次，共測(cè)4次，4次體溫均在38.0～39.6℃的范圍內(nèi),且最高最低體溫的差數(shù)不超過0.4℃的家兔，方可供熱原檢查用。用于熱原檢查后的家兔，如供試品判定為符合規(guī)定，至少應(yīng)休息2日方可供第2次檢查用。如供試品判定為不符合規(guī)定,且其組內(nèi)家兔平均升溫達(dá)0.8℃或更高時(shí)，則組內(nèi)全部家兔不再使用。每一家兔的使用次數(shù)，用于一般藥品的檢查，不應(yīng)超過10次。
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試驗(yàn)前的準(zhǔn)備 在作熱原檢查前1～2日，供試用家兔應(yīng)盡可能處于同一溫度的環(huán)境中，實(shí)驗(yàn)室和飼養(yǎng)室的溫度相差不得大于5℃，實(shí)驗(yàn)室的溫度應(yīng)在17～28℃,在試驗(yàn)全部過程中，應(yīng)注意室溫變化不得大于3℃，應(yīng)避免噪音干擾。家兔在試驗(yàn)前至少1小時(shí)開始停止給食并置于適宜的裝置中,直至試驗(yàn)完畢。家兔體溫應(yīng)使用精密度為±0.1℃的肛溫計(jì)，或其他同樣精確的測(cè)溫裝置。肛溫計(jì)插入肛門的深度和時(shí)間各兔應(yīng)相同，深度一般約6cm，時(shí)間不得少于1分半鐘，每隔30～60分鐘測(cè)量體溫1次，一般測(cè)量2次，兩次體溫之差不得超過0.2℃,以此兩次體溫的平均值作為該兔的正常體溫。當(dāng)日使用的家兔，正常體溫應(yīng)在38.0～39.6℃的范圍內(nèi)，且各兔間正常體溫之差不得超過1℃。
試驗(yàn)用的注射器、針頭及一切和供試品溶液接觸的器皿,應(yīng)置烘箱中用250℃加熱30分鐘或用180℃加熱2小時(shí)，也可用其他適宜的方法除去熱原。
檢查法 取適用的家兔3只,測(cè)定其正常體溫后15分鐘以內(nèi)，自耳靜脈緩緩注入規(guī)定劑量并溫?zé)嶂良s38℃的供試品溶液，然后每隔1小時(shí)按前法測(cè)量其體溫1次,共測(cè)3次,以3次體溫中最高的一次減去正常體溫，即為該兔體溫的升高度數(shù)。如3只家兔中有1只體溫升高0.6℃或0.6℃以上,或3只家兔體溫升高均低于0.6℃,但升高的總數(shù)達(dá)1.4℃或1.4℃以上，應(yīng)另取5只家兔復(fù)試，檢查方法同上。
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結(jié)果判斷 在初試3只家兔中，體溫升高均低于0.6℃，并且3只家兔體溫升高總數(shù)低于1.4℃；或在復(fù)試的5只家兔中，體溫升高0.6℃或0.6℃以上的兔數(shù)僅有1只，并且初試、復(fù)試合并8只家兔的體溫升高總數(shù)為3.5℃或3.5℃以下,均認(rèn)為供試品的熱原檢查符合規(guī)定。
在初試3只家兔中，體溫升高0.6℃或0.6℃以上的兔數(shù)超過1只；或在復(fù)試的5只家兔中，體溫升高0.6℃或0.6℃以上的兔數(shù)超過1只；或在初試、復(fù)試合并8只家兔的體溫升高總數(shù)超過3.5℃，均認(rèn)為供試品的熱原檢查不符合規(guī)定。
微生物限度檢查法
微生物限度檢查法系指非規(guī)定滅菌制劑及其原、輔料受到微生物污染程度的一種檢查方法。包括染菌量及控制菌的檢查。 供試品應(yīng)隨機(jī)抽樣。如遇有異�；蚩梢傻臉悠�，須選取有疑義的樣品。一般抽樣量為檢驗(yàn)用量(2個(gè)以上最小包裝單位)的3倍量。供試品在檢驗(yàn)前不得開啟，在檢查前及檢查中應(yīng)防止供試品污染菌受損、致死或繁殖。凡能從藥品、瓶口(外蓋內(nèi)側(cè)及瓶口周圍)外觀看出發(fā)霉、變質(zhì)的藥品，可直接判為不合格，無需再抽樣檢查。 檢查的全部過程均應(yīng)嚴(yán)格遵守?zé)o菌操作，嚴(yán)防再污染。 除另有規(guī)定外，本檢查法中細(xì)菌培養(yǎng)溫度為30～35℃，霉菌、酵母菌培養(yǎng)溫度為25℃～28℃，控制菌培養(yǎng)溫度為36±1℃ 。 細(xì)菌、霉菌(酵母菌)計(jì)數(shù)和控制菌檢查，均應(yīng)作對(duì)照試驗(yàn)。 檢驗(yàn)結(jié)果的報(bào)告以1g、1ml或10cm<2>為單位。
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培養(yǎng)基及其制備方法：
1 、營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基與營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基 見無菌檢查法(附錄ⅩⅢ B)
2 、虎紅瓊脂培養(yǎng)基 胨 5g 虎紅(四氯四碘熒光素) 0.0133g 葡萄糖 10g (或0.133%虎紅溶液10ml) 磷酸二氫鉀(KH2PO4) 1g 瓊脂 15～20g 硫酸鎂(MgSO4.7H2O) 0.5g 水 1000ml 除葡萄糖、虎紅外，取上述成分，混合，加熱溶化后，濾過，加入葡萄糖、虎紅，分裝，115℃滅菌30分鐘。
3 、酵母浸出粉胨葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(YPD) 胨 10g 瓊脂 15～20g 酵母浸出粉 5g 水 1000ml 葡萄糖 20g 除葡萄糖外，取上述成分，混合，加熱融化后，濾過，加入葡萄糖，分裝，115℃ 滅菌15分鐘。
4 、膽鹽乳糖培養(yǎng)基(BL) 胨 20g 牛膽鹽 1.3g 乳糖 5g (或去氧膽酸鈉0.25g) 氯化鈉 5g 水 100ml 磷酸氫二鉀(K2HPO4) 4.0g 磷酸二氫鉀(KH2PO4) 1.3g 除乳糖、牛膽鹽外，取上述成分,混合,加熱使溶解,調(diào)節(jié)pH值使滅菌后為7.4±0.2,煮沸，濾清，加入乳糖、牛膽鹽，分裝，115℃滅菌30分鐘。
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5 、曙紅美亞甲藍(lán)瓊脂培養(yǎng)基(EMB) 營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基 100ml 2%曙紅溶液 2ml 20%乳糖溶液5ml 0.5%亞甲藍(lán)溶液 1.3～1.6ml 取營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，加熱融化后，冷至60℃,按無菌操作加入滅菌的其它三種溶液,搖勻，傾注平皿。
6 、麥康凱瓊脂培養(yǎng)基(MaCC) 胨 20g 1%中性紅溶液 2.5ml 乳糖 10g 瓊脂 15～20g 牛膽鹽 5g 水 1000ml 氯化鈉 5g 除乳糖、1%中性紅溶液、牛膽鹽及瓊脂外、取上述成分,混合，加熱使溶解，調(diào)節(jié)pH值使滅菌后為7.2±0.2，加入瓊脂，加熱融化后，再加入其余各成分，搖勻，分裝，115℃滅菌30分鐘，冷至約60℃，傾注平皿。
7 、三糖鐵瓊脂培養(yǎng)基(TSI) 胨 20g 硫酸亞鐵 0.2g 牛肉浸出粉 5g 硫代硫酸鈉 0.2g 乳糖 10g 0.2%酚紅溶液 12.5ml 蔗糖 10g 瓊脂 12～15g 葡萄糖 1g 水 1000ml 氯化鈉 5g 除三糖、0.2%酚紅溶液、瓊脂外，取上述成分，混合，加熱使溶解,調(diào)節(jié)pH值使滅菌后為7.3±0.1，加入瓊脂，加熱融化后，濾過，再加入其余成分，搖勻，分裝,115℃滅菌30分鐘，制成高底層(2～3cm)短斜面。
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8 、四硫磺酸鈉亮綠增菌液(TTB) 胨 5g 硫代硫酸鈉 30g 牛膽鹽 1g 水 1000ml 碳酸鈣 10g 取上述成分，混合，微溫使溶解，121℃滅菌20分鐘。 臨用前，取上述培養(yǎng)基，每10ml中加入碘溶液(取碘6g與碘化鉀5g，溶于20ml水中)0.2ml和0.1%亮綠溶液0.1ml ，混勻。
9 、沙門氏、志賀氏菌屬瓊脂培養(yǎng)基(SS) 胨 5g 硫代硫酸鈉 8.5g 牛肉浸出粉 5g 1%中性紅溶液 2.5ml 乳糖 10g 0.1%亮綠溶液 0.33ml 牛膽鹽 8.5g 瓊脂 20g 枸櫞酚鈉 8.5g 水 1000ml 枸櫞酸鐵銨 1g 除糖、指示劑、瓊脂外，取上述成分混合，加熱使溶解，調(diào)節(jié)pH值使滅菌后為7.2 ±0.1，濾過，加入瓊脂，加熱融化后，121℃滅菌20分鐘，再加入其余成分，搖勻，冷至約60℃，傾注平皿。
10、膽鹽硫乳瓊脂培養(yǎng)基(DHL) 胨 20g 枸櫞酸鈉 1g 牛肉浸出粉 3g 枸櫞酸鐵銨 1g 乳糖 10g 1%中性紅溶液 3ml 蔗糖 10g 瓊脂 18～20g 去氧膽酸鈉 1g 水 1000ml 硫代硫酸鈉 2.3g 除糖、1%中性紅溶液及瓊脂外,取上述成分混合，微溫使溶解，調(diào)節(jié)pH值使滅菌后為7.2±0.1，加入瓊脂,加熱融化后,再加入其余成分，搖勻，冷至約60℃，傾注平皿。
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11、十六烷三甲基溴化銨瓊脂培養(yǎng)基 胨 10g 牛肉浸出粉 3g 氯化鈉 5g 瓊脂 15～20g 十六烷三甲基溴化銨 0.3g 水 1000ml 除瓊脂外，取上述成分混合，微溫使溶解，調(diào)節(jié)pH值使滅菌后為7.5±0.1，加入瓊脂，加熱熔化后，分裝，121℃滅菌20分鐘，冷至約60℃，傾注平皿。
12、亞碲酸鹽肉湯培養(yǎng)基 臨用前，取滅菌的營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，每100ml中加入新配制的1%亞碲酸鈉(鉀)溶液0.2ml，混勻，即得。
13、卵黃高鹽瓊脂培養(yǎng)基 胨 6g 10%氯化鈉卵黃液 100ml 牛肉浸出粉 1.8g 瓊脂 23g 氯化鈉 30g 水 650ml 除10%氯化鈉卵黃液外，取上述成分混合，微溫使溶解,調(diào)節(jié)pH值使滅菌后為7.6±0.1。121℃滅菌20分鐘，待冷至約60℃，以無菌操作加入10%氯化鈉卵黃液,充分搖勻,傾注平皿。 10%氯化鈉卵黃液的制備 取新鮮雞蛋一個(gè)，以無菌操作取出卵黃，放入10%滅菌氯化鈉溶液100ml中，充分振搖，即得。
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14、甘露醇高鹽瓊脂培養(yǎng)基 胨 10g 1%酚紅溶液 2.5ml 牛肉浸出粉 1g 瓊脂 15～20g 甘露醇 10g 水 1000ml 氯化鈉 75g 除甘露醇、1%酚紅溶液及瓊脂外,取上述成分混合，微溫使溶解，調(diào)節(jié)pH值使滅菌后為7.4±0.2，加入瓊脂，加熱融化后，濾過，分裝，115℃滅菌30分鐘，冷至約60℃,傾注平皿。
15、蛋白胨水培養(yǎng)基 胰蛋白胨 10g 水 1000ml 氯化鈉 5g 取上述成分混合，加熱融化，調(diào)節(jié)pH值使滅菌后為7.3±0.1，分裝于小試管中,121℃滅菌20分鐘。
16、磷酸鹽葡萄糖胨水培養(yǎng)基 胨 7g 葡萄糖 5g 磷酸氫二鉀(K2HPO4) 3.8g 水 1000ml 取上述成分混合，微溫使溶解，調(diào)節(jié)pH值使滅菌后為7.3±0.1，分裝于小試管中，121℃滅菌15分鐘。
17、枸櫞酸鹽培養(yǎng)基 氯化鈉 5g 枸櫞酸鈉(無水) 2g 硫酸鎂(MgSO4·7H2O) 0.2g 溴麝香草酚藍(lán)指示液 20ml 磷酸氫二鉀(K2HPO4) 0.8g 瓊脂 15～20g 磷酸二氫銨(NH4H2PO4) 1g 水 1000ml 除溴麝香草酚藍(lán)和瓊脂外，取上述成分，混微溫使溶解,調(diào)節(jié)pH值使滅菌后為6.9±0.1，加入瓊脂，加熱融化，加入指示劑混勻。分裝于小試管中，121℃滅菌15分鐘，置成斜面。 注：所用瓊脂應(yīng)不含游離糖，用前用水浸泡沖洗。
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18、糖、醇發(fā)酵培養(yǎng)基 基礎(chǔ)液 胨 10g 0.5%酸性復(fù)紅指示劑 10ml 糖、醇 0.5% (或溴麝香草酚藍(lán)指示液6ml ) 氯化鈉 5g 水 1000ml 取胨和氯化鈉加入水中，微溫使溶解，調(diào)節(jié)pH值使滅菌后為7.4,加入指示劑混勻,分裝每瓶100ml，121℃滅菌15分鐘。 配制葡萄糖發(fā)酵管時(shí)，于100ml基礎(chǔ)液中加入0.5g葡萄糖,分裝于含杜氏管(Durham)的小試管中。121℃滅菌15分鐘,配制其它糖醇發(fā)酵管時(shí),將各種糖醇分別配成10%溶液,與基礎(chǔ)液同時(shí)于121℃滅菌15分鐘。以無菌操作將5ml糖醇溶液加入100ml基礎(chǔ)液內(nèi),分裝于滅菌小試管中。 注：糖醇溶液亦可采用薄膜過濾法除菌。
19、5%乳糖發(fā)酵管 胨 0.2g 乳糖 5g 氯化鈉 0.3g 溴麝香草酚藍(lán)指示液 0.6ml 磷酸氫二鈉(Na2·HPO4·12H2O) 0.2g 水 1000ml 除乳糖和指示劑外，取上述成分，混合，微溫使溶解，調(diào)節(jié)pH值使滅菌后為7.4,加入乳糖及指示劑，混勻，分裝于含杜氏管的滅菌小試管中，115℃滅菌15分鐘。
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20、尿素瓊脂培養(yǎng)基 胨 1g 葡萄糖 1g 氯化鈉 5g 20%尿素溶液 1000ml 磷酸二氫鉀(KH2PO4) 2g 瓊脂 20g 0.2%酚紅溶液 6ml 水 1000ml 除尿素和瓊脂外，取上述成分，混合，調(diào)節(jié)pH值使滅菌后為7.2±0.1，加入瓊脂，加熱溶化并分裝于錐形瓶，121℃滅菌20分鐘。冷至50～55℃,加入經(jīng)薄膜過濾除菌的尿素溶液，混勻。尿素的最終濃度為2%，分裝于滅菌試管中，置成斜面。
21、氰化鉀培養(yǎng)基 胨 3g 磷酸氫二鈉(Na2HPO4) 5.64g 氯化鈉 5g 氰化鉀試液 磷酸二氫鉀(KH2PO4) 0.225g 水 1000ml 除氰化鉀試液外，取上述成分，混合,調(diào)節(jié)pH值使滅菌后為7.5±0.1，121℃滅菌20分鐘，冷卻后，每100ml培養(yǎng)基中加入氰化鉀試液1.5ml,分裝于12×100mm滅菌試管內(nèi)，每管4ml，立即用滅菌橡皮塞塞緊，置4℃保存。同時(shí)，以不加氰化鉀試液的培養(yǎng)基作為對(duì)照培養(yǎng)基，分裝于滅菌試管中。
, 百拇醫(yī)藥 22、賴氨酸脫羧酶試驗(yàn)培養(yǎng)基 胨 5g 1.6%溴甲酚紫乙醇溶液 1ml 酵母浸出粉 3g L-賴氨酸(DL-賴氨酸) 0.5(1g)/100ml 葡萄糖 1g 水 1000ml 除賴氨酸外，取上述成分，混合，加熱溶解后分裝，每瓶100ml。加入L-賴氨酸0.5g(DL-賴氨酸1g)調(diào)節(jié)pH值使滅菌后為6.8,同時(shí)以不加賴氨酸培養(yǎng)基作為對(duì)照。分裝于滅菌的小試管內(nèi)，每管1ml并滴加一層液體石蠟，121℃滅菌10分鐘。
23、綠膿菌素(pyocyanin)測(cè)定用培養(yǎng)基(PDP瓊脂) 胨 20g 甘油 10ml 氯化鎂(無水) 1.4g 瓊脂 18～20g 硫酸鉀(無水) 10g 水 1000ml 取胨、氯化鎂和硫酸鉀加入水中，微溫使深解。調(diào)節(jié)pH值使滅菌后為7.3±0.1，加入甘油及瓊脂，加熱溶解，121℃滅菌20分鐘，置成斜面。
24、明膠培養(yǎng)基 胨 5g 明膠 120g 牛肉浸出粉 3g 水 1000ml 取上述成分加入水中，浸泡約20分鐘，隨時(shí)攪拌，加熱使溶解，調(diào)節(jié)pH值使滅菌后為7.3±0.1，分裝于小試管中，115℃滅菌20分鐘。 25、硝酸鹽胨水培養(yǎng)基 胨 10g 亞硝酸鈉 0.5g 酵母浸出粉 3g 水 1000ml 硝酸鉀 2g 取胨及酵母浸出粉加入水中，微溫使溶解，調(diào)節(jié)pH值使滅菌后為7.3±0.1，加入硝酸鉀和亞硝酸鈉溶解，混勻。分裝于含杜氏管的小試管中，115℃滅菌20分鐘。
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試藥
牛肉浸出粉 “Lab-lemco”powder 本品為米色粉末在水中溶解。
牛膽鹽 Bile Salt Ox 本品為淡黃色或黃棕色粉末；味苦而甜；具吸濕性。在水和醇中易溶。
沙黃(番紅)Safranine T [C20H19ClN4=350.85] 本品為紅棕色粉末，現(xiàn)紅光；為堿基性染料。 在水中溶解，在乙醇中易溶。
虎紅(四氯四碘熒光素鈉鹽)Rose bengal [C20H2Cl4I4Na2O5=1017.6] 本品為棕紅色粉末。 在水中溶解，溶液呈紫色，無熒光；在硫酸中溶解，溶液為棕色。
枸櫞酸鐵銨 Ammonium ferric citrate [C12H22FeN3)O14=488.16] 本品為棕紅色或綠色鱗片或粉末；易潮解，見光易還原成亞鐵。 在水中溶解，在醇和醚中不溶。
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胰蛋白胨 Tryptone 本品為米黃色粉末。在水中溶解。
酚紅 Phenol Red [C19H14O5S＝354.38] 本品為深紅色結(jié)晶性粉末。 在乙醇中溶解，在水、三氯甲烷和醚中不溶。
DL-賴氨酸 DL-Lysine [C6H14N2O2＝146.19] 本品為白色結(jié)晶；極易潮解。在水中溶解。
L-賴氨酸 L-Lysine [C6H14N2O2=146.19] 本品為白色針狀結(jié)晶；在空氣中易吸收二氧化碳。 在水中易溶解，在醇中微溶解，在醚中不溶。
酸性復(fù)紅 Fuchsin Acid [C20H17N3Na2O9S3=585.54] 本品為綠色有金屬光澤的顆料或深紅色粉末。 在水中溶解，在醇中不溶。
磷酸二氫銨 Ammonium Phosphate Monobasic [NH4H2PO4=115.03] 本品為無色結(jié)晶或白色結(jié)晶性粉末。在水中溶解，在乙醇中不溶。
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試液
二鹽酸二甲基對(duì)苯二胺試液 取二鹽酸二甲基對(duì)苯二胺0.1g，加水10ml，即得。需新鮮少量配制，于冷處避光保存，如試液變成紅褐色，不可使用。
甲基紅試液 取甲基紅0.1g，加入乙醇300ml，使溶解后，加水至500ml，即得。 無菌對(duì)氨基苯甲酸試液 取對(duì)氨基苯甲酸0.1g，加入含有10ml水的帶塞試管中，121℃滅菌20分鐘。
亞碲酸鈉(鉀)試液 取亞碲酸鈉(鉀)0.1g，加新鮮煮沸后冷至50℃的水10ml使溶解。
沙黃(番紅)試液 取沙黃(番紅)0.25g,加乙醇10ml，使完全溶解后,加水至100ml。 無菌尿素試液 取尿素20.0g，加水100ml，充分搖勻使溶解，濾過除菌�；蛟谀蛩卦囈褐屑喻晗悴莘�1.0g ，于室溫放置1～2天，即得。配制時(shí)需無菌操作。
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亞甲藍(lán)試液 取亞甲藍(lán)0.5g，加水溶解使成100ml。 虎紅試液 取虎紅0.1g，加水使溶解成75ml。
無菌枸櫞酸鈉-氯化鈉試液 取枸櫞酸鈉0.5g，加0.9%氯化鈉溶液10ml，121℃滅菌20分鐘。
草酸銨試液 取草酸銨1.0g，加水使溶解成100ml。 亮綠試液 取亮綠0.1g，加水100ml使溶解。
結(jié)晶紫試液 取結(jié)晶紫1.0g，加乙醇20ml使溶解，加1%草酸銨水溶液80ml,混勻。靜置48小時(shí)使用，置密閉棕色瓶中儲(chǔ)存。
氫氧化鉀試液 取氫氧化鉀40.0g，加水使溶解成100ml。
鹽酸試液 取鹽酸8.4ml，加水稀釋至100ml。
α-萘酚的乙醇試液 取α-萘酚6.0g，加無水乙醇使溶解成100ml。 氰化鉀試液 取氰化鉀0.5g，加水使溶解成100ml。
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氯化三苯四氮唑試液 取氯化三苯四氮唑0.1g，加水使溶解10ml。
碘試液 取碘化鉀2.0g，加水3～5ml使溶解，加入碘片1.0g，使全部溶解后，加水稀釋至300ml 。置密閉棕色瓶?jī)?chǔ)存。
曙紅鈉試液 取曙紅鈉20g，加水使溶解成100ml。
靛基質(zhì)試液 取對(duì)二甲氨基苯甲醛5.0g，加入戊醇(或丁醇)75ml，充分振搖，使完全溶解后，再取濃鹽酸25ml徐徐滴入，加滴邊振搖，以免驟熱導(dǎo)致溶液色澤變深；或取對(duì)二甲氨基苯甲醛1.0g，加入乙醇95ml，充分振搖，使完全溶解后，取鹽酸20ml徐徐滴入。 稀釋劑 0.9%無菌氯化鈉溶液 取氯化鈉9.0g，加水使溶解成1000ml，121℃滅菌20分鐘。 無菌吐溫80-氯化鈉溶液 取吐溫80 1ml，加0.9%氯化鈉溶液使成100ml,121℃滅菌20分鐘。
無菌磷酸鹽緩沖液(pH7.2) 取磷酸氫二鈉25.8g與磷酸二氫鈉4.4g，加水稀釋至 1000ml，121℃滅菌20分鐘。
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指示液 中性紅指示液 取中性紅1.0g，細(xì)研，加乙醇60ml使溶解，再加水至100ml。 變色范圍 pH6.8～8.0(紅→黃)。
酚紅指示液 取酚紅1.0g，加1mol/L氫氧化鈉2.82ml使溶解,再加水稀釋至100ml。 變色范圍 pH6.8～8.4(黃→紅)。
溴甲酚紫指示液 取溴甲酚紫1.6g，加乙醇使溶解成100ml。 變色范圍 pH5.2～6.8(黃→紫)。
溴麝香草酚藍(lán)指示液 取溴麝香草酚藍(lán)0.4g,加1mol/L氫氧化鈉溶液0.64ml使溶解,再加水稀釋至100ml。 變色范圍 pH6.0～7.6(黃→藍(lán))。
酸性復(fù)紅指示液(Andrade 指示劑) 取酸性復(fù)紅0.5g，加水100ml,使溶解，再逐漸加入1mol/L氫氧化鈉溶液16ml，每加1滴均應(yīng)將溶液充分搖勻后再加第二滴,直至溶液呈草黃色；于沸水內(nèi)保持15分鐘，再靜置2小時(shí)，濾過，即得。 變色范圍 pH 6.0～7.4(黃→紅)。
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供試品的檢驗(yàn)量
每批供試品檢驗(yàn)量一般為10g 或10ml 。化學(xué)藥膜劑為100cm2,貴重的或微量包裝的供試品檢驗(yàn)量可以酌減，但口服藥品不得少于3g，外用藥品不得少于5g。 供試品均須取自2 個(gè)以上的包裝單位，大蜜丸、膜劑除須取自2 個(gè)以上包裝單位外，應(yīng)取自4 丸(片)以上樣品。
供試液的制備
按供試品的理化特性與生物學(xué)特性可采取適宜的方法制成供試液。
1 、液體供試品 取供試品10ml，加入90ml稀釋劑中，混勻，作為供試液。油劑可加適量吐溫80；氣霧劑以適宜方法使拋射劑導(dǎo)出后，加入適量稀釋劑，混勻，吸取相當(dāng)10g或10ml供試品，再稀釋成100ml作供試液；合劑(系指含王漿或蜂蜜者，下同)與滴眼劑可用供試品作為供試液。
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2 、固體、半固體或粘稠液 供試品稱取供試品10g,置0.9%無菌氯化鈉溶液100ml中，用勻漿儀或其它適宜方法，混勻后，作為供試液。在制備過程中，必要時(shí)可加適量吐溫80，并適當(dāng)加溫，但不應(yīng)超過45℃。 (1)非水溶性供試品 稱取供試品10g(10ml)，加入滅菌吐溫80 30ml、滅菌液體石蠟10ml與0.9%無菌氯化鈉溶60ml(或50ml)，同置勻漿儀中，乳化,或其它適發(fā)法乳化，作供試液。在制過程中，必要時(shí)可適當(dāng)加溫，但不應(yīng)超過45℃。 (2)不溶于水的膜劑供試品 取規(guī)定量，剪碎，加稀釋劑100ml(必要時(shí)可增加稀釋劑)，浸泡，振搖，作為供試液。 (3)腸溶膠囊(片)供試品 稱取供試品10g，置含無菌磷酸鹽緩沖液(pH6.8)100ml的錐形瓶?jī)?nèi)。于45℃水浴中，保溫、振搖、使溶解，作為供試液。
3 含抑菌成分供試品 供試品如干擾控制菌檢驗(yàn)，按以下方法處理后，依法檢查。
(1) 稀釋法 將供試液種入較大量的培養(yǎng)基中，使該供試液稀釋至不具抑菌作用的濃度。
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(2) 離心沉淀集菌法 取規(guī)定量的供試液，離心(3000轉(zhuǎn))30分鐘，棄去上清液，留底部集菌液約2ml ，再稀釋成原規(guī)定量的供試液。如有不溶性藥渣，可先離心(500轉(zhuǎn))5分鐘，取全部上層液，再行集菌處理。
(3) 薄膜過濾法 取規(guī)定量的供試液，置稀釋劑100ml中,搖勻，以無菌操作加入裝有直徑約50mm、孔徑不大于0.45±0.02μm微孔濾膜的薄膜過濾器內(nèi)，減壓抽干后,用稀釋劑沖洗濾膜3次，每次50～100ml，取出濾膜備檢。
(4) 中和法 凡含磺胺、汞、砷類或防腐劑的供試品，可用相應(yīng)的試劑鈍化活性因子，中和毒性后制成供試液。 對(duì)照用菌液
控制菌檢查均應(yīng)作相應(yīng)已知菌的對(duì)照試驗(yàn)。
對(duì)照菌株為大腸桿菌[CMCC(B)44102]、沙門氏菌〔CMCC(B)50094〕、綠膿桿菌〔CMCC(B)10104〕及金黃色葡萄球菌〔CMCC(B) 26003〕。 取相應(yīng)菌株的營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基斜面新鮮培養(yǎng)物1白金耳,接種至營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基內(nèi)，培養(yǎng)18～20小時(shí)后，稀釋至1:10<6>。 對(duì)照菌的加入量為50～100 個(gè)。
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檢查法
1 、細(xì)菌、霉菌與酵母菌計(jì)數(shù) (1) 平皿菌落計(jì)數(shù)法 取均勻供試液,進(jìn)一步稀釋成1:10<2> 、1:10<3>等適宜的稀釋度。分別取連續(xù)三級(jí)10倍稀釋的供試液各1ml,置直徑約90mm的平皿中，再注入約45℃的培養(yǎng)基約15ml，混勻，待凝固后，倒置培養(yǎng)，每稀釋度應(yīng)作2～3個(gè)平皿。 細(xì)菌計(jì)數(shù)用營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，霉菌計(jì)數(shù)用虎紅瓊脂培養(yǎng)基，酵母菌計(jì)數(shù)用酵母浸出粉胨葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，合劑用虎紅瓊脂培養(yǎng)基與酵母浸出粉胨葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基。 菌數(shù)測(cè)定空白對(duì)照試驗(yàn) 取供試驗(yàn)用的稀釋劑各1ml，置4個(gè)無菌平皿中，分別按細(xì)菌、霉菌計(jì)數(shù)用的培養(yǎng)基制備平板、培養(yǎng)、檢查，不得長(zhǎng)菌。 細(xì)菌培養(yǎng)時(shí)間為48小時(shí),分別在24及48小時(shí)點(diǎn)計(jì)菌落數(shù),一般以48小時(shí)菌落數(shù)為準(zhǔn)。霉菌、酵母培養(yǎng)時(shí)間為72小時(shí)，分別在48及72小時(shí)點(diǎn)計(jì)菌落數(shù)，一般以72小時(shí)菌落數(shù)為準(zhǔn)。 營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板一般點(diǎn)計(jì)細(xì)菌菌落數(shù)，虎紅瓊脂平板一般點(diǎn)計(jì)霉菌菌落數(shù)，在特殊情況下，前者同時(shí)點(diǎn)計(jì)霉菌、酵母菌菌落數(shù)，后者同時(shí)點(diǎn)計(jì)細(xì)菌菌落數(shù)。酵母浸出粉胨葡萄糖瓊脂平板僅點(diǎn)計(jì)酵母菌菌落數(shù)。液體制劑同時(shí)點(diǎn)計(jì)霉菌菌落數(shù)及酵母菌菌落數(shù)。含蜂蜜及王漿的合劑的霉菌、酵母菌菌落數(shù)分別測(cè)定，合并計(jì)數(shù)。菌落如蔓延生長(zhǎng)成片，不宜計(jì)數(shù)。 點(diǎn)計(jì)后，計(jì)算各稀釋級(jí)的平均菌落數(shù)，按菌數(shù)報(bào)告規(guī)則報(bào)告菌數(shù)。 菌數(shù)報(bào)告規(guī)則 細(xì)菌宜選取平均菌落數(shù)在30～300之間的稀釋級(jí),霉菌宜選取平均菌落數(shù)在30～100之間的稀釋級(jí)作為報(bào)告菌數(shù)計(jì)算的依據(jù)。如有1個(gè)稀釋級(jí)在30～300(30～100)之間時(shí),將該稀釋級(jí)的菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報(bào)告；如同時(shí)有2個(gè)稀釋級(jí)在30～300(30～100)之間時(shí)，按下式計(jì)算兩級(jí)比值。 高稀釋級(jí)的平均菌落數(shù)×稀釋倍數(shù) 比值＝──低稀釋級(jí)的平均菌落數(shù)×稀釋倍數(shù) 當(dāng)比值≤2時(shí)，以兩稀釋級(jí)的均值報(bào)告，當(dāng)比值>2時(shí)，以低稀釋級(jí)平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報(bào)告；如同時(shí)有3個(gè)稀釋級(jí)的平均菌落數(shù)均在30～300之間時(shí),以后2個(gè)稀釋級(jí)計(jì)算級(jí)間比值報(bào)告；如各稀釋級(jí)的平均菌落數(shù)均不在30～300之間，以最接近30或300的稀釋級(jí)平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報(bào)告；如各稀釋級(jí)平均菌落數(shù)均在300(100)以上，按最高稀釋級(jí)菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報(bào)告；如各稀釋級(jí)平均菌落數(shù)均小于30時(shí)，一般按最低稀釋級(jí)的菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報(bào)告。如當(dāng)1:10(或1:100 )稀釋級(jí)平均菌落數(shù)等于或大于原液(或1:10稀釋級(jí))時(shí)，應(yīng)以培養(yǎng)基稀釋法測(cè)定，按測(cè)定結(jié)果報(bào)告菌數(shù)。
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(2) 培養(yǎng)基稀釋法 取供試液(原液或1:10供試液)3份，每份各1ml,分別注入5個(gè)平皿內(nèi)(每皿各0.2ml)。每1個(gè)平皿傾注營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基約15ml，混勻，凝固后，倒置培養(yǎng)，計(jì)數(shù)。每1ml注入的5個(gè)平板點(diǎn)計(jì)的菌落數(shù)之和，即為每1ml的菌落數(shù)，共得3組數(shù)據(jù)。以3份供試液菌落數(shù)的平均值乘以稀釋倍數(shù)報(bào)告。 如各稀釋級(jí)平板均無菌落生長(zhǎng)，或僅最低稀釋級(jí)平均菌落數(shù)小于1時(shí),則報(bào)告菌數(shù)為小于10個(gè)。
2 、控制菌檢查 除另有規(guī)定外，取供試液10ml(相當(dāng)供試品1g、1ml 、10cm<2>),直接或處理后接種，經(jīng)增菌分離培養(yǎng)后，進(jìn)行革蘭氏染色、生化試驗(yàn)與血清凝集試驗(yàn)項(xiàng)檢查。
(1)
大腸桿菌( 取膽鹽乳糖培養(yǎng)基3份，每份各100ml,2份分別加入規(guī)定量的供試液，其中1份加入對(duì)照菌液作陽性對(duì)照，第3份加入與供試液等量的稀釋劑作空白對(duì)照。培養(yǎng)18～24小時(shí)(必要可延至48小時(shí))�？瞻讓�(duì)照應(yīng)無菌生長(zhǎng)。其余2份培養(yǎng)物劃線接種于曙紅亞甲藍(lán)瓊脂平板或麥康凱瓊脂平板,培養(yǎng)18～24小時(shí)。當(dāng)陽性對(duì)照的平板呈陽性菌落時(shí),供試品的平板無菌落生長(zhǎng),或有菌落但不同于表1所列的特征,可判為未檢出大腸桿菌。 表 1 大腸桿菌菌落形態(tài)特征───────┬────────────────── 培養(yǎng)基 │ 菌 落 形 態(tài)───────┼──────────────────曙紅亞甲藍(lán)瓊脂│呈紫黑色、淺紫色、藍(lán)紫色或粉紅色， │菌落中心深紫色或無明顯暗色中心，圓 │形，稍凸起，邊緣整齊，表面光滑，濕 │潤(rùn)，常有金屬光澤。───────┼────────────────── 麥康凱瓊脂 │鮮桃紅色或微紅色，菌落中心深桃紅色， │圓形，扁平，邊緣整齊，表面光滑，濕潤(rùn)。───────┴────────────────── 如生長(zhǎng)的菌落與表1所列特征相符或疑似者,應(yīng)挑選2～3個(gè)菌落分別接種于營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基斜面，培養(yǎng)18小時(shí)，作以下檢查： 革蘭氏染色 取上述斜面培養(yǎng)物，涂片，固定。以結(jié)晶紫染液染色1分鐘,水洗，革蘭氏碘液媒染1分鐘，水洗，濾紙吸干余水。以乙醇脫色20～30秒鐘,水洗。滴加沙黃染液復(fù)染1分鐘，待干后鏡檢。 乳糖發(fā)酵試驗(yàn) 取上述斜面培養(yǎng)物，接種于乳糖發(fā)酵管，培養(yǎng)24～48小時(shí)，觀察產(chǎn)酸(培養(yǎng)基變色)，產(chǎn)氣(杜氏管內(nèi)有氣泡)。 靛基質(zhì)試驗(yàn) 取上述斜面培養(yǎng)物，接種于蛋白胨水培養(yǎng)基中，培養(yǎng)48±2小時(shí),沿管壁加入對(duì)靛基質(zhì)試液0.3～0.5ml，液面呈玫瑰紅色為陽性，呈試劑本色為陰性。 甲基紅試驗(yàn) 取上述斜面培養(yǎng)物，接種于磷酸鹽葡萄糖胨水培養(yǎng)基中,培養(yǎng)48±2小時(shí)，于每1ml培養(yǎng)液中加入甲基紅指示劑1滴，立即觀察，呈鮮紅色或桔紅色為陽性，呈黃色為陰性。 乙酰甲基甲醇生成試驗(yàn)(V-P 試驗(yàn)) 取上述斜面培養(yǎng)物，接種于磷酸鹽葡萄糖胨水培養(yǎng)基，培養(yǎng)48±2小時(shí)，于每2ml培養(yǎng)液中加入α-萘酚乙醇液1ml，混勻，再加40%氫氧化鉀溶液0.4ml，充分振搖，出現(xiàn)紅色為陽性。加試劑4小時(shí)內(nèi)，如出現(xiàn)紅色亦應(yīng)判為陽性，無紅色反應(yīng)為陰性。 枸櫞酸鹽利用試驗(yàn) 取上述斜面培養(yǎng)物，接種于枸櫞酸鹽培養(yǎng)基的斜面上，培養(yǎng)48±2小時(shí),培養(yǎng)基斜面有菌苔生長(zhǎng)，培養(yǎng)基由綠色變?yōu)樗{(lán)色時(shí)為陽性，培養(yǎng)基顏色無改變時(shí)為陰性。 當(dāng)空白對(duì)照試驗(yàn)呈陰性，供試品檢查為革蘭氏陰性無芽孢桿菌；乳糖發(fā)酵產(chǎn)酸產(chǎn)氣或產(chǎn)酸不產(chǎn)氣；IMViC 試驗(yàn)為陽性、陽性、陰性、陰性或陰性、陽性、陰性、陰性，判為檢出大腸桿菌。對(duì)可疑反應(yīng)的菌株，應(yīng)重新分離培養(yǎng)后，再作生化試驗(yàn)證實(shí)。
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(2) 沙門氏菌 取營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基3份，每份各100ml,2份分別加入規(guī)定量的供試液，其中1份加入對(duì)照菌液作陽性對(duì)照，第3份加入與供試液等量的稀釋劑作空白對(duì)照。培養(yǎng)18～24小時(shí)，空白對(duì)照應(yīng)無菌生長(zhǎng)。取其余2份培養(yǎng)液各1ml，分別接種于四硫磺酸鈉亮綠培養(yǎng)基10ml中，培養(yǎng)18～24小時(shí)。分別劃線接種于膽鹽硫乳瓊脂(或沙門氏、志賀氏菌屬瓊脂)培養(yǎng)基和麥康凱瓊脂(或曙紅亞甲藍(lán)瓊脂)培養(yǎng)基的平板上，培養(yǎng)18～24小時(shí)或延至40～48小時(shí)。當(dāng)陽性對(duì)照的平板呈現(xiàn)陽性菌落時(shí)，供試品的平板無菌落生長(zhǎng)，或有菌落但不同于表2所列特征時(shí)，可判為未檢出沙門氏菌。 如供試品平板生長(zhǎng)的菌落特征有與表2所列菌落形態(tài)特征相符或疑似者，均應(yīng)挑選2～3個(gè)菌落分別接種于三糖鐵瓊脂培養(yǎng)斜面上，陽性對(duì)照同時(shí)接種,培養(yǎng)18～24小時(shí)后，陽性對(duì)照的斜面應(yīng)為紅色，底層為黃色，硫化氫陽性，而供試品疑似菌斜面未見紅色、底層未見黃色，可判為未檢出沙門氏菌。否則，應(yīng)繼續(xù)做革蘭氏染色、生化試驗(yàn)、動(dòng)力檢查與血清凝集試驗(yàn)。
表2 沙門氏菌菌落形態(tài)特征───────┬────────────────────────────
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培 養(yǎng) 基 │ 菌 落 形 態(tài)───────┼────────────────────────────膽鹽硫乳瓊脂 │無色至淺橙色，半透明，菌落中心帶黑色或全部黑色或無黑色。───────┼────────────────────────────沙門氏、志賀 │無色至淡紅色，半透明或不透明，菌落中心有時(shí)帶黑褐色。氏菌屬瓊脂 │───────┼────────────────────────────曙紅亞甲藍(lán)瓊脂│無色至淺橙色，透明或半透明，光滑濕潤(rùn)的圓形菌落。───────┼────────────────────────────麥康凱瓊脂
│無色至淺橙色，透明或半透明，菌落中心有時(shí)為暗色。───────┴──────────────────────────── 革蘭氏染色 照大腸桿菌項(xiàng)下方法操作，鏡檢。 靛基質(zhì)試驗(yàn) 照大腸桿菌項(xiàng)下操作并判斷結(jié)果。 尿素酶試驗(yàn) 取疑似菌斜面培養(yǎng)物接種于尿素瓊脂培養(yǎng)基斜面上，培養(yǎng)24小時(shí)，斜面變?yōu)榧t色為陽性，不變色為陰性。 氰化鉀試驗(yàn) 取培養(yǎng)20～24小時(shí)的疑似菌株?duì)I養(yǎng)肉湯培養(yǎng)液，分別用白金耳沾取1環(huán)，接種至對(duì)照培養(yǎng)基及氰化鉀培養(yǎng)基內(nèi)，立即以橡膠塞塞緊，培養(yǎng)24～48小時(shí)，對(duì)照管應(yīng)有菌生長(zhǎng)，試驗(yàn)管有菌生長(zhǎng)者為陽性，無菌生長(zhǎng)為陰性。 賴氨酸脫羧酶試驗(yàn) 取疑似菌斜面培養(yǎng)物分別接種賴氨酸脫羧酶培養(yǎng)基及對(duì)照培養(yǎng)基上。培養(yǎng)24～48小時(shí)，對(duì)照管應(yīng)為黃色，試驗(yàn)管呈紫色為陽性，呈黃色為陰性。 動(dòng)力檢查 取疑似菌斜面培養(yǎng)物穿刺接種于半固體營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基管中，培養(yǎng)24小時(shí)，細(xì)菌沿穿刺線外周擴(kuò)散生長(zhǎng)，為動(dòng)力陽性，否則為陰性。陰性培養(yǎng)物，應(yīng)在室溫保留2～3天后，再判斷。 血清凝集試驗(yàn) 在潔凈載玻片一端，以白金耳沾取沙門氏菌屬A～F“0” 多價(jià)血清2～3環(huán)，再取斜面上部的培養(yǎng)物少許，與血清混合，將玻片前后側(cè)動(dòng),如出現(xiàn)凝集現(xiàn)象,應(yīng)以0.9%氯化鈉溶液與同株培養(yǎng)物作對(duì)照試驗(yàn),無凝集現(xiàn)象時(shí)判為血清凝集陽性。時(shí)有反應(yīng)遲緩，需將玻片與濕棉球置平皿內(nèi)，約過20分鐘，再觀察。仍未出現(xiàn)凝集時(shí)，應(yīng)取斜面培養(yǎng)物，置含少量0.9%氯化鈉溶液的試管中，制成濃菌懸液，在100℃水浴中保溫30分鐘，待冷，再作凝集試驗(yàn)。如出現(xiàn)凝集，應(yīng)判為陽性，否則為陰性。 上述各項(xiàng)試驗(yàn)反應(yīng)，一般應(yīng)為硫化氫陽性(或陰性)，靛基質(zhì)陰性，尿素酶陰性,氰化鉀陰性，賴氨酸脫羧酶陽性，動(dòng)力檢查陽性，A～F“0” 多價(jià)血清凝集試驗(yàn)陽性。各鑒定結(jié)果按表3判定。
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表3 沙門氏菌檢查結(jié)果判定──┬─────────────────┬────┬───────── 序│ 血清凝集試驗(yàn) │ │ │ (A～F“0” 血清) │ │ ├──┬───────┬──────┤生化試驗(yàn)│ 結(jié) 果 │凝集│ 100℃30分鐘 │0.9%氯化鈉 │ │ 號(hào)│反應(yīng)│ 凝集反應(yīng) │溶液對(duì)照 │ │──┼──┼───────┼──────┼────┼───────── 1 │陽性│ 陽 性 │ 陰 性 │ 符 合│檢出沙門氏菌 2 │陰性│ 陽 性 │ 陰 性 │ 符 合│檢出沙門氏菌 3 │陰性│ 陰 性 │ │ 不符合│未檢出沙門氏菌──┴──┴───────┴──────┴────┴─────────
上述各項(xiàng)試驗(yàn)任何一項(xiàng)不符合或有可疑反應(yīng)的培養(yǎng)物,均應(yīng)進(jìn)一步鑒定后作出結(jié)論。
(3) 綠膿桿菌
取膽鹽乳糖培養(yǎng)基3份，每份各100ml，2份分別加入規(guī)定量的供試液，其中1份加入對(duì)照菌液作為陽性對(duì)照,第3份加入與供試液等量的稀釋劑作空白對(duì)照。培養(yǎng)18～24小時(shí)，空白對(duì)照應(yīng)無菌生長(zhǎng),其余2份培養(yǎng)液劃線接種于十六烷三甲基溴化銨瓊脂培養(yǎng)基平板上，培養(yǎng)18～24小時(shí)。當(dāng)陽性對(duì)照的平板呈現(xiàn)陽性菌落時(shí)，供試品的平板無菌落或無疑似菌落生長(zhǎng)，可判為未檢出綠膿桿菌。 綠膿桿菌典型菌落呈扁平、無定形、周邊擴(kuò)散，表面濕潤(rùn)，灰白色，周圍時(shí)有藍(lán)綠色素?cái)U(kuò)散。如生長(zhǎng)菌落具有上述特征或疑似者，應(yīng)挑選2～3個(gè)菌落，分別接種營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基斜面上，培養(yǎng)18～24小時(shí)，取培養(yǎng)物革蘭氏染色，并作氧化酶試驗(yàn)。 氧化酶試驗(yàn) 取潔凈濾紙片置于平皿內(nèi)，用無菌玻璃棒取營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基斜面培養(yǎng)物涂于濾紙片上，再滴加新配制的1%二甲基對(duì)苯二胺鹽酸鹽試液,在30秒內(nèi)呈粉紅色逐漸變?yōu)樽霞t色為氧化酶試驗(yàn)陽性。否則為陰性。 如證實(shí)為非革蘭氏陰性無芽孢桿菌或氧化酶試驗(yàn)陰性，均可判為未檢出綠膿桿菌。否則，應(yīng)進(jìn)行綠膿菌素試驗(yàn)。 綠膿菌素試驗(yàn) 取上述瓊脂斜面培養(yǎng)物，接種于綠膿菌素測(cè)定用培養(yǎng)基斜面上，培養(yǎng)24小時(shí)后，在試管內(nèi)加氯仿3～5ml,攪碎培養(yǎng)基并充分振搖。靜置片刻,將氯仿移至另一試管中，加入1mol/L鹽酸溶液約1ml,振搖后，靜置片刻，如在鹽酸溶液層內(nèi)出現(xiàn)粉紅色，即為綠膿菌素陽性。試驗(yàn)同時(shí)應(yīng)有空白對(duì)照試驗(yàn)。 當(dāng)空白對(duì)照試驗(yàn)呈陰性時(shí)，供試品檢查為革蘭氏陰性桿菌、氧化酶試驗(yàn)陽性及綠膿菌素陽性、可判定為檢出綠膿桿菌。 綠膿菌素陰性的培養(yǎng)物，應(yīng)繼續(xù)以下試驗(yàn)。 硝酸鹽還原產(chǎn)氣試驗(yàn) 取營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基斜面培養(yǎng)物,接種于硝酸鹽胨水培養(yǎng)基中,培養(yǎng)24小時(shí)，如在培養(yǎng)基的杜氏管中有氣體產(chǎn)生，即為陽性。 42℃生長(zhǎng)試驗(yàn) 營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基斜面培養(yǎng)物于0.9%無菌氯化鈉溶液中,制成菌懸液,再將菌懸液接種于營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基斜面上，立即置41±1℃水浴中培養(yǎng)24～48小時(shí),有菌苔生長(zhǎng)者為陽性；否則為陰性。 明膠液化試驗(yàn) 以接種針沾取營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基斜面培養(yǎng)物，穿刺于明膠培養(yǎng)基內(nèi)，培養(yǎng)24小時(shí)，取出置冰箱內(nèi)10～30分鐘。如培養(yǎng)基仍呈溶液狀，為陽性。 當(dāng)革蘭氏陰性桿菌，氧化酶試驗(yàn)陽性，綠膿菌素試驗(yàn)為陰性，其硝酸鹽還原產(chǎn)氣試驗(yàn)、42℃生長(zhǎng)試驗(yàn)及明膠液化試驗(yàn)均為陽性時(shí)，應(yīng)判為檢查綠膿桿菌。
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(4) 金黃色葡萄球菌
取亞碲酸鈉肉湯(或營(yíng)養(yǎng)肉湯)培養(yǎng)基3份，每份各100ml，2份分別加入規(guī)定量的供試液，其中1份加入對(duì)照菌液作為陽性對(duì)照，第3份加入與供試液等量的稀釋劑作為空白對(duì)照。均培養(yǎng)18～24小時(shí)(必要時(shí)可延至48小時(shí))�？瞻讓�(duì)照應(yīng)無菌生長(zhǎng)。取其余2份培養(yǎng)液劃線接種于卵黃高鹽瓊脂培養(yǎng)基平板上或甘露醇高鹽瓊脂培養(yǎng)基平板上，培養(yǎng)24～72小時(shí)。當(dāng)陽性對(duì)照的平板呈現(xiàn)陽性菌落時(shí)，供試品的平板如無菌落生長(zhǎng)，或有菌落但不同于表4所列特征,可判為未檢出金黃色葡萄球菌。
表4 金黃色葡萄球菌菌落形態(tài)特征─────┬───────────────── 培養(yǎng)基 │ 菌 落 形 態(tài) ─────┼─────────────────卵黃高鹽 │金黃色、圓形凸起，邊緣整齊，外圍有瓊脂 │卵磷脂分解的乳濁圈，菌落直徑1～2mm─────┼─────────────────甘露醇高鹽│金黃色，圓形凸起，邊緣整齊，外圍有瓊脂 │黃色環(huán)，菌落直徑約0.7～1mm ─────┴─────────────────
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如有菌落生長(zhǎng)并與表4所列特征相符或疑似時(shí),應(yīng)挑選2～3個(gè)菌落，分別接種于營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基斜面上，培養(yǎng)18～24小時(shí)，取其培養(yǎng)物革蘭氏染色，并作血漿凝固酶試驗(yàn)。
血漿凝固酶試驗(yàn) 取滅菌小試管3支，各加入血漿①-無菌水(1:1)0.5ml，1支加入被檢菌株的營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)液(或濃菌懸液)0.5ml,其余2支作對(duì)照管；1支加入金黃色葡萄球菌的營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)液或菌懸液0.5ml作陽性對(duì)照;另1支加入營(yíng)養(yǎng)肉湯或0.9%氯化鈉溶0.5ml作空白對(duì)照。將3管同時(shí)培養(yǎng)。3小時(shí)后開始檢查,以后適當(dāng)時(shí)間逐次觀察直至24小時(shí)。空白對(duì)照管的血漿流動(dòng)自如，陽性對(duì)照管血漿凝固，試驗(yàn)管血漿凝固者為陽性；陽性對(duì)照管和空白對(duì)照管任何一管不符合要求時(shí)，應(yīng)另制備血漿，重新試驗(yàn)。 當(dāng)空白對(duì)照和陽性對(duì)照符合要求，供試品的菌株為革蘭氏陽性球菌、血漿凝固酶試驗(yàn)陽性，判定為檢出金黃色葡萄球菌。
結(jié)果判斷
, 百拇醫(yī)藥 細(xì)菌菌落數(shù)、霉菌(酵母菌)菌落數(shù)、控制菌三項(xiàng)均符合該品種微生物限度項(xiàng)下規(guī)定，應(yīng)判供試品合格；其中任何一項(xiàng)不符合該品種項(xiàng)下規(guī)定，應(yīng)判供試品不合格。 細(xì)菌菌落數(shù)、霉菌(酵母菌)菌落數(shù)第一次測(cè)定超過該品種項(xiàng)下微生物限度規(guī)定時(shí)，應(yīng)從同一批號(hào)樣品中隨機(jī)抽樣，復(fù)試兩次，以三次結(jié)果平均值報(bào)告。 眼科用藥的霉菌和酵母菌菌落數(shù)復(fù)試報(bào)告，須以二次復(fù)試結(jié)果均不得長(zhǎng)菌，方可判為供試品合格。 如發(fā)現(xiàn)營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基平板生長(zhǎng)霉菌(酵母菌)菌落數(shù)或虎紅瓊脂培養(yǎng)基平板上生長(zhǎng)細(xì)菌菌落數(shù)超過該品種項(xiàng)下微生物限度規(guī)定時(shí)，應(yīng)判為供試品不合格。 各類制劑檢出控制菌或其他致病菌時(shí)，按一次檢出結(jié)果為準(zhǔn)，不再抽樣復(fù)試，即應(yīng)判該供試品不合格。 ① 血漿的制備 以無菌注射器吸取滅菌的含5%枸櫞酸鈉的0.9%氯化鈉溶液1ml,用無菌操作采取家兔(或羊、人)血9ml,輕輕混勻數(shù)分鐘。待血液不凝固時(shí)，徐徐放入滅菌離心管中，離心，分離血漿，用滅菌吸管取血漿移至滅菌試管中，置冰箱內(nèi)備用。臨用前必須用已知血漿凝固酶試驗(yàn)陽性的金黃色葡萄球菌測(cè)試，證明血漿合格后，方可用于試驗(yàn)。, http://www.www.srpcoatings.com
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