肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子對(duì)四氯化碳損傷原代培養(yǎng)大鼠肝細(xì)胞的保護(hù)作用.pdf
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肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子對(duì)四氯化碳損傷原代培養(yǎng)大鼠肝細(xì)胞的保護(hù)作用3
鄒 原 宮德正 孫麗娟1
梅懋華
(大連醫(yī)科大學(xué)生理教研室,1
附屬二院檢驗(yàn)科, 大連 116023)
摘要 本工作采用無血清原代培養(yǎng)大鼠肝細(xì)胞法, 觀察了重組人肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子 ( r2 hHGF) 對(duì)四氯化碳 (CCl4) 致
大鼠肝細(xì)胞損傷的保護(hù)作用。結(jié)果表明, r2 hHGF 對(duì)CCl4 染毒肝細(xì)胞有明顯的保護(hù)作用。r2 hHGF 保護(hù)組較CCl4
染毒組細(xì)胞存活率顯著升高, 細(xì)胞內(nèi)丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶、鉀離子漏出明顯降低。結(jié)果提示, r2 hHGF 可減輕CCl4 對(duì)肝
細(xì)胞膜的損傷, 提高細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)完整性。
關(guān)鍵詞 肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子 丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶 鉀離子 四氯化碳 肝細(xì)胞原代培養(yǎng)
X 肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子 (hepatocyte grow th facto r,HGF ) 是晚近新發(fā)現(xiàn)的生長(zhǎng)因子[ 1 ]
, 是由分子量
75kD 的 A鏈和 30KD 的 B鏈通過二硫鍵連接而成
的二聚體。 HGF 在體內(nèi)廣泛分布, 是一多效性因子,具 有 促 細(xì) 胞 分 裂 (m itogen )、 促 細(xì) 胞 運(yùn) 動(dòng)
(mo togen)、促形態(tài)形成 (mo rphogen) 等作用。
大鼠肝部分切除 (PH) 或用CCl4 染毒, 其血漿
HGF 水平比對(duì)照組分別高17 倍和13 倍[ 2 ]�；急┌l(fā)
性肝衰病人血中HGF 水平較正常人高30 倍[ 3 ]。我
們的前期工作表明, HGF 是最強(qiáng)的促肝細(xì)胞分裂
原, 在 10ng? m l劑量即可引起3
H2TdR 摻入率達(dá)到
最大。HGF 除具有促細(xì)胞增殖作用外, 是否還具有
保護(hù)作用目前尚未見報(bào)道。本工作采用原代培養(yǎng)大
鼠肝細(xì)胞, 觀察HGF 對(duì)CCl4 染毒的大鼠肝細(xì)胞的
保護(hù)作用。
1 材料和方法
111 動(dòng)物
采用Sp rague2 Daw ley (SD) 雄性大鼠 (本校實(shí)
驗(yàn)動(dòng)物中心提供) , 體重180- 220g, 分籠飼養(yǎng), 標(biāo)
準(zhǔn)鼠食, 自由飲水。
112 主要試劑
重組人肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子 ( r2 hHGF)、膠原酶 (ì
型)、胰島素為Sigm a 公司產(chǎn)品 (St . Lou is, MO ,U SA ) ; RPM I21640 人工合成培養(yǎng)基為Gibco 產(chǎn)品
(Grand Island, N Y) ; 牛血清白蛋白 (BSA ) 為上海
松口精益試劑儀器廠產(chǎn)品; CCl4 (分析純) 為沈陽(yáng)市
虎石臺(tái)化學(xué)試劑廠產(chǎn)品。
113 肝細(xì)胞的分離和原代培養(yǎng)
按照Seglen 法[ 4 ]
略加修改。簡(jiǎn)述如下: 輕度乙
醚麻醉大鼠, 剖腹后作門靜脈插管, 剪斷下腔靜脈。
用D2 Hank s 液快速灌流以沖去殘血, 灌速 30 -
40m l? m in, 約10m in 后換含0105%膠原酶的Hank s
液灌流, 灌速5m l? m in, 灌流10m in 左右。待肝臟
失去彈性, 肝包膜腫脹后, 取下肝臟, 輕輕撕去包
膜, 將肝細(xì)胞分散于預(yù)冷的Hank s 液中, 200 目濾網(wǎng)
濾過, 離心清洗三次 (600rpm , 40s, 800rpm , 50s
和1000rpm , 60s) , 將肝細(xì)胞懸浮于 5%小牛血清
(56℃, 30m in 補(bǔ)體滅活) 的RPM I21640 的培養(yǎng)液中
(RPM I21640 培養(yǎng)基, 青霉素 100U? m l, 鏈霉素
100Lg? m l, 胰島素10- 8
mo l? L , 地塞米松10- 6
mo l?
L )。用 014%臺(tái)盼藍(lán)排除法測(cè)細(xì)胞存活率, 達(dá)90%
以上者用于實(shí)驗(yàn)。調(diào)細(xì)胞密度為2×105
細(xì)胞? m l, 接
種于24 孔細(xì)胞培養(yǎng)板 (Co star) 中, 置于飽和濕度,37℃及5% CO 2 的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
114 CCl4 損傷法[5 ]
細(xì)胞接種培養(yǎng)18- 20h 后, 換以含 r2 hHGF 的
無血清RPM I21640 培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24h, 加入20%
CCl4 乙醇溶液, CCl4 終濃度15mmo l? L。 40m in 后測(cè)
定培養(yǎng)液中的丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶 (AL T )、K+
漏出水平。
115 ALT、K+
漏出的測(cè)定
取染毒后培養(yǎng)液500Ll, 離心 (500rpm , 5m in) ,留上清。用Beckm an system E2A 離子分析儀 (美
國(guó))測(cè)定上清液中K+
濃度, 以mmo l? L 表示; 用A b2
bo t t CCxê 型生化分析儀 (美國(guó)) 測(cè)定上清液中
AL T 活力, 以U? L 表示。
116 統(tǒng)計(jì)處理
各組數(shù)據(jù)以x q±s 表示, P 值經(jīng) t 檢驗(yàn)。
2 結(jié)果
211 r-hHGF 對(duì)CCl4 染毒肝細(xì)胞存活率的影響
822 Ch in J App l Physio l 1997; 13 (3)
X 國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目 (№. 39470275)
1996- 10- 14 收稿 1997- 3- 3 修回實(shí)驗(yàn)中將培養(yǎng)肝細(xì)胞分為四組: 對(duì)照組 (PBS
組和 r2 hHGF 組) , 染毒組 (CCl4 15mmo l? L ) , 保護(hù)
組 ( r2 hHGF 5ng? m l+ CCl4 15mmo l? L )。結(jié)果表明,CCl4 染毒后細(xì)胞存活率較對(duì)照組顯著降低 (P <
0101, n= 6) ; 而r2 hHGF 可明顯降低CCl4 致細(xì)胞死
亡率, 使其存活率升高 (P < 0101, n= 6)。
Tab1 Effect of r2 hHGF on the viability and the leakage
of int racellular po tassium of the cultured
hepatocytes expo sed to CCl4
V iability (% ) K+ (mmo l? L )
n 6 6
PBS 92±2 5113±0103
r2 hHGF (5ng? m l) 94±1 5120±0102
CCl4 (15mmo l? L ) 57±6+ + 5195±0111+ + +
r2 hHGF (5ng? m l) +
CCl4 (15mmo l? L )
72±63 3
5167±01113 3
+ +
P < 0101,+ + + P < 01001 compared w ith the PBS
group; 3 3
P < 0101, compared w ith the CCl4 group.
212 r-hHGF 對(duì)CCl4 染毒肝細(xì)胞ALT 漏出的影響
按上述四組(n= 6) , 分別測(cè)定細(xì)胞培養(yǎng)液AL T
的漏出量 ......
鄒 原 宮德正 孫麗娟1
梅懋華
(大連醫(yī)科大學(xué)生理教研室,1
附屬二院檢驗(yàn)科, 大連 116023)
摘要 本工作采用無血清原代培養(yǎng)大鼠肝細(xì)胞法, 觀察了重組人肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子 ( r2 hHGF) 對(duì)四氯化碳 (CCl4) 致
大鼠肝細(xì)胞損傷的保護(hù)作用。結(jié)果表明, r2 hHGF 對(duì)CCl4 染毒肝細(xì)胞有明顯的保護(hù)作用。r2 hHGF 保護(hù)組較CCl4
染毒組細(xì)胞存活率顯著升高, 細(xì)胞內(nèi)丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶、鉀離子漏出明顯降低。結(jié)果提示, r2 hHGF 可減輕CCl4 對(duì)肝
細(xì)胞膜的損傷, 提高細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)完整性。
關(guān)鍵詞 肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子 丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶 鉀離子 四氯化碳 肝細(xì)胞原代培養(yǎng)
X 肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子 (hepatocyte grow th facto r,HGF ) 是晚近新發(fā)現(xiàn)的生長(zhǎng)因子[ 1 ]
, 是由分子量
75kD 的 A鏈和 30KD 的 B鏈通過二硫鍵連接而成
的二聚體。 HGF 在體內(nèi)廣泛分布, 是一多效性因子,具 有 促 細(xì) 胞 分 裂 (m itogen )、 促 細(xì) 胞 運(yùn) 動(dòng)
(mo togen)、促形態(tài)形成 (mo rphogen) 等作用。
大鼠肝部分切除 (PH) 或用CCl4 染毒, 其血漿
HGF 水平比對(duì)照組分別高17 倍和13 倍[ 2 ]�；急┌l(fā)
性肝衰病人血中HGF 水平較正常人高30 倍[ 3 ]。我
們的前期工作表明, HGF 是最強(qiáng)的促肝細(xì)胞分裂
原, 在 10ng? m l劑量即可引起3
H2TdR 摻入率達(dá)到
最大。HGF 除具有促細(xì)胞增殖作用外, 是否還具有
保護(hù)作用目前尚未見報(bào)道。本工作采用原代培養(yǎng)大
鼠肝細(xì)胞, 觀察HGF 對(duì)CCl4 染毒的大鼠肝細(xì)胞的
保護(hù)作用。
1 材料和方法
111 動(dòng)物
采用Sp rague2 Daw ley (SD) 雄性大鼠 (本校實(shí)
驗(yàn)動(dòng)物中心提供) , 體重180- 220g, 分籠飼養(yǎng), 標(biāo)
準(zhǔn)鼠食, 自由飲水。
112 主要試劑
重組人肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子 ( r2 hHGF)、膠原酶 (ì
型)、胰島素為Sigm a 公司產(chǎn)品 (St . Lou is, MO ,U SA ) ; RPM I21640 人工合成培養(yǎng)基為Gibco 產(chǎn)品
(Grand Island, N Y) ; 牛血清白蛋白 (BSA ) 為上海
松口精益試劑儀器廠產(chǎn)品; CCl4 (分析純) 為沈陽(yáng)市
虎石臺(tái)化學(xué)試劑廠產(chǎn)品。
113 肝細(xì)胞的分離和原代培養(yǎng)
按照Seglen 法[ 4 ]
略加修改。簡(jiǎn)述如下: 輕度乙
醚麻醉大鼠, 剖腹后作門靜脈插管, 剪斷下腔靜脈。
用D2 Hank s 液快速灌流以沖去殘血, 灌速 30 -
40m l? m in, 約10m in 后換含0105%膠原酶的Hank s
液灌流, 灌速5m l? m in, 灌流10m in 左右。待肝臟
失去彈性, 肝包膜腫脹后, 取下肝臟, 輕輕撕去包
膜, 將肝細(xì)胞分散于預(yù)冷的Hank s 液中, 200 目濾網(wǎng)
濾過, 離心清洗三次 (600rpm , 40s, 800rpm , 50s
和1000rpm , 60s) , 將肝細(xì)胞懸浮于 5%小牛血清
(56℃, 30m in 補(bǔ)體滅活) 的RPM I21640 的培養(yǎng)液中
(RPM I21640 培養(yǎng)基, 青霉素 100U? m l, 鏈霉素
100Lg? m l, 胰島素10- 8
mo l? L , 地塞米松10- 6
mo l?
L )。用 014%臺(tái)盼藍(lán)排除法測(cè)細(xì)胞存活率, 達(dá)90%
以上者用于實(shí)驗(yàn)。調(diào)細(xì)胞密度為2×105
細(xì)胞? m l, 接
種于24 孔細(xì)胞培養(yǎng)板 (Co star) 中, 置于飽和濕度,37℃及5% CO 2 的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
114 CCl4 損傷法[5 ]
細(xì)胞接種培養(yǎng)18- 20h 后, 換以含 r2 hHGF 的
無血清RPM I21640 培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24h, 加入20%
CCl4 乙醇溶液, CCl4 終濃度15mmo l? L。 40m in 后測(cè)
定培養(yǎng)液中的丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶 (AL T )、K+
漏出水平。
115 ALT、K+
漏出的測(cè)定
取染毒后培養(yǎng)液500Ll, 離心 (500rpm , 5m in) ,留上清。用Beckm an system E2A 離子分析儀 (美
國(guó))測(cè)定上清液中K+
濃度, 以mmo l? L 表示; 用A b2
bo t t CCxê 型生化分析儀 (美國(guó)) 測(cè)定上清液中
AL T 活力, 以U? L 表示。
116 統(tǒng)計(jì)處理
各組數(shù)據(jù)以x q±s 表示, P 值經(jīng) t 檢驗(yàn)。
2 結(jié)果
211 r-hHGF 對(duì)CCl4 染毒肝細(xì)胞存活率的影響
822 Ch in J App l Physio l 1997; 13 (3)
X 國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目 (№. 39470275)
1996- 10- 14 收稿 1997- 3- 3 修回實(shí)驗(yàn)中將培養(yǎng)肝細(xì)胞分為四組: 對(duì)照組 (PBS
組和 r2 hHGF 組) , 染毒組 (CCl4 15mmo l? L ) , 保護(hù)
組 ( r2 hHGF 5ng? m l+ CCl4 15mmo l? L )。結(jié)果表明,CCl4 染毒后細(xì)胞存活率較對(duì)照組顯著降低 (P <
0101, n= 6) ; 而r2 hHGF 可明顯降低CCl4 致細(xì)胞死
亡率, 使其存活率升高 (P < 0101, n= 6)。
Tab1 Effect of r2 hHGF on the viability and the leakage
of int racellular po tassium of the cultured
hepatocytes expo sed to CCl4
V iability (% ) K+ (mmo l? L )
n 6 6
PBS 92±2 5113±0103
r2 hHGF (5ng? m l) 94±1 5120±0102
CCl4 (15mmo l? L ) 57±6+ + 5195±0111+ + +
r2 hHGF (5ng? m l) +
CCl4 (15mmo l? L )
72±63 3
5167±01113 3
+ +
P < 0101,+ + + P < 01001 compared w ith the PBS
group; 3 3
P < 0101, compared w ith the CCl4 group.
212 r-hHGF 對(duì)CCl4 染毒肝細(xì)胞ALT 漏出的影響
按上述四組(n= 6) , 分別測(cè)定細(xì)胞培養(yǎng)液AL T
的漏出量 ......
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