放線共生放線桿菌的白細(xì)胞毒素
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中國(guó)微生態(tài)學(xué)雜志
1999年第11卷第3期Vol.11No.3 1999
放線共生放線桿菌的白細(xì)胞毒素
吳波 章錦才
關(guān)鍵詞：放線共生放線桿菌(A.a) 白細(xì)胞毒素(Ltx) 基因 牙周病
放線共生放線桿菌(簡(jiǎn)稱(chēng)A.a)是早發(fā)性牙周炎(EOP)尤其是局限性青少年牙周炎(LJP)的重要致病菌。在A.a的各種毒力因子中[1]，白細(xì)胞毒素(Ltx)得到了廣泛關(guān)注。不同的A.a株產(chǎn)生Ltx的能力不同。高毒力株JP2生成的Ltx是低毒力株652的10-20倍[1]，這種顯著的差異對(duì)A.a的致病力有著決定性意義[2]。牙周病變部位的A.a分離株所產(chǎn)生的Ltx遠(yuǎn)高于健康部位的分離株[2]。43-75%的牙周病變部位的A.a分離株可產(chǎn)生Ltx，即Ltx+，而80%以上的健康人分離株則不具備這種能力，即Ltx-[3]。JP2樣高毒力A.a株僅在LJP中可分離到，在健康個(gè)體或成人型牙周炎(AP)中只發(fā)現(xiàn)652樣低毒力株[4]。為進(jìn)一步了解A.a的致病機(jī)理，本文綜述了A.a的Ltx的分子特征及作用機(jī)理。
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1 概 述
Ltx屬于RTX毒素家族的一員。RTX是G-致病菌產(chǎn)生的大分子量(100，000-110，000)，Ca2+依賴(lài)性細(xì)胞穿孔毒素[5]，包括大腸桿菌(Escherichiacoli)的α溶血素，胸膜肺炎放線桿菌(A.pleuropneumoniae)的溶血素，菊屬歐文菌(Erwiniachrysamthemi)的金屬蛋白酶等[3]。RTX成員的基因組成相仿，4個(gè)基因按轉(zhuǎn)錄順序C，A，B，D排列構(gòu)成操縱子。A是結(jié)構(gòu)基因，C編碼激活毒素的蛋白，B、D的基因產(chǎn)物與毒素的轉(zhuǎn)運(yùn)定位有關(guān)[6]。
2 Ltx的蛋白組成和功能
2.1 Itx基因產(chǎn)物
Itx的操縱也由C，A，B，D4個(gè)基因組成基因產(chǎn)物分別發(fā)揮特定作用。根據(jù)氨基酸序列將ltxA的基因產(chǎn)物分為4個(gè)區(qū)域：N端、中心區(qū)、重復(fù)區(qū)、C端。
, 百拇醫(yī)藥
N端(殘基1-408)：由疏水和親水基團(tuán)交替組成。二級(jí)結(jié)構(gòu)中包含22個(gè)α螺旋，其中有2個(gè)疏水基團(tuán)和5個(gè)與跨膜和成孔相關(guān)的兩歧性螺旋。該區(qū)的變異導(dǎo)致ltx毒性喪失，提示N端與毒素和靶細(xì)胞膜的相互作用有關(guān)。
中心區(qū)(殘基409-729)：包含大量的親水基團(tuán)。
重復(fù)區(qū)(殘基730-900)：由9個(gè)氨基酸GGXGXDXUX(X是任一氨基酸，U可為L(zhǎng)，I，U，W，Y或F之一)前后重復(fù)而成。
C端(殘基901-1055)：該區(qū)的缺失造成毒素在胞漿內(nèi)潴留，所以C端和分泌蛋白相關(guān)[7]。C端的末124個(gè)氨基酸與RTX其余成員截然不同，并且C端還有4個(gè)半胱氨酸，這也是RTX中獨(dú)一無(wú)二的。C端對(duì)RTX的分泌必不可少，因而C端在結(jié)構(gòu)上的獨(dú)特之處使A.a的Ltx的分泌轉(zhuǎn)運(yùn)有別于RTX的其他毒素[7]。
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上述4區(qū)中與Ltx的種特異性相關(guān)部分是殘基688-941。如將該殘基的基因嵌合入溶血性巴斯菌(Pasteurellhaemolytica)的相應(yīng)部分，溶血性巴斯菌的白細(xì)胞毒素發(fā)生種特異性變異，使只殺傷牛靶細(xì)菌細(xì)胞的溶血性巴斯菌的白細(xì)胞毒素可殺傷人靶細(xì)胞。該區(qū)由14個(gè)前后重復(fù)的GGXGXDXUX構(gòu)成。已明確綠膿假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)這種重復(fù)區(qū)的三維結(jié)構(gòu)為平行的β片層狀構(gòu)型，其中GGXGXDXUX形成連續(xù)的右手螺旋β轉(zhuǎn)折。重復(fù)區(qū)具有如下特點(diǎn)：1原核生物中，這種GGXGXD序列屬RTX和某些酶(如金屬蛋白酶)特有：2包含重復(fù)區(qū)的蛋白質(zhì)通過(guò)分泌蛋白如B、D的基因產(chǎn)物而不是大多數(shù)細(xì)胞蛋白采取的經(jīng)典信號(hào)系統(tǒng)轉(zhuǎn)移至膜，說(shuō)明重復(fù)區(qū)與一種新的分泌過(guò)程有關(guān)[7]。除形成β轉(zhuǎn)折外，GGXGXD還構(gòu)成一系列Ca2+結(jié)合點(diǎn)。用同位素標(biāo)記的Ca2+檢測(cè)發(fā)現(xiàn)Ltx對(duì)Ca2+的親和力為10-7M。細(xì)菌胞漿內(nèi)Ca2+水平低，Ltx的Ca2+結(jié)合點(diǎn)未被占據(jù)，因而處于彈性狀態(tài)，便于向膜的移位。一旦分泌至胞外，Ca2+濃度上升，結(jié)合位點(diǎn)飽和，Ltx則形成有細(xì)胞毒作用的三維結(jié)構(gòu)C[7，8]。相鄰兩個(gè)重復(fù)區(qū)末端的X之間構(gòu)成β鏈，連接前后兩個(gè)β轉(zhuǎn)折。
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ltxA的基因產(chǎn)物pI值在8.2至9.7之間[9，10]，這種高pH值可能與靶細(xì)胞特異性和毒素的轉(zhuǎn)運(yùn)分泌有關(guān)。A.a感染位點(diǎn)pH值常在8.0以上，所以這種異乎尋常的pI可能還與A.a入侵牙周袋有一定聯(lián)系[10]。
2.2 ltxC基因產(chǎn)物
ltxC與RTX其余成員的相應(yīng)基因至少有52%的同源性。RTX的激活需要C基因產(chǎn)物發(fā)揮作用。大腸桿菌的溶血素須經(jīng)翻譯后的修飾才具有生物活性，其中脂肪酸酰化激活過(guò)程需要溶血素C基因產(chǎn)物和另一種�；d體蛋白參與。ltxC的產(chǎn)物可能與溶血素C作用相似[7]。
2.3 ltxB、D基因產(chǎn)物
在B、D基因產(chǎn)物參與下，ltx通過(guò)非肽依賴(lài)的信號(hào)系統(tǒng)轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞表面，與核酸以離子的形式結(jié)合[7，9]。ltxB-、D-的變異株ltx水平可下降5倍以上，這種變異株內(nèi)ltxA和mRNA均無(wú)改變，之所以下降可能是ltx異位的間接結(jié)果[2]。
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3 Ltx水平的決定因素
A.a的不同分離株合成Ltx的能力差別頗大。如將JP2生成Ltx的水平定為100%，則Y4產(chǎn)生的Lx僅有10%，33384只有2%。影響Ltx水平的因素較多，可大致分為基因和環(huán)境兩大類(lèi)：
3.1 基因因素
3.1.1 啟動(dòng)子
JP2和652均有C，A，B，D4個(gè)基因，但啟動(dòng)子不同。JP2含有P1、P2兩個(gè)啟動(dòng)子，在ltxC的上游還有一個(gè)小的開(kāi)放閱讀框架(ORF)。P1啟動(dòng)后，ORF、C、A共同轉(zhuǎn)錄一個(gè)4.2Kb的mRNA。ORF在體外可翻譯一條10KDa的蛋白，體內(nèi)作用不明。P2啟動(dòng)后，C、A轉(zhuǎn)錄一個(gè)3.8Kb的mRNA。JP2的啟動(dòng)子還能使C，A，B，D轉(zhuǎn)錄一個(gè)8Kb的mRNA，但起點(diǎn)不明。上述3種mRNA中3.8KbmRNA是優(yōu)勢(shì)mRNA。652只有一個(gè)啟動(dòng)子P，啟動(dòng)C，A轉(zhuǎn)錄成3.8Kb的mRNA，也可啟動(dòng)C，A，B，D轉(zhuǎn)錄成極少量的8KbmRNA。與JP2的ORF相比，652的ORF多530bp，因而652ORF不與ltx的操縱子共同轉(zhuǎn)錄，或者這額外的530bp使ltx啟動(dòng)子與C，A，B，D分離，致ltx形成無(wú)效轉(zhuǎn)錄。JP2由于具有兩個(gè)啟動(dòng)子且ORF較小，所以轉(zhuǎn)錄效率遠(yuǎn)高于652。ltx形成兩套啟動(dòng)子的機(jī)制還不為人所知，推測(cè)JP2可能由652丟失這530bp之后轉(zhuǎn)化而來(lái)。Brogan等對(duì)JP2和652之外的15個(gè)A.a分離株的啟動(dòng)子分析后發(fā)現(xiàn)：?jiǎn)?dòng)子與652相似的13株Ltx水平與652相似，與JP2相仿的2株Ltx水平與JP2類(lèi)似，兩種水平的Ltx差別也達(dá)10-20倍。這一現(xiàn)象顯示啟動(dòng)子與Ltx水平密切相關(guān)[11]。
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3.2 轉(zhuǎn)錄
不同Ltx水平的A.a株mRNA水平有差異。Spitzn-agel按mRNA水平對(duì)A.a株排序，結(jié)果如下：JP2>Y4>ATCC29253>ATCC33384，與它們生成Ltx的能力一致[3]。這種直接的聯(lián)系提示Ltx可在轉(zhuǎn)錄水平得到調(diào)節(jié)。推測(cè)C基因產(chǎn)物可能參與ltx轉(zhuǎn)錄的調(diào)節(jié)[3]。但mRNA不能完全解釋Ltx水平的變化，所以Ltx或許還受到轉(zhuǎn)錄后相關(guān)蛋白的調(diào)節(jié)。
3.2 環(huán)境因素
3.2.1 生長(zhǎng)周期
Ltx的mRNA水平在生長(zhǎng)周期中發(fā)生顯著變化。對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期mRNA水平上升，進(jìn)入靜止期則明顯下降。提示環(huán)境刺激將通過(guò)生長(zhǎng)周期的影響而改變Ltx水平。
3.2.2 培養(yǎng)條件
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Kolodrubetz用β一半乳糖苷酶與JP2形成嵌合子AAM17，發(fā)現(xiàn)Ltx的產(chǎn)量在厭氧條件下是有氧環(huán)境中的3-4倍，而與Fe離子濃度無(wú)關(guān)[2]。Ohta將Ltx-ATCC33384在化學(xué)恒定器培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)有活性的Ltx生成。301-6在厭氧，pH=7.0的果糖培養(yǎng)基內(nèi)生長(zhǎng)，無(wú)明顯Ltx生成。在牙周袋這種獨(dú)特的微環(huán)境內(nèi)，pH值、氧壓、營(yíng)養(yǎng)獲得性、細(xì)胞間的相互作用都構(gòu)成影響A.a毒力因子表達(dá)的環(huán)境因素[9]。
4 Ltx對(duì)靶細(xì)胞的作用
A.a的Ltx是RTX家族中靶細(xì)胞特異性極高的毒素，僅作用于人PMN，巨噬細(xì)胞以及一些高等靈長(zhǎng)類(lèi)的靶細(xì)胞。Rabie報(bào)道A.a的Ltx對(duì)淋巴細(xì)胞有非致死效應(yīng)[13]，Simpson認(rèn)為這種效應(yīng)與時(shí)間、溫度相關(guān)[14]。Mangan發(fā)現(xiàn)A.a的Ltx對(duì)人淋巴細(xì)胞具有時(shí)間、濃度依賴(lài)的殺傷作用，Ltx>=10ng/ml時(shí)即有細(xì)胞死亡，100ng/ml，24hr,50%的T細(xì)胞死亡[12]。
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A.aLtx之所以能產(chǎn)生插膜成孔的破壞作用在于它可穩(wěn)定地以?xún)煞N狀態(tài)存在：水溶相和插膜相。兩相間的轉(zhuǎn)換需要發(fā)生結(jié)構(gòu)改變，有可能通過(guò)一個(gè)部分展開(kāi)的球狀可溶媒介物。兩相轉(zhuǎn)換必須跨越高能障礙，其意義在于自發(fā)狀況下不發(fā)生轉(zhuǎn)換，更重要的是特異性的靶細(xì)胞與Ltx結(jié)合之后展開(kāi)球狀媒介物的部分折疊，降低能量障礙，從而保證了靶細(xì)胞特異性。轉(zhuǎn)換受到多種因素的影響�？扇苄郧蝮w的彈性能增加插膜區(qū)疏水核心的可達(dá)性，使之易與膜接觸。插膜區(qū)的層狀結(jié)構(gòu)允許螺旋層在膜表面擴(kuò)展，僅發(fā)生局部構(gòu)造的改變而不破壞螺旋本身[7]。
Mangan研究表明A.aLtx可通過(guò)類(lèi)似細(xì)胞壞死和程序性細(xì)胞死亡(PCD)兩種方式殺傷T細(xì)胞。發(fā)生壞死或PCD與膜損害的速度和過(guò)程有關(guān)�？於氐膿p害則出現(xiàn)壞死，輕而慢則發(fā)生PCD。10-100ng/mlLtx可在T細(xì)胞內(nèi)造成最大量的DNA片段(PCD的標(biāo)志)，Ltx>100ng/ml，DNA片段的量不變或下降，說(shuō)明低濃度的Ltx引發(fā)PCD，高濃度則以壞死為主。Ltx造成DNA片段的機(jī)制不明，Ltx可能直接作為核酶，或激活內(nèi)源性核酶[12]。Ltx介導(dǎo)的溶解涉及陽(yáng)離子選擇的孔道的快速形成，最終使靶細(xì)胞滲透性溶解[11]。RTX的另一成員A.pleuropneumoniae的溶血素在紅細(xì)胞形成的孔徑約2nm，孔道導(dǎo)體水平約350-400ps，具有典型的跨膜通道特性[15]。RTX各毒素作用機(jī)制相似，A.aLtx形成的孔道可能具有類(lèi)似特點(diǎn)。
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A.aLtx可使人PMN、巨噬細(xì)胞、T細(xì)胞發(fā)生PCD或壞死，即A.a能在牙周病變區(qū)損害細(xì)胞免疫和體液免疫，這與A.a的致病性關(guān)系密切[12]。
目前對(duì)Ltx結(jié)構(gòu)和功能的了解有助于認(rèn)識(shí)牙周病的病理過(guò)程并在牙周病治療中采取相應(yīng)措施，如利用不同A.a株Ltx水平不同，選擇Ltx-株作適當(dāng)處理后植入Ltx+病變位點(diǎn)使無(wú)毒株與有毒株形成生態(tài)拮抗，達(dá)到抗菌治療難以得到的效果。但對(duì)Ltx仍有許多未明了之處，如Ltx發(fā)生兩相轉(zhuǎn)換的關(guān)鍵因子是什么，Ltx以何種方式識(shí)別靶細(xì)胞，除C、A、B、D之外，是否還有別的基因影響Ltx的生成、分泌、定位，ORF作用何在等等，均有待進(jìn)一步的探索。
作者單位：華西醫(yī)大口腔醫(yī)學(xué)院口腔內(nèi)科
參考文獻(xiàn)
[1]Taylor PF et al. J Priodontol. 1996; 67(3 Supplement): 291-297
, 百拇醫(yī)藥
[2]Kolodrubetz D.J Priodontol. 1996; 67(3 Supplement): 309-317
[3]Spilznagel J JR et al. Infect Immun. 1991; 59(4): 1394-1401
[4]Zambon JJ et al. J Priodontol. 1996; 67(3 Supplement): 282-290
[5]Strathdee CA et al. J Bacteriol. 1989; 171(3): 916-921
[6]Mcwhinney DR et al. J Bacteriol. 1992; 174(1): 291-297
[7]Lally ET et al. J Priodontol. 1996; 67(3 Supplement): 298-308
, 百拇醫(yī)藥
[8]Lally ET et al J Bio Chem. 1994; 269(49): 31289-31295
[9]Ohta H et al. Infect Immun. 1993; 61(11):4878-4883
[10]Kraig E et al. Infect Immun. 1990; 58(4): 920-929
[11]Brogan JM et al. Infect Immun. 1994; 62(2): 501-508
[12]Mangan DF et al. Infect Immun. 1991; 59(9): 3267-3273
[13]Rabie G et al. Infect Immun. 1988; 56(1): 122-127
[14]Simpson DI et al. Infect Immun. 1988; 56(5): 1162
[15]Lalonde G et al. J Bio Chem. 1989; 264(23): 13559-13564
(收稿日期：1998-09-12), 百拇醫(yī)藥
放線共生放線桿菌的白細(xì)胞毒素
吳波 章錦才
關(guān)鍵詞：放線共生放線桿菌(A.a) 白細(xì)胞毒素(Ltx) 基因 牙周病
放線共生放線桿菌(簡(jiǎn)稱(chēng)A.a)是早發(fā)性牙周炎(EOP)尤其是局限性青少年牙周炎(LJP)的重要致病菌。在A.a的各種毒力因子中[1]，白細(xì)胞毒素(Ltx)得到了廣泛關(guān)注。不同的A.a株產(chǎn)生Ltx的能力不同。高毒力株JP2生成的Ltx是低毒力株652的10-20倍[1]，這種顯著的差異對(duì)A.a的致病力有著決定性意義[2]。牙周病變部位的A.a分離株所產(chǎn)生的Ltx遠(yuǎn)高于健康部位的分離株[2]。43-75%的牙周病變部位的A.a分離株可產(chǎn)生Ltx，即Ltx+，而80%以上的健康人分離株則不具備這種能力，即Ltx-[3]。JP2樣高毒力A.a株僅在LJP中可分離到，在健康個(gè)體或成人型牙周炎(AP)中只發(fā)現(xiàn)652樣低毒力株[4]。為進(jìn)一步了解A.a的致病機(jī)理，本文綜述了A.a的Ltx的分子特征及作用機(jī)理。
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1 概 述
Ltx屬于RTX毒素家族的一員。RTX是G-致病菌產(chǎn)生的大分子量(100，000-110，000)，Ca2+依賴(lài)性細(xì)胞穿孔毒素[5]，包括大腸桿菌(Escherichiacoli)的α溶血素，胸膜肺炎放線桿菌(A.pleuropneumoniae)的溶血素，菊屬歐文菌(Erwiniachrysamthemi)的金屬蛋白酶等[3]。RTX成員的基因組成相仿，4個(gè)基因按轉(zhuǎn)錄順序C，A，B，D排列構(gòu)成操縱子。A是結(jié)構(gòu)基因，C編碼激活毒素的蛋白，B、D的基因產(chǎn)物與毒素的轉(zhuǎn)運(yùn)定位有關(guān)[6]。
2 Ltx的蛋白組成和功能
2.1 Itx基因產(chǎn)物
Itx的操縱也由C，A，B，D4個(gè)基因組成基因產(chǎn)物分別發(fā)揮特定作用。根據(jù)氨基酸序列將ltxA的基因產(chǎn)物分為4個(gè)區(qū)域：N端、中心區(qū)、重復(fù)區(qū)、C端。
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N端(殘基1-408)：由疏水和親水基團(tuán)交替組成。二級(jí)結(jié)構(gòu)中包含22個(gè)α螺旋，其中有2個(gè)疏水基團(tuán)和5個(gè)與跨膜和成孔相關(guān)的兩歧性螺旋。該區(qū)的變異導(dǎo)致ltx毒性喪失，提示N端與毒素和靶細(xì)胞膜的相互作用有關(guān)。
中心區(qū)(殘基409-729)：包含大量的親水基團(tuán)。
重復(fù)區(qū)(殘基730-900)：由9個(gè)氨基酸GGXGXDXUX(X是任一氨基酸，U可為L(zhǎng)，I，U，W，Y或F之一)前后重復(fù)而成。
C端(殘基901-1055)：該區(qū)的缺失造成毒素在胞漿內(nèi)潴留，所以C端和分泌蛋白相關(guān)[7]。C端的末124個(gè)氨基酸與RTX其余成員截然不同，并且C端還有4個(gè)半胱氨酸，這也是RTX中獨(dú)一無(wú)二的。C端對(duì)RTX的分泌必不可少，因而C端在結(jié)構(gòu)上的獨(dú)特之處使A.a的Ltx的分泌轉(zhuǎn)運(yùn)有別于RTX的其他毒素[7]。
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上述4區(qū)中與Ltx的種特異性相關(guān)部分是殘基688-941。如將該殘基的基因嵌合入溶血性巴斯菌(Pasteurellhaemolytica)的相應(yīng)部分，溶血性巴斯菌的白細(xì)胞毒素發(fā)生種特異性變異，使只殺傷牛靶細(xì)菌細(xì)胞的溶血性巴斯菌的白細(xì)胞毒素可殺傷人靶細(xì)胞。該區(qū)由14個(gè)前后重復(fù)的GGXGXDXUX構(gòu)成。已明確綠膿假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)這種重復(fù)區(qū)的三維結(jié)構(gòu)為平行的β片層狀構(gòu)型，其中GGXGXDXUX形成連續(xù)的右手螺旋β轉(zhuǎn)折。重復(fù)區(qū)具有如下特點(diǎn)：1原核生物中，這種GGXGXD序列屬RTX和某些酶(如金屬蛋白酶)特有：2包含重復(fù)區(qū)的蛋白質(zhì)通過(guò)分泌蛋白如B、D的基因產(chǎn)物而不是大多數(shù)細(xì)胞蛋白采取的經(jīng)典信號(hào)系統(tǒng)轉(zhuǎn)移至膜，說(shuō)明重復(fù)區(qū)與一種新的分泌過(guò)程有關(guān)[7]。除形成β轉(zhuǎn)折外，GGXGXD還構(gòu)成一系列Ca2+結(jié)合點(diǎn)。用同位素標(biāo)記的Ca2+檢測(cè)發(fā)現(xiàn)Ltx對(duì)Ca2+的親和力為10-7M。細(xì)菌胞漿內(nèi)Ca2+水平低，Ltx的Ca2+結(jié)合點(diǎn)未被占據(jù)，因而處于彈性狀態(tài)，便于向膜的移位。一旦分泌至胞外，Ca2+濃度上升，結(jié)合位點(diǎn)飽和，Ltx則形成有細(xì)胞毒作用的三維結(jié)構(gòu)C[7，8]。相鄰兩個(gè)重復(fù)區(qū)末端的X之間構(gòu)成β鏈，連接前后兩個(gè)β轉(zhuǎn)折。
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ltxA的基因產(chǎn)物pI值在8.2至9.7之間[9，10]，這種高pH值可能與靶細(xì)胞特異性和毒素的轉(zhuǎn)運(yùn)分泌有關(guān)。A.a感染位點(diǎn)pH值常在8.0以上，所以這種異乎尋常的pI可能還與A.a入侵牙周袋有一定聯(lián)系[10]。
2.2 ltxC基因產(chǎn)物
ltxC與RTX其余成員的相應(yīng)基因至少有52%的同源性。RTX的激活需要C基因產(chǎn)物發(fā)揮作用。大腸桿菌的溶血素須經(jīng)翻譯后的修飾才具有生物活性，其中脂肪酸酰化激活過(guò)程需要溶血素C基因產(chǎn)物和另一種�；d體蛋白參與。ltxC的產(chǎn)物可能與溶血素C作用相似[7]。
2.3 ltxB、D基因產(chǎn)物
在B、D基因產(chǎn)物參與下，ltx通過(guò)非肽依賴(lài)的信號(hào)系統(tǒng)轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞表面，與核酸以離子的形式結(jié)合[7，9]。ltxB-、D-的變異株ltx水平可下降5倍以上，這種變異株內(nèi)ltxA和mRNA均無(wú)改變，之所以下降可能是ltx異位的間接結(jié)果[2]。
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3 Ltx水平的決定因素
A.a的不同分離株合成Ltx的能力差別頗大。如將JP2生成Ltx的水平定為100%，則Y4產(chǎn)生的Lx僅有10%，33384只有2%。影響Ltx水平的因素較多，可大致分為基因和環(huán)境兩大類(lèi)：
3.1 基因因素
3.1.1 啟動(dòng)子
JP2和652均有C，A，B，D4個(gè)基因，但啟動(dòng)子不同。JP2含有P1、P2兩個(gè)啟動(dòng)子，在ltxC的上游還有一個(gè)小的開(kāi)放閱讀框架(ORF)。P1啟動(dòng)后，ORF、C、A共同轉(zhuǎn)錄一個(gè)4.2Kb的mRNA。ORF在體外可翻譯一條10KDa的蛋白，體內(nèi)作用不明。P2啟動(dòng)后，C、A轉(zhuǎn)錄一個(gè)3.8Kb的mRNA。JP2的啟動(dòng)子還能使C，A，B，D轉(zhuǎn)錄一個(gè)8Kb的mRNA，但起點(diǎn)不明。上述3種mRNA中3.8KbmRNA是優(yōu)勢(shì)mRNA。652只有一個(gè)啟動(dòng)子P，啟動(dòng)C，A轉(zhuǎn)錄成3.8Kb的mRNA，也可啟動(dòng)C，A，B，D轉(zhuǎn)錄成極少量的8KbmRNA。與JP2的ORF相比，652的ORF多530bp，因而652ORF不與ltx的操縱子共同轉(zhuǎn)錄，或者這額外的530bp使ltx啟動(dòng)子與C，A，B，D分離，致ltx形成無(wú)效轉(zhuǎn)錄。JP2由于具有兩個(gè)啟動(dòng)子且ORF較小，所以轉(zhuǎn)錄效率遠(yuǎn)高于652。ltx形成兩套啟動(dòng)子的機(jī)制還不為人所知，推測(cè)JP2可能由652丟失這530bp之后轉(zhuǎn)化而來(lái)。Brogan等對(duì)JP2和652之外的15個(gè)A.a分離株的啟動(dòng)子分析后發(fā)現(xiàn)：?jiǎn)?dòng)子與652相似的13株Ltx水平與652相似，與JP2相仿的2株Ltx水平與JP2類(lèi)似，兩種水平的Ltx差別也達(dá)10-20倍。這一現(xiàn)象顯示啟動(dòng)子與Ltx水平密切相關(guān)[11]。
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3.2 轉(zhuǎn)錄
不同Ltx水平的A.a株mRNA水平有差異。Spitzn-agel按mRNA水平對(duì)A.a株排序，結(jié)果如下：JP2>Y4>ATCC29253>ATCC33384，與它們生成Ltx的能力一致[3]。這種直接的聯(lián)系提示Ltx可在轉(zhuǎn)錄水平得到調(diào)節(jié)。推測(cè)C基因產(chǎn)物可能參與ltx轉(zhuǎn)錄的調(diào)節(jié)[3]。但mRNA不能完全解釋Ltx水平的變化，所以Ltx或許還受到轉(zhuǎn)錄后相關(guān)蛋白的調(diào)節(jié)。
3.2 環(huán)境因素
3.2.1 生長(zhǎng)周期
Ltx的mRNA水平在生長(zhǎng)周期中發(fā)生顯著變化。對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期mRNA水平上升，進(jìn)入靜止期則明顯下降。提示環(huán)境刺激將通過(guò)生長(zhǎng)周期的影響而改變Ltx水平。
3.2.2 培養(yǎng)條件
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Kolodrubetz用β一半乳糖苷酶與JP2形成嵌合子AAM17，發(fā)現(xiàn)Ltx的產(chǎn)量在厭氧條件下是有氧環(huán)境中的3-4倍，而與Fe離子濃度無(wú)關(guān)[2]。Ohta將Ltx-ATCC33384在化學(xué)恒定器培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)有活性的Ltx生成。301-6在厭氧，pH=7.0的果糖培養(yǎng)基內(nèi)生長(zhǎng)，無(wú)明顯Ltx生成。在牙周袋這種獨(dú)特的微環(huán)境內(nèi)，pH值、氧壓、營(yíng)養(yǎng)獲得性、細(xì)胞間的相互作用都構(gòu)成影響A.a毒力因子表達(dá)的環(huán)境因素[9]。
4 Ltx對(duì)靶細(xì)胞的作用
A.a的Ltx是RTX家族中靶細(xì)胞特異性極高的毒素，僅作用于人PMN，巨噬細(xì)胞以及一些高等靈長(zhǎng)類(lèi)的靶細(xì)胞。Rabie報(bào)道A.a的Ltx對(duì)淋巴細(xì)胞有非致死效應(yīng)[13]，Simpson認(rèn)為這種效應(yīng)與時(shí)間、溫度相關(guān)[14]。Mangan發(fā)現(xiàn)A.a的Ltx對(duì)人淋巴細(xì)胞具有時(shí)間、濃度依賴(lài)的殺傷作用，Ltx>=10ng/ml時(shí)即有細(xì)胞死亡，100ng/ml，24hr,50%的T細(xì)胞死亡[12]。
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A.aLtx之所以能產(chǎn)生插膜成孔的破壞作用在于它可穩(wěn)定地以?xún)煞N狀態(tài)存在：水溶相和插膜相。兩相間的轉(zhuǎn)換需要發(fā)生結(jié)構(gòu)改變，有可能通過(guò)一個(gè)部分展開(kāi)的球狀可溶媒介物。兩相轉(zhuǎn)換必須跨越高能障礙，其意義在于自發(fā)狀況下不發(fā)生轉(zhuǎn)換，更重要的是特異性的靶細(xì)胞與Ltx結(jié)合之后展開(kāi)球狀媒介物的部分折疊，降低能量障礙，從而保證了靶細(xì)胞特異性。轉(zhuǎn)換受到多種因素的影響�？扇苄郧蝮w的彈性能增加插膜區(qū)疏水核心的可達(dá)性，使之易與膜接觸。插膜區(qū)的層狀結(jié)構(gòu)允許螺旋層在膜表面擴(kuò)展，僅發(fā)生局部構(gòu)造的改變而不破壞螺旋本身[7]。
Mangan研究表明A.aLtx可通過(guò)類(lèi)似細(xì)胞壞死和程序性細(xì)胞死亡(PCD)兩種方式殺傷T細(xì)胞。發(fā)生壞死或PCD與膜損害的速度和過(guò)程有關(guān)�？於氐膿p害則出現(xiàn)壞死，輕而慢則發(fā)生PCD。10-100ng/mlLtx可在T細(xì)胞內(nèi)造成最大量的DNA片段(PCD的標(biāo)志)，Ltx>100ng/ml，DNA片段的量不變或下降，說(shuō)明低濃度的Ltx引發(fā)PCD，高濃度則以壞死為主。Ltx造成DNA片段的機(jī)制不明，Ltx可能直接作為核酶，或激活內(nèi)源性核酶[12]。Ltx介導(dǎo)的溶解涉及陽(yáng)離子選擇的孔道的快速形成，最終使靶細(xì)胞滲透性溶解[11]。RTX的另一成員A.pleuropneumoniae的溶血素在紅細(xì)胞形成的孔徑約2nm，孔道導(dǎo)體水平約350-400ps，具有典型的跨膜通道特性[15]。RTX各毒素作用機(jī)制相似，A.aLtx形成的孔道可能具有類(lèi)似特點(diǎn)。
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A.aLtx可使人PMN、巨噬細(xì)胞、T細(xì)胞發(fā)生PCD或壞死，即A.a能在牙周病變區(qū)損害細(xì)胞免疫和體液免疫，這與A.a的致病性關(guān)系密切[12]。
目前對(duì)Ltx結(jié)構(gòu)和功能的了解有助于認(rèn)識(shí)牙周病的病理過(guò)程并在牙周病治療中采取相應(yīng)措施，如利用不同A.a株Ltx水平不同，選擇Ltx-株作適當(dāng)處理后植入Ltx+病變位點(diǎn)使無(wú)毒株與有毒株形成生態(tài)拮抗，達(dá)到抗菌治療難以得到的效果。但對(duì)Ltx仍有許多未明了之處，如Ltx發(fā)生兩相轉(zhuǎn)換的關(guān)鍵因子是什么，Ltx以何種方式識(shí)別靶細(xì)胞，除C、A、B、D之外，是否還有別的基因影響Ltx的生成、分泌、定位，ORF作用何在等等，均有待進(jìn)一步的探索。
作者單位：華西醫(yī)大口腔醫(yī)學(xué)院口腔內(nèi)科
參考文獻(xiàn)
[1]Taylor PF et al. J Priodontol. 1996; 67(3 Supplement): 291-297
, 百拇醫(yī)藥
[2]Kolodrubetz D.J Priodontol. 1996; 67(3 Supplement): 309-317
[3]Spilznagel J JR et al. Infect Immun. 1991; 59(4): 1394-1401
[4]Zambon JJ et al. J Priodontol. 1996; 67(3 Supplement): 282-290
[5]Strathdee CA et al. J Bacteriol. 1989; 171(3): 916-921
[6]Mcwhinney DR et al. J Bacteriol. 1992; 174(1): 291-297
[7]Lally ET et al. J Priodontol. 1996; 67(3 Supplement): 298-308
, 百拇醫(yī)藥
[8]Lally ET et al J Bio Chem. 1994; 269(49): 31289-31295
[9]Ohta H et al. Infect Immun. 1993; 61(11):4878-4883
[10]Kraig E et al. Infect Immun. 1990; 58(4): 920-929
[11]Brogan JM et al. Infect Immun. 1994; 62(2): 501-508
[12]Mangan DF et al. Infect Immun. 1991; 59(9): 3267-3273
[13]Rabie G et al. Infect Immun. 1988; 56(1): 122-127
[14]Simpson DI et al. Infect Immun. 1988; 56(5): 1162
[15]Lalonde G et al. J Bio Chem. 1989; 264(23): 13559-13564
(收稿日期：1998-09-12), 百拇醫(yī)藥
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