無菌檢查法
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《制劑檢查法概述》
制劑檢查法 | |||
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無菌檢查法
無菌檢查法系指檢查藥品與敷料是否無菌的一種方法。 無菌檢查的全部過程應嚴格遵守無菌操作，防止微生物的污染。 生物制品應按衛(wèi)生部《生物制品制造及檢定規(guī)程》中有關無菌檢查的規(guī)定辦理。
培養(yǎng)基及其制備方法
1.需氣菌、厭氣菌培養(yǎng)基(硫乙醇酸鹽液體培養(yǎng)基) 酪胨(胰酶水解) 15g 氯化鈉 2.5g 葡萄糖 5g 新鮮配制的0.1%刃天青溶液 1.0ml L-胱氨酸 0.5g (或新鮮配制的0.2%亞甲藍溶液0.5ml) 硫乙醇酸鈉 0.5g 瓊脂 0.5～0.7g (或硫乙醇酸0.3ml) 水 1000ml 酵母浸出粉 5g 除葡萄糖和刃天青溶液外，取上述成分加入水內，微溫溶解后，調節(jié)pH為弱堿性，煮沸，濾清，按量加入葡萄糖和刃天青溶液，搖勻，調節(jié)pH值使滅菌后為7.1±0.2，分裝，115℃滅菌30分鐘。 在無菌檢查接種前, 培養(yǎng)基指示劑氧化層的顏色不得超過培養(yǎng)基深度約1/5。否則,須經(jīng)水浴煮沸加熱, 只限加熱一次。
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2.霉菌培養(yǎng)基 胨 5g
磷酸氫二鉀(K2HPO4) 1g 酵母浸出粉 2g 硫酸鎂(MgSO4·7H2O) 0.5g 葡萄糖 20g 蒸餾水 1000ml 除葡萄糖外，取上述成分加入水內，微溫溶解后，調節(jié)pH約6.8，煮沸,加葡萄糖溶解后，搖勻，濾清，調節(jié)pH值使滅菌后為6.4±0.2，分裝，115℃滅菌20分鐘。
3.選擇性培養(yǎng)基 (1) 對氨基苯甲酸培養(yǎng)基(用于磺胺類藥物的無菌檢查) 照上述需氣菌、厭氣菌培養(yǎng)基及霉菌培養(yǎng)基的處方及制法，各加對氨基苯甲酸0.125g，溶解后搖勻，分裝，115℃滅菌30分鐘。
(2) 吐溫培養(yǎng)基(用于油劑藥品的無菌檢查) 照上述需氣菌、厭氣菌培養(yǎng)基及霉菌培養(yǎng)基的處方及制法，各加10ml的吐溫80，搖勻后，分裝， 115℃滅菌30分鐘。
4.營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基 胨 10g 肉浸液 1000ml 氯化鈉 5g 取胨與氯化鈉，加入肉浸液內，微溫溶解后，調節(jié)pH為弱堿性，煮沸，濾清，調節(jié)pH值使滅菌后為7.2±0.2，分裝，115℃滅菌30分鐘。
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5.營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基 照上述營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基的處方及制法，加入15～20g瓊脂，調節(jié)pH值使滅菌后為7.2±0.2，分裝，115℃滅菌30分鐘。
6.0.5%葡萄糖肉湯培養(yǎng)基 胨 10g 葡萄糖 5g 氯化鈉 5g 肉浸液 1000ml 取胨與氯化鈉加入肉浸液內，微溫溶解后，調節(jié)pH為弱堿性，煮沸，加葡萄糖溶解后，搖勻，濾清，調節(jié)pH值使滅菌后為7.2±0.2， 分裝，115℃滅菌30分鐘。
7.霉菌瓊脂培養(yǎng)基 照霉菌培養(yǎng)基的處方及制法，加入15～20g瓊脂，調節(jié)pH值使滅菌后為6.4±0.2,分裝, 115℃滅菌20分鐘，趁熱斜放使凝固成斜面。 上述培養(yǎng)基分別按15ml與40ml分裝于試管中，裝量約為試管高度的2/5，在115℃滅菌30分鐘。細菌培養(yǎng)基經(jīng)30～35℃培養(yǎng)48小時，霉菌培養(yǎng)基經(jīng)20～25℃培養(yǎng)72小時后，應無菌生長。 培養(yǎng)基的質量應通過靈敏度檢查。
培養(yǎng)基靈敏度檢查法
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1.菌種 (1)藤黃微球菌[CMCC(B)28001] (2)生孢梭菌[CMCC(B)64941] (3)白色念珠菌[CMCC(F)98001]
2.操作 取藤黃微球菌的營養(yǎng)瓊脂斜面和白色念珠菌的霉菌瓊脂斜面的新鮮培養(yǎng)物分別用0.9%滅菌氯化鈉溶液制成均勻的菌懸液；將生孢梭菌的不含瓊脂需氣菌、厭 氣菌培養(yǎng)基的新鮮培養(yǎng)物，吸入滅菌離心管，離心，棄去上清液,菌體用0.9%滅菌氯化鈉溶液制成均勻菌懸液。分別取上述菌懸液用0.9%滅菌氯化鈉溶液稀釋至與細菌濁度 標準管相同的濃度, 然后, 作10倍系列稀釋并計數(shù)。
將藤黃微球菌1:10<5>～1:10<8>菌液、生孢梭菌1:10<6>～1:10<9>菌液、白色念珠菌1:10<5>～1:10<8>菌液各1ml,分別接種至9ml試驗培養(yǎng)基中,每個稀釋度至少接種3管,以未接種的培養(yǎng)基管作對照，細菌試驗管置30～35℃培養(yǎng)3天,白色念珠菌試驗管置20～25℃培養(yǎng)5天。逐日記錄結果。 3.結果判定 以接種后培養(yǎng)基管數(shù)的2/3以上呈現(xiàn)生長的最高稀釋度為該培養(yǎng)基的靈敏度(且接種菌量均應小于10個),三次試驗中,以兩次達到的最高靈敏度為判定標準。 需氣菌、厭氣菌培養(yǎng)基靈敏度為藤黃微球菌1:10<6>；生孢梭菌1:10<7>；霉菌培養(yǎng)基靈敏度為白色念珠菌1:10<6>。
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【附注】 肉浸液制備法 取新鮮牛肉，除去肌腱及脂肪，切細，絞碎后，每1000g加水3000ml，充分拌勻，在2～10℃浸泡20～24小時，煮沸1小時，濾過，壓干肉渣，補足液量，分裝，121℃滅菌30分鐘，置冷暗處備用。也可用牛肉浸出粉3g,加水1000ml，配成溶液代替。
對照用菌液 1.金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)菌液 取金黃色葡萄球菌[CMCC(B)26003]的營養(yǎng)瓊脂斜面新鮮培養(yǎng)物1白金耳，接種至需氣菌、厭氣菌培養(yǎng)基內， 在30～35℃培養(yǎng)16～18小時后，用0.9%滅菌氯化鈉溶液稀釋成1:10<6>。 2.生孢梭菌(Clostridium sporogenes)菌液 取生孢梭菌[CMCC(B)64941]的需氣菌、厭氣菌培養(yǎng)基新鮮培養(yǎng)物1白金耳,再接種至相同培養(yǎng)基內，在30～35℃培養(yǎng)18～24小時，用0.9%滅菌氯化鈉溶液稀釋至1:10<6>。3.白色念珠菌(Candida albicans)菌液 取白色念珠菌[CMCC(F)98001]的霉菌瓊脂培養(yǎng)基斜面新鮮培養(yǎng)物1白金耳,接種至霉菌培養(yǎng)基內，在20～25℃培養(yǎng)24小時后，用0.9%滅菌氯化鈉溶液稀釋至1:10<5>。
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檢查法
1. 直接接種法
(1) 供試品如為注射液、供角膜創(chuàng)傷及手術用的滴眼劑或滅菌溶液, 任取供試品2支(瓶)以上，用適當消毒液清潔供試品容器的外表面后,以無菌操作吸取規(guī)定接種量的供試品溶液，分別接種于需氣菌、厭氣菌培養(yǎng)基5管，其中1管接種對照用菌液1ml，供作陽性對照；取1支需氣菌、厭氣菌培養(yǎng)基管作陰性對照，另接種于霉菌培養(yǎng)基2管，供試品溶液的每管接種量與培養(yǎng)基的分裝量,應根據(jù)供試品的裝量，按下列規(guī)定取用： 供試品裝量 每管接種量 培養(yǎng)基分裝量 2ml或2ml以下 0.5ml 15ml 2ml以上至20ml 1.0ml 15ml 20ml以上 5.0ml 40ml 接種后輕輕搖動,使勻。需氣菌、厭氣菌培養(yǎng)基在30～35℃培養(yǎng)5日, 霉菌培養(yǎng)基在20～25℃培養(yǎng)7日，抗生素類藥品均培養(yǎng)7日，放射性藥品培養(yǎng)5～7日。培養(yǎng)期間應逐日檢查是否有菌生長(陽性對照在24小時內應有細菌生長)；如在加入供試品溶液后，培養(yǎng)基出現(xiàn)渾濁或沉淀,經(jīng)培養(yǎng)后不能從外觀上判斷時，可取該培養(yǎng)液轉種入另1支相同的培養(yǎng)基中或斜面培養(yǎng)基上，培養(yǎng)48～72小時后，觀察是否再現(xiàn)渾濁或在斜面上有無菌落生長，并在轉種的同時，取培養(yǎng)液少量，涂片制成染色標本，用顯微鏡觀察是否有菌生長。
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(2) 供試品如為注射用滅菌粉末或無菌凍干品，照該藥品項下的規(guī)定或按該藥品劑量項下的溶劑用量，加入滅菌水或0.9%滅菌氯化鈉溶液,使內容物溶解成均勻的供試品溶液，取規(guī)定接種量的供試品溶液，接種于上述培養(yǎng)基中。
(3) 供試品如為供直接分裝成注射用無菌粉末的原料藥，按各藥品項下的規(guī)定制成溶液，依法接種于培養(yǎng)基中。
(4) 供試品如為外科敷料，取供試品2個包裝,以無菌操作拆開包裝, 于不同部位剪取約1cm×3cm的樣品，分別接種于40ml培養(yǎng)基中。
(5) 供試品如有抑菌作用或含有抑菌物質時，可選用適宜的培養(yǎng)基，或種入較大量的培養(yǎng)基中，使該供試品稀釋至不具有抑菌使用的濃度；或照下述“薄膜過濾法”處理并接種于培養(yǎng)基中。
(6) 供試品如為抗生素藥品,取該品種正文中最大規(guī)格量的供試品不少于2瓶(支)。原料藥按制劑規(guī)格項下，取最大規(guī)格量2份,分別加入足夠使青霉素滅活的無菌青霉素酶溶液適量，搖勻，分別等量接種于每管裝量為40ml的培養(yǎng)基中。
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(7) 供試品如為放射性藥品，取供試品1瓶(支)，以每管接種量為0.2ml，接種于每管裝量為7.5ml的培養(yǎng)基中。
2. 薄膜過濾法
(1)供試品如為抗生素藥品，取該品種正文中最大規(guī)格量的供試品不少于2瓶(支)。原料藥按制劑規(guī)格項下取最大規(guī)格量2份, 分別按該藥品項下規(guī)定的方法處理后, 加入0.9%滅菌氯化鈉溶液至少100ml或其他適宜的溶劑中, 搖勻, 以無菌操作加入裝有直徑約50mm、孔徑不大于0.45±0.02μm微孔濾膜的薄膜過濾器內,減壓抽干后, 用0.9%滅菌氯化鈉溶液或其他適宜的溶劑沖洗濾膜3次,每次至少100ml；取出濾膜，分成4片，取3片分別放在3管各40ml需氣菌、厭氣菌培養(yǎng)基中，其中1管接種對照用菌液1ml,供作陽性對照，另1片放在霉菌培養(yǎng)基管中。取1支需氣菌、厭氣菌培養(yǎng)基管作陰性對照。
(2) 供試品如為抗厭氧菌藥品, 取規(guī)定量的供試品, 按上述方法經(jīng)薄膜過濾器處理后，取出濾膜，分成4片，其中3片放在3管需氣菌、厭氣菌培養(yǎng)基管中, 1管接種生孢梭菌對照用菌液1ml，供作陽性對照。另1片放在霉菌培養(yǎng)基管中。 取1支需氣菌、厭氣菌培養(yǎng)基管作陰性對照。
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(3) 供試品如為抗真菌藥品，取規(guī)定量的供試品,按上述方法經(jīng)薄膜過濾器處理后,取出濾膜，分成4片,取2片分別放在2管需氣菌、厭氣菌培養(yǎng)基管中；2片分別放在2管霉菌培養(yǎng)基管中，其中1管接種白色念珠菌對照用菌液1ml,供作陽性對照。取1支需氣菌、厭氣菌培養(yǎng)基管作陰性對照。 結果判斷 當陽性對照管顯渾濁并確有細菌生長，陰性對照管陰性時, 可根據(jù)觀察所得的結果判定：如需氣菌、厭氣菌及霉菌培養(yǎng)管均為澄清或雖顯渾濁但經(jīng)證明并非有菌生長,均應判為供試品合格；如需氣菌、厭氣菌及霉菌培養(yǎng)管中任何1管顯渾濁并確證為有菌生長，應重新取樣，分別依法倍量復試，除陽性對照管外，其他各管均不得有菌生長，否則應判為供試品不合格。
相對密度測定法
相對密度系指在共同特定的條件下,某物質的密度與水的密度之比。除另有規(guī)定外,溫度為20℃。 某些藥品具有一定的相對密度。純度變更，相對密度亦隨同改變。測定相對密度，可以區(qū)別或檢查藥品的純雜程度。 液體藥品的相對密度，一般用比重瓶(如圖1或圖2)進行測定；測定易揮發(fā)液體的相對密度時，可用韋氏比重秤進行測定。 比重瓶法 (1)取潔凈、干燥并精密稱定重量的比重瓶(如圖1)，裝滿供試品(溫度應低于20℃或各藥品項下規(guī)定的溫度)后，裝上溫度計(瓶中應無氣泡)，置20℃(或各藥品項下規(guī)定的溫度)的水浴中放置10～20分鐘，使內容物的溫度達到20℃(或各藥品項下規(guī)定的溫度)，用濾紙除去溢出側管的液體，立即蓋上罩。然后將比重瓶自水浴中取出，再用濾紙將比重瓶的外面擦干，精密稱定，減去比重瓶的重量，求得供試品的重量后，將供試品傾去，洗凈比重瓶，裝滿新沸過的冷水，再照上法測得同一溫度時水的重量，按下式計算，即得。 供試品重量 供試品的相對密度＝──水重量 (2)取潔凈、干燥并精密稱定重量的比重瓶(如圖2)，裝滿供試品(溫度應低于20℃或各藥品項下規(guī)定的溫度)后，置20℃(或各藥品項下規(guī)定的溫度)的水浴中，放置10～20分鐘，插入中心有毛細孔的瓶塞，使過多的液體從塞孔溢出，并用濾紙將瓶塞頂端擦干，照上述(1)法，自“然后將比重瓶自水浴中取出”起測定，即得。 韋氏比重秤法 取20℃時相對密度為1的韋氏比重秤(圖3)，用新沸過的冷水將所附玻璃圓筒裝至八分滿，置20℃(或各藥品項下規(guī)定的溫度)的水浴中，攪動玻璃圓筒內的水，調節(jié)溫度至20℃(或各藥品項下規(guī)定的溫度)，將懸于秤端的玻璃錘浸入圓筒內的水中，秤臂右端懸掛游碼于1.0000處，調節(jié)秤臂左端平衡用的螺旋使平衡，然后將玻璃圓筒內的水傾去，拭干，裝入供試液至相同的高度，并用同法調節(jié)溫度后，再把拭干的玻璃錘浸入供試液中，調節(jié)秤臂上游碼的數(shù)量與位置使平衡，讀取數(shù)值，即得供試品的相對密度。 如該比重秤系在4℃時相對密度為1，則用水校準時游碼應懸掛于0.9982處，并應將在20℃測得的供試品相對密度除以0.9982。, 百拇醫(yī)藥
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