尤長(zhǎng)宣.pdf
http://www.www.srpcoatings.com
| 第1頁(yè) |
參見(jiàn)附件(229kb)。
中國(guó)臨床腫瘤學(xué)教育專(zhuān)輯 (2007) 95
乳腺癌BA46基因轉(zhuǎn)染樹(shù)突狀細(xì)胞誘導(dǎo)特異細(xì)胞免疫
1
南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院腫瘤科
2
南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院呼吸科
3
美國(guó)阿肯色大學(xué)醫(yī)學(xué)院基因治療中心
尤長(zhǎng)宣 1
蘇 瑾2
廖旺軍1
張軍一
1
鄭航 1
Yong Liu
3
Paul L Hermonat
3
羅榮城 1
摘要 目的：探討以乳腺癌特異抗原 BA46 基因轉(zhuǎn)染乳腺癌患者樹(shù)突狀細(xì)胞(DC)誘導(dǎo)特
異細(xì)胞免疫的可行性。方法：取健康人外周血，采用密度梯度離心的方法分離外周血單個(gè)核細(xì)胞
(DC 前體細(xì)胞)，將細(xì)胞分為基因轉(zhuǎn)移組及對(duì)照組，基因轉(zhuǎn)移組感染攜帶 BA46 基因的重組腺相
關(guān)病毒 rAAV/BA46/Neo，對(duì)照組以 293 細(xì)胞凍融液刺激，兩組細(xì)胞均采用重組粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞
集落刺激因子(GM-CSF) 、白細(xì)胞介素4(IL-4)誘導(dǎo)DC前體細(xì)胞成熟。第7 天，收集懸浮細(xì)
胞(DC)，顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)，流式細(xì)胞儀分析 DC 的表面標(biāo)志 CD80、CD86、CD40 的表達(dá)
情況；另取該 DC 與 T 細(xì)胞按 1：20 比例混合，含 5%人血清蛋白的 AIM-V 為培養(yǎng)基，同時(shí)加
入IL-2 與 GM-CSF，共育7天，誘導(dǎo)獲得細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)(CTL) ，取BA46 陽(yáng)性的乳腺癌細(xì)
胞株 Hs578T 為靶細(xì)胞，采用 51
Cr 釋放法測(cè)量殺傷效率，同時(shí)以流式細(xì)胞儀檢測(cè) CTL 群體中
CD8/CD4 和CD8/CD56的比值。結(jié)果：BA46 基因轉(zhuǎn)導(dǎo)的 DC表面標(biāo)志 CD80、CD86、CD40 的
表達(dá)均明顯高于對(duì)照組 DC，所激活的 T 細(xì)胞對(duì) BA46 陽(yáng)性的乳腺癌細(xì)胞株 Hs578T 有很好的殺
傷效果，此殺傷具有抗原特異性和MHC限制性，且該T細(xì)胞中 CD8/CD4 和 CD8/CD56 的比值
均明顯高于對(duì)照組(裂解物沖擊DC所激活的 T細(xì)胞)。結(jié)論：BA46 基因轉(zhuǎn)導(dǎo)成功制備 DC，并
誘導(dǎo)特異的CTL，為乳腺癌的DC基因轉(zhuǎn)導(dǎo)療法打下基礎(chǔ)。
關(guān)鍵詞 樹(shù)突狀細(xì)胞；BA46；基因轉(zhuǎn)移；乳腺癌
樹(shù)突狀細(xì)胞(DC)是人體內(nèi)功能最強(qiáng)大的抗原遞呈細(xì)胞，在機(jī)體的抗腫瘤免疫中發(fā)揮著重要的作用，采用體外培養(yǎng) DC，特異腫瘤抗原刺激制成DC瘤苗，免疫機(jī)體從而激發(fā)特異的細(xì)胞免疫有望成為一種理
想的腫瘤治療手段[1， 2]。此療法的關(guān)鍵是獲得特異的腫瘤抗原，并將該抗原轉(zhuǎn)導(dǎo)DC。乳腺癌是女性發(fā)病
率最高的惡性腫瘤，BA46幾乎在所有的乳腺癌細(xì)胞表達(dá)，而在乳腺以外的正常組織內(nèi)不表達(dá)，以其抗原
肽免疫轉(zhuǎn)基因鼠，可在其身上誘導(dǎo)出特異的細(xì)胞免疫[3]
， 它是乳腺癌 DC治療非常理想的腫瘤抗原。因此，本研究以腺相關(guān)病毒(AAV)以載體，成功制備高滴度的攜帶 BA46 基因的重組腺相關(guān)病毒
(rAAV/BA46/Neo 病毒)[4]。在此基礎(chǔ)上，取人外周血單個(gè)核細(xì)胞(DC 前體細(xì)胞) ，體外培養(yǎng)，以
rAAV/BA46/Neo病毒轉(zhuǎn)染DC前體細(xì)胞，GM-CSF、IL-4 和 TNF-a誘導(dǎo) DC成熟，加入 T細(xì)胞，GM-CSF
和 IL-2 誘導(dǎo)，最終獲得針對(duì) BA46 的細(xì)胞毒性 T 淋巴細(xì)胞(CTL)，并檢測(cè)該 CTL 對(duì) BA46 陽(yáng)性的乳腺
癌細(xì)胞株Hs578T的殺傷效果及CTL內(nèi)CD8/ CD56 和 CD8/CD56 的情況，探討此基因轉(zhuǎn)移法制備 DC，誘導(dǎo)CTL用于治療乳腺癌的可行性。
一、 材料與方法
(一) 材料
1. 病毒：重組乳腺癌 BA46 基因腺相關(guān)病毒(rAAV/BA46/Neo)由作者于阿肯色大學(xué)醫(yī)學(xué)院基因治
療中心制備，病毒滴度為1×1010
個(gè)病毒顆粒/ml
[4]。
96 中國(guó)臨床腫瘤學(xué)教育專(zhuān)輯 (2007)
2. 主要試劑：AIM-V培養(yǎng)基購(gòu)自GIBCO invitrogen公司；Ficoll淋巴細(xì)胞分離液購(gòu)自 Sigma 公司；
AIM-V(R)無(wú)血清淋巴細(xì)胞培養(yǎng)基購(gòu)自 GIBCO Invitrogen 公司；GM-CSF 購(gòu)自 Immunex 公司；IL-4 購(gòu)
自R&D SYSTEMS公司； Anti-CD40抗體購(gòu)自 Immunotech公司； anti-CD80 購(gòu)自 Becton-Dickinson公司；
anti-CD86，anti-CD4，anti-CD8，anti-CD56 均購(gòu)自Pharmingen公司。
(二) 方法
1.人外周血 DC 的培養(yǎng)：取健康人外周血 50ml，F(xiàn)icoll 分離，收集淋巴細(xì)胞，以 AIM-V 為培養(yǎng)基，調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度為109
/ml，培養(yǎng)于6孔板，每孔2.5ml，在37℃、5%二氧化碳孵箱中培養(yǎng)貼壁5h，輕輕洗去
懸浮的淋巴細(xì)胞，取貼壁的單個(gè)核細(xì)胞，每孔加2.5ml含GM-CSF(終濃度為800U/ml)的AIM-V培養(yǎng)基，將細(xì)胞分為基因轉(zhuǎn)移組和對(duì)照組(未感染病毒組)，基因轉(zhuǎn)移組每孔加 rAAV/BA46/Neo病毒液0.5ml，感
染5h后換液為每孔 3ml 含GM-CSF(終濃度為800U/ml)的 AIM-V培養(yǎng)基 ......
乳腺癌BA46基因轉(zhuǎn)染樹(shù)突狀細(xì)胞誘導(dǎo)特異細(xì)胞免疫
1
南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院腫瘤科
2
南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院呼吸科
3
美國(guó)阿肯色大學(xué)醫(yī)學(xué)院基因治療中心
尤長(zhǎng)宣 1
蘇 瑾2
廖旺軍1
張軍一
1
鄭航 1
Yong Liu
3
Paul L Hermonat
3
羅榮城 1
摘要 目的：探討以乳腺癌特異抗原 BA46 基因轉(zhuǎn)染乳腺癌患者樹(shù)突狀細(xì)胞(DC)誘導(dǎo)特
異細(xì)胞免疫的可行性。方法：取健康人外周血，采用密度梯度離心的方法分離外周血單個(gè)核細(xì)胞
(DC 前體細(xì)胞)，將細(xì)胞分為基因轉(zhuǎn)移組及對(duì)照組，基因轉(zhuǎn)移組感染攜帶 BA46 基因的重組腺相
關(guān)病毒 rAAV/BA46/Neo，對(duì)照組以 293 細(xì)胞凍融液刺激，兩組細(xì)胞均采用重組粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞
集落刺激因子(GM-CSF) 、白細(xì)胞介素4(IL-4)誘導(dǎo)DC前體細(xì)胞成熟。第7 天，收集懸浮細(xì)
胞(DC)，顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)，流式細(xì)胞儀分析 DC 的表面標(biāo)志 CD80、CD86、CD40 的表達(dá)
情況；另取該 DC 與 T 細(xì)胞按 1：20 比例混合，含 5%人血清蛋白的 AIM-V 為培養(yǎng)基，同時(shí)加
入IL-2 與 GM-CSF，共育7天，誘導(dǎo)獲得細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)(CTL) ，取BA46 陽(yáng)性的乳腺癌細(xì)
胞株 Hs578T 為靶細(xì)胞，采用 51
Cr 釋放法測(cè)量殺傷效率，同時(shí)以流式細(xì)胞儀檢測(cè) CTL 群體中
CD8/CD4 和CD8/CD56的比值。結(jié)果：BA46 基因轉(zhuǎn)導(dǎo)的 DC表面標(biāo)志 CD80、CD86、CD40 的
表達(dá)均明顯高于對(duì)照組 DC，所激活的 T 細(xì)胞對(duì) BA46 陽(yáng)性的乳腺癌細(xì)胞株 Hs578T 有很好的殺
傷效果，此殺傷具有抗原特異性和MHC限制性，且該T細(xì)胞中 CD8/CD4 和 CD8/CD56 的比值
均明顯高于對(duì)照組(裂解物沖擊DC所激活的 T細(xì)胞)。結(jié)論：BA46 基因轉(zhuǎn)導(dǎo)成功制備 DC，并
誘導(dǎo)特異的CTL，為乳腺癌的DC基因轉(zhuǎn)導(dǎo)療法打下基礎(chǔ)。
關(guān)鍵詞 樹(shù)突狀細(xì)胞；BA46；基因轉(zhuǎn)移；乳腺癌
樹(shù)突狀細(xì)胞(DC)是人體內(nèi)功能最強(qiáng)大的抗原遞呈細(xì)胞，在機(jī)體的抗腫瘤免疫中發(fā)揮著重要的作用，采用體外培養(yǎng) DC，特異腫瘤抗原刺激制成DC瘤苗，免疫機(jī)體從而激發(fā)特異的細(xì)胞免疫有望成為一種理
想的腫瘤治療手段[1， 2]。此療法的關(guān)鍵是獲得特異的腫瘤抗原，并將該抗原轉(zhuǎn)導(dǎo)DC。乳腺癌是女性發(fā)病
率最高的惡性腫瘤，BA46幾乎在所有的乳腺癌細(xì)胞表達(dá)，而在乳腺以外的正常組織內(nèi)不表達(dá)，以其抗原
肽免疫轉(zhuǎn)基因鼠，可在其身上誘導(dǎo)出特異的細(xì)胞免疫[3]
， 它是乳腺癌 DC治療非常理想的腫瘤抗原。因此，本研究以腺相關(guān)病毒(AAV)以載體，成功制備高滴度的攜帶 BA46 基因的重組腺相關(guān)病毒
(rAAV/BA46/Neo 病毒)[4]。在此基礎(chǔ)上，取人外周血單個(gè)核細(xì)胞(DC 前體細(xì)胞) ，體外培養(yǎng)，以
rAAV/BA46/Neo病毒轉(zhuǎn)染DC前體細(xì)胞，GM-CSF、IL-4 和 TNF-a誘導(dǎo) DC成熟，加入 T細(xì)胞，GM-CSF
和 IL-2 誘導(dǎo)，最終獲得針對(duì) BA46 的細(xì)胞毒性 T 淋巴細(xì)胞(CTL)，并檢測(cè)該 CTL 對(duì) BA46 陽(yáng)性的乳腺
癌細(xì)胞株Hs578T的殺傷效果及CTL內(nèi)CD8/ CD56 和 CD8/CD56 的情況，探討此基因轉(zhuǎn)移法制備 DC，誘導(dǎo)CTL用于治療乳腺癌的可行性。
一、 材料與方法
(一) 材料
1. 病毒：重組乳腺癌 BA46 基因腺相關(guān)病毒(rAAV/BA46/Neo)由作者于阿肯色大學(xué)醫(yī)學(xué)院基因治
療中心制備，病毒滴度為1×1010
個(gè)病毒顆粒/ml
[4]。
96 中國(guó)臨床腫瘤學(xué)教育專(zhuān)輯 (2007)
2. 主要試劑：AIM-V培養(yǎng)基購(gòu)自GIBCO invitrogen公司；Ficoll淋巴細(xì)胞分離液購(gòu)自 Sigma 公司；
AIM-V(R)無(wú)血清淋巴細(xì)胞培養(yǎng)基購(gòu)自 GIBCO Invitrogen 公司；GM-CSF 購(gòu)自 Immunex 公司；IL-4 購(gòu)
自R&D SYSTEMS公司； Anti-CD40抗體購(gòu)自 Immunotech公司； anti-CD80 購(gòu)自 Becton-Dickinson公司；
anti-CD86，anti-CD4，anti-CD8，anti-CD56 均購(gòu)自Pharmingen公司。
(二) 方法
1.人外周血 DC 的培養(yǎng)：取健康人外周血 50ml，F(xiàn)icoll 分離，收集淋巴細(xì)胞，以 AIM-V 為培養(yǎng)基，調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度為109
/ml，培養(yǎng)于6孔板，每孔2.5ml，在37℃、5%二氧化碳孵箱中培養(yǎng)貼壁5h，輕輕洗去
懸浮的淋巴細(xì)胞，取貼壁的單個(gè)核細(xì)胞，每孔加2.5ml含GM-CSF(終濃度為800U/ml)的AIM-V培養(yǎng)基，將細(xì)胞分為基因轉(zhuǎn)移組和對(duì)照組(未感染病毒組)，基因轉(zhuǎn)移組每孔加 rAAV/BA46/Neo病毒液0.5ml，感
染5h后換液為每孔 3ml 含GM-CSF(終濃度為800U/ml)的 AIM-V培養(yǎng)基 ......
您現(xiàn)在查看是摘要介紹頁(yè)，詳見(jiàn)PDF附件(229KB，5頁(yè))。