第08章 細(xì)胞凋亡于腫瘤 .doc
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第八章 細(xì)胞凋亡于腫瘤
第一節(jié) 細(xì)胞凋亡的基本特點及其檢測方法
一、細(xì)胞凋亡和細(xì)胞壞死的區(qū)別
特 點 細(xì)胞凋亡 細(xì)胞壞死形態(tài)學(xué)方面： 細(xì)胞體積萎縮.與周圍細(xì)胞分離細(xì)胞腫脹 細(xì)胞膜膜發(fā)泡，通透性下常，細(xì)胞膜磷脂酰絲氨酸外翻(PS)完整性破壞，通透性增加 細(xì)胞核先固縮，后降解溶解 溶酶體完整裂解 線粒體濃縮，跨膜電位受損，細(xì)胞色素c釋放腫脹，破壞，能量生成受損生物化學(xué)方面 DNA非隨機(jī)性DNA裂解，ladder，核小體間剪切非特征性剪切 蛋白質(zhì)Caspases活化非特征性降解 底物特異性降解非特異性水懈 抗死亡分子Bcl 2家族，Caspases 抑制劑有時受Bcl-2調(diào)控 對ATP的要求必需無需 組織分布單個細(xì)胞細(xì)胞群體 結(jié)局(組織反應(yīng)被吞噬細(xì)胞吞噬，不引起炎癥反血釋放細(xì)胞碎片，引起炎癥反應(yīng)二、評價凋亡的基本方法
(一)細(xì)胞膜完整性和細(xì)胞形態(tài)學(xué)的評價
多數(shù)體外培養(yǎng)體系中，凋亡細(xì)胞并不能被機(jī)體清除。最終它們將和壞死細(xì)胞一樣，發(fā)生細(xì)胞膜的損傷和腫張、裂解。因此，應(yīng)用培養(yǎng)細(xì)胞研究細(xì)胞凋亡的發(fā)生機(jī)制時.嚴(yán)格區(qū)分這種繼發(fā)性壞死(secondary necrosis)和真正意義上的細(xì)胞壞死是非常重要的。
1.細(xì)胞膜完整性的評判：臺盼藍(lán)去染法和丫啶橙/溴化丙啶雙染法。丫啶橙(AO)和溴化丙啶EB都是結(jié)合DNA的熒光染料，分別產(chǎn)生藍(lán)色和橙色熒光。其中AO能透過完整的細(xì)胞膜，而EB則只能染色胞膜受損的細(xì)胞。
2.應(yīng)用光學(xué)顯敝鏡的形態(tài)學(xué)檢測：它仍然是區(qū)分細(xì)胞凋亡和壞死的最基本和最重要的手段。
3 應(yīng)用電子顯微鏡的形態(tài)學(xué)檢測 ：超微結(jié)構(gòu)觀察可顯示凋亡細(xì)胞的許多特點。
(二)DNA斷裂的檢測方法
* 在細(xì)胞凋亡中非隨機(jī)性DNA裂解產(chǎn)生的寡核小體片段在瓊脂糖凝膠電泳圖譜上表現(xiàn)為特征性的DNA梯子(DNA ladder)
* 3H-TdR預(yù)先標(biāo)記細(xì)胞內(nèi)DNA后，離心分離降解(低分子量DNA)和完整(高分子量DNA)組分，并分別測定兩個組分的DNA含量。根據(jù)降解DNA組分占整個細(xì)胞DNA的百分率間接地對凋亡細(xì)胞進(jìn)行定量測定。
* 原位末端標(biāo)記(in Situ end-labeling)技術(shù)也是定量凋亡細(xì)胞的有效方法
(三)流式細(xì)胞儀在細(xì)胞凋亡中的應(yīng)用
* 流式細(xì)胞儀(flow cytometry，F(xiàn)CM)是分析細(xì)胞學(xué)研究的重要工具。
* 凋亡細(xì)胞在固定和清洗時，降解的小分子量DNA外漏，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)DNA含量減少。凋亡細(xì)胞常常以亞二倍體形式出現(xiàn)。該亞二倍體細(xì)胞群被稱為亞Gl期(sub-G1)細(xì)胞。它的出現(xiàn)被認(rèn)為是細(xì)胞凋亡的重要標(biāo)志。
(四)Annexin V的檢測
* 磷脂酰絲氨酸外翻是早期凋亡細(xì)胞的重要特征之一。
* 依賴Ca2+的磷脂結(jié)合蛋白Annexin V能夠和PS高親和結(jié)合。敏感探針，用于凋亡細(xì)胞的檢測
(五)原位末端標(biāo)記技術(shù)
* ISEL技術(shù)是根據(jù)DNA聚合酶能夠填補(bǔ)雙鏈DNA中單鏈的缺失部分的基本原理，應(yīng)用標(biāo)記的三磷酸核苷酸形成新的DNA。
* 最常用的是熒光素FITC標(biāo)記三磷酸核苷酸。因此，可以通過FCM或熒光顯微鏡檢測相應(yīng)的熒光強(qiáng)度，達(dá)到了解DNA是否斷裂和發(fā)生DNA斷裂的細(xì)胞的數(shù)量。
* 根據(jù)采用的DNA聚合酶不同，ISEL至少包括三種方法：①DNA缺口平移法：②原位末端標(biāo)記法：③末端DNA轉(zhuǎn)移酶dUTP缺口末端標(biāo)記法(TUNEL)：
三、細(xì)胞凋亡的生物學(xué)意義概述
* 在多細(xì)胞生物體，特定組織器官的細(xì)胞類型和細(xì)胞數(shù)量是相對恒定的。這種恒定主要取決于細(xì)胞增殖和凋亡之間的動態(tài)平衡。
* 和細(xì)胞增殖一樣，細(xì)胞凋亡對于多細(xì)胞生物體的發(fā)育和穩(wěn)態(tài)的維持是至關(guān)熏要的，* 細(xì)胞凋亡明顯影響胚胎和嬰兒發(fā)育的所有方面。
* 細(xì)胞DNA損傷可誘導(dǎo)抑癌基因p53的表達(dá)。它使細(xì)胞停滯于G1期，以便提供足夠的時間對損傷的DNA進(jìn)行修復(fù)(參見第四章)。在細(xì)胞損傷嚴(yán)重以致修復(fù)無能的情況下，p53則觸發(fā)細(xì)胞凋亡。
* 細(xì)胞凋亡和衰老密切相關(guān)。1. 清除損傷或無功能的細(xì)胞，并以新細(xì)胞替代之，從而保持組織自穩(wěn)態(tài)；2. 清除不可替代的分裂后細(xì)胞如神經(jīng)元、心肌細(xì)胞，使機(jī)體免患疾病。
第二節(jié) 細(xì)胞凋亡的發(fā)生機(jī)制
* 細(xì)胞凋亡的發(fā)生發(fā)展過程可劃分為三個時期，即誘導(dǎo)期、效應(yīng)期和降解期。
* 最重要的是凋亡活化基因Ced-3、Ced-4和凋亡抑制基因Ced-9。
* 它們誘導(dǎo)和調(diào)控細(xì)胞凋亡的基本機(jī)制是：
* Ced-3是具嚴(yán)格底物特異性的"半胱氨酸蛋白酶"。它通常以酶原(前體)的形式存在于細(xì)胞內(nèi)。
* 細(xì)胞凋亡時，活化的Ced-3特異地降解蛋白底物，誘導(dǎo)凋亡細(xì)胞的特征性形態(tài)學(xué)和生物化學(xué)變化。
* Ced-4既能結(jié)合Ced-3，也能與Ced-9結(jié)合。
* 在非凋亡細(xì)胞，Ced-9以Ced-4為中介和Ced-3結(jié)合成三體復(fù)合物，扣押Ced-3使其以無活性的酶原形式存在于細(xì)胞內(nèi)。
* 在凋亡誘導(dǎo)信號的作用下，Ced-9自復(fù)合物中解離。這可能與新近發(fā)現(xiàn)的EGL-1有關(guān)。
* EGL-1能夠結(jié)合Ced-9.并替代三體復(fù)合物中的Ced-4/Ced-3，導(dǎo)致Ced-3在Ced-4的用下活化，并促使細(xì)胞凋亡。
* Ced-3和Ced-9在人體的類似物分別代表兩大家族，即Caspases家族和Bcl-2家族
* 與Ced-4同源的只有凋亡活化因子(Apaf-l)。
* 哺乳動物細(xì)胞凋亡機(jī)制的認(rèn)識?已經(jīng)發(fā)展為兩種概念。
* 其一，Caspase在細(xì)胞凋亡過程中發(fā)揮重要作用。
* 其二，過去從凋亡細(xì)胞主要表現(xiàn)為細(xì)胞核的改變出發(fā)，提出細(xì)胞凋亡發(fā)生的始動環(huán)節(jié)存在于細(xì)胞核。新近研究顯示細(xì)胞核的改變是細(xì)胞凋亡的結(jié)果，而不是其原因。
一、Caspases和細(xì)胞凋亡
Caspases 1993年，袁鈞英等發(fā)現(xiàn)Ced-3基因與哺乳動物細(xì)胞白細(xì)胞介素-1?轉(zhuǎn)化酶(interlukin -? converting enzyme, ICE)存在功能和序列相似性。和Ced3一樣，ICE的高表達(dá)可導(dǎo)致嚙齒動物成纖維細(xì)胞凋亡。隨后發(fā)現(xiàn)14個ICE/Ced-3家族成原。為了避免命名上的混亂，袁鈞英等在1996年10月組成了一個專門小組，推薦將ICE/ced-3家族成員統(tǒng)一命名為 Caspase (Cysteinyl Aspartate-specific Proteinases)，而對其家族成員，則按發(fā)現(xiàn)先后為序，在 Caspases后以阿拉伯?dāng)?shù)字表示。
(一)Caspases的結(jié)構(gòu)和活性特點
* Caspases家族有相似的氨基酸序列、結(jié)構(gòu)和底物特異性。它們都以酶原形式表達(dá)。
* Caspase酶原由?原結(jié)構(gòu)域(prodomain)、大亞基和小亞基構(gòu)成。
* Caspase屬于?半胱氨酸蛋白酶 ......
第八章 細(xì)胞凋亡于腫瘤
第一節(jié) 細(xì)胞凋亡的基本特點及其檢測方法
一、細(xì)胞凋亡和細(xì)胞壞死的區(qū)別
特 點 細(xì)胞凋亡 細(xì)胞壞死形態(tài)學(xué)方面： 細(xì)胞體積萎縮.與周圍細(xì)胞分離細(xì)胞腫脹 細(xì)胞膜膜發(fā)泡，通透性下常，細(xì)胞膜磷脂酰絲氨酸外翻(PS)完整性破壞，通透性增加 細(xì)胞核先固縮，后降解溶解 溶酶體完整裂解 線粒體濃縮，跨膜電位受損，細(xì)胞色素c釋放腫脹，破壞，能量生成受損生物化學(xué)方面 DNA非隨機(jī)性DNA裂解，ladder，核小體間剪切非特征性剪切 蛋白質(zhì)Caspases活化非特征性降解 底物特異性降解非特異性水懈 抗死亡分子Bcl 2家族，Caspases 抑制劑有時受Bcl-2調(diào)控 對ATP的要求必需無需 組織分布單個細(xì)胞細(xì)胞群體 結(jié)局(組織反應(yīng)被吞噬細(xì)胞吞噬，不引起炎癥反血釋放細(xì)胞碎片，引起炎癥反應(yīng)二、評價凋亡的基本方法
(一)細(xì)胞膜完整性和細(xì)胞形態(tài)學(xué)的評價
多數(shù)體外培養(yǎng)體系中，凋亡細(xì)胞并不能被機(jī)體清除。最終它們將和壞死細(xì)胞一樣，發(fā)生細(xì)胞膜的損傷和腫張、裂解。因此，應(yīng)用培養(yǎng)細(xì)胞研究細(xì)胞凋亡的發(fā)生機(jī)制時.嚴(yán)格區(qū)分這種繼發(fā)性壞死(secondary necrosis)和真正意義上的細(xì)胞壞死是非常重要的。
1.細(xì)胞膜完整性的評判：臺盼藍(lán)去染法和丫啶橙/溴化丙啶雙染法。丫啶橙(AO)和溴化丙啶EB都是結(jié)合DNA的熒光染料，分別產(chǎn)生藍(lán)色和橙色熒光。其中AO能透過完整的細(xì)胞膜，而EB則只能染色胞膜受損的細(xì)胞。
2.應(yīng)用光學(xué)顯敝鏡的形態(tài)學(xué)檢測：它仍然是區(qū)分細(xì)胞凋亡和壞死的最基本和最重要的手段。
3 應(yīng)用電子顯微鏡的形態(tài)學(xué)檢測 ：超微結(jié)構(gòu)觀察可顯示凋亡細(xì)胞的許多特點。
(二)DNA斷裂的檢測方法
* 在細(xì)胞凋亡中非隨機(jī)性DNA裂解產(chǎn)生的寡核小體片段在瓊脂糖凝膠電泳圖譜上表現(xiàn)為特征性的DNA梯子(DNA ladder)
* 3H-TdR預(yù)先標(biāo)記細(xì)胞內(nèi)DNA后，離心分離降解(低分子量DNA)和完整(高分子量DNA)組分，并分別測定兩個組分的DNA含量。根據(jù)降解DNA組分占整個細(xì)胞DNA的百分率間接地對凋亡細(xì)胞進(jìn)行定量測定。
* 原位末端標(biāo)記(in Situ end-labeling)技術(shù)也是定量凋亡細(xì)胞的有效方法
(三)流式細(xì)胞儀在細(xì)胞凋亡中的應(yīng)用
* 流式細(xì)胞儀(flow cytometry，F(xiàn)CM)是分析細(xì)胞學(xué)研究的重要工具。
* 凋亡細(xì)胞在固定和清洗時，降解的小分子量DNA外漏，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)DNA含量減少。凋亡細(xì)胞常常以亞二倍體形式出現(xiàn)。該亞二倍體細(xì)胞群被稱為亞Gl期(sub-G1)細(xì)胞。它的出現(xiàn)被認(rèn)為是細(xì)胞凋亡的重要標(biāo)志。
(四)Annexin V的檢測
* 磷脂酰絲氨酸外翻是早期凋亡細(xì)胞的重要特征之一。
* 依賴Ca2+的磷脂結(jié)合蛋白Annexin V能夠和PS高親和結(jié)合。敏感探針，用于凋亡細(xì)胞的檢測
(五)原位末端標(biāo)記技術(shù)
* ISEL技術(shù)是根據(jù)DNA聚合酶能夠填補(bǔ)雙鏈DNA中單鏈的缺失部分的基本原理，應(yīng)用標(biāo)記的三磷酸核苷酸形成新的DNA。
* 最常用的是熒光素FITC標(biāo)記三磷酸核苷酸。因此，可以通過FCM或熒光顯微鏡檢測相應(yīng)的熒光強(qiáng)度，達(dá)到了解DNA是否斷裂和發(fā)生DNA斷裂的細(xì)胞的數(shù)量。
* 根據(jù)采用的DNA聚合酶不同，ISEL至少包括三種方法：①DNA缺口平移法：②原位末端標(biāo)記法：③末端DNA轉(zhuǎn)移酶dUTP缺口末端標(biāo)記法(TUNEL)：
三、細(xì)胞凋亡的生物學(xué)意義概述
* 在多細(xì)胞生物體，特定組織器官的細(xì)胞類型和細(xì)胞數(shù)量是相對恒定的。這種恒定主要取決于細(xì)胞增殖和凋亡之間的動態(tài)平衡。
* 和細(xì)胞增殖一樣，細(xì)胞凋亡對于多細(xì)胞生物體的發(fā)育和穩(wěn)態(tài)的維持是至關(guān)熏要的，* 細(xì)胞凋亡明顯影響胚胎和嬰兒發(fā)育的所有方面。
* 細(xì)胞DNA損傷可誘導(dǎo)抑癌基因p53的表達(dá)。它使細(xì)胞停滯于G1期，以便提供足夠的時間對損傷的DNA進(jìn)行修復(fù)(參見第四章)。在細(xì)胞損傷嚴(yán)重以致修復(fù)無能的情況下，p53則觸發(fā)細(xì)胞凋亡。
* 細(xì)胞凋亡和衰老密切相關(guān)。1. 清除損傷或無功能的細(xì)胞，并以新細(xì)胞替代之，從而保持組織自穩(wěn)態(tài)；2. 清除不可替代的分裂后細(xì)胞如神經(jīng)元、心肌細(xì)胞，使機(jī)體免患疾病。
第二節(jié) 細(xì)胞凋亡的發(fā)生機(jī)制
* 細(xì)胞凋亡的發(fā)生發(fā)展過程可劃分為三個時期，即誘導(dǎo)期、效應(yīng)期和降解期。
* 最重要的是凋亡活化基因Ced-3、Ced-4和凋亡抑制基因Ced-9。
* 它們誘導(dǎo)和調(diào)控細(xì)胞凋亡的基本機(jī)制是：
* Ced-3是具嚴(yán)格底物特異性的"半胱氨酸蛋白酶"。它通常以酶原(前體)的形式存在于細(xì)胞內(nèi)。
* 細(xì)胞凋亡時，活化的Ced-3特異地降解蛋白底物，誘導(dǎo)凋亡細(xì)胞的特征性形態(tài)學(xué)和生物化學(xué)變化。
* Ced-4既能結(jié)合Ced-3，也能與Ced-9結(jié)合。
* 在非凋亡細(xì)胞，Ced-9以Ced-4為中介和Ced-3結(jié)合成三體復(fù)合物，扣押Ced-3使其以無活性的酶原形式存在于細(xì)胞內(nèi)。
* 在凋亡誘導(dǎo)信號的作用下，Ced-9自復(fù)合物中解離。這可能與新近發(fā)現(xiàn)的EGL-1有關(guān)。
* EGL-1能夠結(jié)合Ced-9.并替代三體復(fù)合物中的Ced-4/Ced-3，導(dǎo)致Ced-3在Ced-4的用下活化，并促使細(xì)胞凋亡。
* Ced-3和Ced-9在人體的類似物分別代表兩大家族，即Caspases家族和Bcl-2家族
* 與Ced-4同源的只有凋亡活化因子(Apaf-l)。
* 哺乳動物細(xì)胞凋亡機(jī)制的認(rèn)識?已經(jīng)發(fā)展為兩種概念。
* 其一，Caspase在細(xì)胞凋亡過程中發(fā)揮重要作用。
* 其二，過去從凋亡細(xì)胞主要表現(xiàn)為細(xì)胞核的改變出發(fā)，提出細(xì)胞凋亡發(fā)生的始動環(huán)節(jié)存在于細(xì)胞核。新近研究顯示細(xì)胞核的改變是細(xì)胞凋亡的結(jié)果，而不是其原因。
一、Caspases和細(xì)胞凋亡
Caspases 1993年，袁鈞英等發(fā)現(xiàn)Ced-3基因與哺乳動物細(xì)胞白細(xì)胞介素-1?轉(zhuǎn)化酶(interlukin -? converting enzyme, ICE)存在功能和序列相似性。和Ced3一樣，ICE的高表達(dá)可導(dǎo)致嚙齒動物成纖維細(xì)胞凋亡。隨后發(fā)現(xiàn)14個ICE/Ced-3家族成原。為了避免命名上的混亂，袁鈞英等在1996年10月組成了一個專門小組，推薦將ICE/ced-3家族成員統(tǒng)一命名為 Caspase (Cysteinyl Aspartate-specific Proteinases)，而對其家族成員，則按發(fā)現(xiàn)先后為序，在 Caspases后以阿拉伯?dāng)?shù)字表示。
(一)Caspases的結(jié)構(gòu)和活性特點
* Caspases家族有相似的氨基酸序列、結(jié)構(gòu)和底物特異性。它們都以酶原形式表達(dá)。
* Caspase酶原由?原結(jié)構(gòu)域(prodomain)、大亞基和小亞基構(gòu)成。
* Caspase屬于?半胱氨酸蛋白酶 ......
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