人化SCID鼠的建立及在人單抗制備中的應(yīng)用
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國外醫(yī)學(xué)免疫學(xué)分冊 2000年第23卷第1期
人化SCID鼠的建立及在人單抗制備中的應(yīng)用
第一軍醫(yī)大學(xué)熱帶病研究室，廣東廣州 510515 吳嵐曉
摘 要 人化聯(lián)合免疫缺陷鼠(hu-SCIK mice)可作為人類免疫系統(tǒng)的模型，在檢測人體免疫應(yīng)答、揭示HIV感染、腫瘤以及自身免疫系統(tǒng)疾病等的發(fā)病機理和人單克隆抗體的制備等領(lǐng)域中得以廣泛應(yīng)用。本文概述了人化SCID鼠的構(gòu)建過程，并總結(jié)了其在制備人單克隆抗體中的應(yīng)用進(jìn)展。
關(guān)鍵詞：人化SCID鼠 構(gòu)建 人單克隆抗體
SCID鼠，全稱為聯(lián)合免疫缺陷鼠(severe combined immunodeficiency mice)。1983年由Bosma等[1]人培育成功，是一種淋巴細(xì)胞分化過程嚴(yán)重受損的突變小鼠，因其抗原受體基因重組異常，T、B淋巴細(xì)胞不能發(fā)育成熟，機體的體液和細(xì)胞免疫功能均缺陷，難檢測到免疫球蛋白的分泌。這樣，SCID鼠就成為異種移植的良好活體承載系統(tǒng)。1988年Moiser等[2]首次將人體外周血淋細(xì)胞(hu-PBL)移植入SCID鼠的皮下及腎包膜下，建立了人化的SCID(hu-PBL-SCID mice)，使一個有功能的人體免疫系統(tǒng)在SCID鼠內(nèi)長期存活，在SCID鼠體內(nèi)進(jìn)行人免疫功能重建獲初步成功，解決了長期以來動物模型不能確切反映人體免疫系統(tǒng)的特點，研究人體免疫應(yīng)答僅限于體外實驗的難題。人化后的SCID鼠在人類淋巴細(xì)胞的發(fā)生發(fā)育、器官移植免疫[3]、腫瘤免疫[4]、AIDS的防治[5]、疫苗檢測[6]及人單抗的制備等研究領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。
, 百拇醫(yī)藥
人化SCID鼠的構(gòu)建方法是將用泛影葡胺-聚蔗糖(ficoll-hypaque)人淋巴細(xì)胞分離液分離得到和人外周淋巴細(xì)胞生理鹽水懸液注入合格的SCID鼠腹腔，分別于注射4周和12周后采血檢測其血清中人IgG含量。目前認(rèn)為以2×107~4×107個人體外周血淋巴細(xì)胞腹腔植入SCID鼠，為建立具人化免疫功能SCID鼠的較佳方案，一般在移植后10周左右鼠血清中的人IgG含量可升至最高水平達(dá)1000μg/ml以上，接近正常人血清的水平。在構(gòu)建人化SCID鼠時有兩個最基本的問題，即SCID鼠的無菌飼養(yǎng)條件和其合格性的保證。國外有文獻(xiàn)報道，飼養(yǎng)時在飲水中添加磺胺類藥物可以維持SCID鼠的無菌條件�？山�(jīng)鼠尾采血獲血清進(jìn)行鼠IgG含量測定，是SCID鼠質(zhì)量鑒定普遍采用的方法，經(jīng)監(jiān)測血清中鼠IgG含量低于5μg/ml者為合格[7]。有時SCID鼠會出現(xiàn)自身免疫功能恢復(fù)即“滲漏”(leaky)的現(xiàn)象，必須篩選掉。
人化SCID鼠構(gòu)建成功后，具有功能的人體免疫系統(tǒng)能在SCID鼠體內(nèi)長期穩(wěn)定地存在。免疫重建的人化SCID鼠體內(nèi)存在各類人免疫球蛋白，其外周血及淋巴器官中可檢出人淋巴細(xì)胞，且其人淋巴細(xì)胞可在小鼠體內(nèi)對破傷風(fēng)毒素、乙肝核心抗原等形成原發(fā)性或繼發(fā)性的免疫反應(yīng)，說明有功能的人原抗原提呈細(xì)胞、輔助性T細(xì)胞和B細(xì)胞在人化SCID鼠內(nèi)能長期存活[8]。一些小鼠的脾檢出的人淋巴細(xì)胞可達(dá)80%~90%，移植入SCID鼠體內(nèi)的人外周血淋巴細(xì)胞能在SCID鼠體內(nèi)大量增殖并存活至少六個月 ，而并不發(fā)生異種移植物抗宿主疾病(XGVH disease)。T、B細(xì)胞在移植后5天可以從小鼠體內(nèi)檢出，在鼠的脾及淋巴結(jié)中存在人淋巴細(xì)胞，在小鼠血漿中可檢測到可溶性人CD8和IL-2受體。在移植后4周，小鼠血清中可檢測到人免疫球蛋白，尤以IgA、IgM濃度較高，而IgG濃度相對較低。在移植早期，腹腔液中的人Ig濃度總體高于血清，在移植后較長時間的4周后，則血清中出現(xiàn)較高濃度的人Ig，提示新增殖的人淋巴細(xì)胞產(chǎn)生了人Ig。同時，在移植后較長時間4周后，均可在其小鼠脾中檢測到人淋巴細(xì)胞，通過間接免疫熒光染色作人淋巴細(xì)胞表面標(biāo)記后，進(jìn)行流式細(xì)胞分析，所檢測到的8種免疫表型人淋巴細(xì)胞亞群均存在[9]。以上結(jié)果均表明人淋巴細(xì)胞移植于SCID鼠后不僅存活，而且出現(xiàn)增殖或重建。但是，人化SCID鼠構(gòu)建模型的研究仍存在著許多問題，主要有：①重構(gòu)建和SCID鼠并非每一只都可達(dá)到各種可檢測到的免疫反應(yīng)，不同實驗室的研究結(jié)果以及同一試驗的不同小鼠個體之間免疫重建的程度存在明顯差異，說明該模型在一定程度上的不穩(wěn)定性；②關(guān)于SCID鼠體內(nèi)的淋巴細(xì)胞是否具有功能，能否形成繼發(fā)或原發(fā)性免疫反應(yīng)的研究結(jié)果不盡統(tǒng)一；③將由不同類型淋巴細(xì)胞組成的移植物移植于SCID鼠，T細(xì)胞易獲免疫重建，分離到的大多數(shù)人T細(xì)胞屬于CD45RO+和HLA-DR+記憶和激活T細(xì)胞。但雖然有高水平的Ig在小鼠外周血得以檢測，活性B細(xì)胞的數(shù)目卻極其有限，因而盡管有來自于記憶B細(xì)胞的繼發(fā)性抗體反應(yīng)產(chǎn)生，卻難以形成原發(fā)性抗體[10]。另外，SCID鼠雖然T、B淋巴細(xì)胞免疫功能缺陷，但在胸腺、脾臟和淋巴結(jié)內(nèi)含有一定數(shù)量的巨噬細(xì)胞，在脾臟和外周血中還可見中性粒細(xì)胞，而且SCID鼠具有正常的NK和LAK細(xì)胞功能[11]，這些特征都是在移植試驗和骨髓干細(xì)胞分化等研究中值得注意的問題。
, 百拇醫(yī)藥
由于SCID鼠體內(nèi)本身所具有的鼠免疫球蛋白含量極低，用于異種單克隆抗體生產(chǎn)，可避免宿主本身免疫球蛋白的污染，建立具人化免疫功能SCID鼠后，SCID鼠能針對抗原產(chǎn)生具保護(hù)作用的人特異性抗體。因此人們在探索人單克隆抗體制備途徑的研究中，設(shè)計建立人化的SCID鼠，使獲取經(jīng)任意預(yù)定抗原免疫的人特異性抗體成為可能。目前已有對EBV( Epstein Barr virus)和HIV-1(human immunodeficenty virus tpye 1)[12]等抗體制備的研究。但植入后的人抗體形成細(xì)胞數(shù)量尚少，活力較弱，且無較合適的免疫增強劑諸如佐劑的配合，使特異性抗體的分泌滴度較低，并且，目前已注意到人化SCID鼠很難對那些外周血淋巴細(xì)胞的供者未接觸的陌生抗原產(chǎn)生免疫應(yīng)答而分泌抗體，供體的免疫經(jīng)歷和免疫狀況是影響人化SCID鼠免疫應(yīng)答能力的重要因素[7，13]。人們還發(fā)現(xiàn)人化SCID鼠對抗原產(chǎn)生特異性抗體能力并不與其人IgG的分泌狀況相平行，這應(yīng)是人外周淋巴細(xì)胞供者個體因素的反映結(jié)果。有些學(xué)者認(rèn)為[3，11]用抗原免疫人化SCID鼠應(yīng)在人體外周淋巴細(xì)胞移植后第一天開始最佳，第一天腹腔注射抗原懸液，每隔兩周重復(fù)一次，第三次重復(fù)后隔一周再加強一次，注射的抗原量隨抗原的種類不同而不同，分別在第二次免疫和第五次免疫后檢測血清中特異性抗體的滴度。
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設(shè)想通過構(gòu)建人化SCID鼠來解決人單克隆抗體制備中不易獲取任意預(yù)定抗原激活的B細(xì)胞及人細(xì)胞融合困難的難題，為人單克隆抗體的研制帶來了新的希望。雖然有成功的例子[13，14]，但從更多的報道來看[13，15]，其中許多環(huán)節(jié)如人外周血淋巴細(xì)胞供者的選擇、人外周血淋巴細(xì)胞的移植數(shù)量和方式、抗原免疫的最佳方案、人化SCID鼠對陌生抗原的免疫應(yīng)答等都有待進(jìn)一步研究[16]。只有當(dāng)經(jīng)抗原免疫后的人源化SCID鼠能產(chǎn)生足夠高滴度的特異性抗體時，將其用于人單克隆抗體制備才具有現(xiàn)實意義。
目前構(gòu)建的人化SCID鼠仍存在許多未解決的問題，可喜的是將人體免疫系統(tǒng)移植到SCID鼠體內(nèi)的這種異種移植是成功的。隨著進(jìn)一步深入的探索和不斷改進(jìn)，我們相信，用人外周血淋巴細(xì)胞構(gòu)建的SCID鼠可以被制成更接近人類本身免疫系統(tǒng)的模型，并將在檢測人體免疫應(yīng)答、揭示HIV感染、腫瘤以及自身免疫系統(tǒng)疾病等的發(fā)病機理，以及人單克隆抗體的制備等領(lǐng)域中得以廣泛應(yīng)用。
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作者簡介：吳嵐曉(1975-)，女(漢族)，福建福州人，第一軍醫(yī)大學(xué)，碩士
審校者：第一軍醫(yī)大學(xué)熱帶病研究室李明
參考文獻(xiàn)
1 Bosma GC et al .Nature ,1985;301:527-530
2 Moiser DE et al .Nature,1988；335:256-259
3 Shiroki R et al .Transplantation,1997;63
4 Nokihara H et al.Int J Cancer,1999;80(5):773-780
, 百拇醫(yī)藥
5 Parren PW et al .AIDS,1995;9(6):1-6
6 Choi JI et al.Infect Immun,1998;66(1):391-393
7 Armstrong N et al .Clin Exp Immunol,1992;90:476-478
8 Steinsvik TE et al .Scand J Immunol,1999;49(1):67-72
9 魏泓，中國實驗動物學(xué)報，1994;2(2):12-14
10 Stallmach AZ.Gastroenterol,1998;36(4):353-355
11 Kim HM et al .J Pharmacol Toxicol Methods,1997;37(2):83-89
, http://www.www.srpcoatings.com
12 Cauduin MC et al .Nat Med,1997;3(12):1389-1393
13 Andrus L et al .J Infect Dis,1998;177(4):889-897
14 Arai K et al .J Immunol Methods,.1998;217(1-2):79-85
15 Martino G et al .Eur J Immunol.1993;23:1023-1027
16 Crow AR et al .Br J Haematol,1999;104(4):919-924, http://www.www.srpcoatings.com
第一軍醫(yī)大學(xué)熱帶病研究室，廣東廣州 510515 吳嵐曉
摘 要 人化聯(lián)合免疫缺陷鼠(hu-SCIK mice)可作為人類免疫系統(tǒng)的模型，在檢測人體免疫應(yīng)答、揭示HIV感染、腫瘤以及自身免疫系統(tǒng)疾病等的發(fā)病機理和人單克隆抗體的制備等領(lǐng)域中得以廣泛應(yīng)用。本文概述了人化SCID鼠的構(gòu)建過程，并總結(jié)了其在制備人單克隆抗體中的應(yīng)用進(jìn)展。
關(guān)鍵詞：人化SCID鼠 構(gòu)建 人單克隆抗體
SCID鼠，全稱為聯(lián)合免疫缺陷鼠(severe combined immunodeficiency mice)。1983年由Bosma等[1]人培育成功，是一種淋巴細(xì)胞分化過程嚴(yán)重受損的突變小鼠，因其抗原受體基因重組異常，T、B淋巴細(xì)胞不能發(fā)育成熟，機體的體液和細(xì)胞免疫功能均缺陷，難檢測到免疫球蛋白的分泌。這樣，SCID鼠就成為異種移植的良好活體承載系統(tǒng)。1988年Moiser等[2]首次將人體外周血淋細(xì)胞(hu-PBL)移植入SCID鼠的皮下及腎包膜下，建立了人化的SCID(hu-PBL-SCID mice)，使一個有功能的人體免疫系統(tǒng)在SCID鼠內(nèi)長期存活，在SCID鼠體內(nèi)進(jìn)行人免疫功能重建獲初步成功，解決了長期以來動物模型不能確切反映人體免疫系統(tǒng)的特點，研究人體免疫應(yīng)答僅限于體外實驗的難題。人化后的SCID鼠在人類淋巴細(xì)胞的發(fā)生發(fā)育、器官移植免疫[3]、腫瘤免疫[4]、AIDS的防治[5]、疫苗檢測[6]及人單抗的制備等研究領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。
, 百拇醫(yī)藥
人化SCID鼠的構(gòu)建方法是將用泛影葡胺-聚蔗糖(ficoll-hypaque)人淋巴細(xì)胞分離液分離得到和人外周淋巴細(xì)胞生理鹽水懸液注入合格的SCID鼠腹腔，分別于注射4周和12周后采血檢測其血清中人IgG含量。目前認(rèn)為以2×107~4×107個人體外周血淋巴細(xì)胞腹腔植入SCID鼠，為建立具人化免疫功能SCID鼠的較佳方案，一般在移植后10周左右鼠血清中的人IgG含量可升至最高水平達(dá)1000μg/ml以上，接近正常人血清的水平。在構(gòu)建人化SCID鼠時有兩個最基本的問題，即SCID鼠的無菌飼養(yǎng)條件和其合格性的保證。國外有文獻(xiàn)報道，飼養(yǎng)時在飲水中添加磺胺類藥物可以維持SCID鼠的無菌條件�？山�(jīng)鼠尾采血獲血清進(jìn)行鼠IgG含量測定，是SCID鼠質(zhì)量鑒定普遍采用的方法，經(jīng)監(jiān)測血清中鼠IgG含量低于5μg/ml者為合格[7]。有時SCID鼠會出現(xiàn)自身免疫功能恢復(fù)即“滲漏”(leaky)的現(xiàn)象，必須篩選掉。
人化SCID鼠構(gòu)建成功后，具有功能的人體免疫系統(tǒng)能在SCID鼠體內(nèi)長期穩(wěn)定地存在。免疫重建的人化SCID鼠體內(nèi)存在各類人免疫球蛋白，其外周血及淋巴器官中可檢出人淋巴細(xì)胞，且其人淋巴細(xì)胞可在小鼠體內(nèi)對破傷風(fēng)毒素、乙肝核心抗原等形成原發(fā)性或繼發(fā)性的免疫反應(yīng)，說明有功能的人原抗原提呈細(xì)胞、輔助性T細(xì)胞和B細(xì)胞在人化SCID鼠內(nèi)能長期存活[8]。一些小鼠的脾檢出的人淋巴細(xì)胞可達(dá)80%~90%，移植入SCID鼠體內(nèi)的人外周血淋巴細(xì)胞能在SCID鼠體內(nèi)大量增殖并存活至少六個月 ，而并不發(fā)生異種移植物抗宿主疾病(XGVH disease)。T、B細(xì)胞在移植后5天可以從小鼠體內(nèi)檢出，在鼠的脾及淋巴結(jié)中存在人淋巴細(xì)胞，在小鼠血漿中可檢測到可溶性人CD8和IL-2受體。在移植后4周，小鼠血清中可檢測到人免疫球蛋白，尤以IgA、IgM濃度較高，而IgG濃度相對較低。在移植早期，腹腔液中的人Ig濃度總體高于血清，在移植后較長時間的4周后，則血清中出現(xiàn)較高濃度的人Ig，提示新增殖的人淋巴細(xì)胞產(chǎn)生了人Ig。同時，在移植后較長時間4周后，均可在其小鼠脾中檢測到人淋巴細(xì)胞，通過間接免疫熒光染色作人淋巴細(xì)胞表面標(biāo)記后，進(jìn)行流式細(xì)胞分析，所檢測到的8種免疫表型人淋巴細(xì)胞亞群均存在[9]。以上結(jié)果均表明人淋巴細(xì)胞移植于SCID鼠后不僅存活，而且出現(xiàn)增殖或重建。但是，人化SCID鼠構(gòu)建模型的研究仍存在著許多問題，主要有：①重構(gòu)建和SCID鼠并非每一只都可達(dá)到各種可檢測到的免疫反應(yīng)，不同實驗室的研究結(jié)果以及同一試驗的不同小鼠個體之間免疫重建的程度存在明顯差異，說明該模型在一定程度上的不穩(wěn)定性；②關(guān)于SCID鼠體內(nèi)的淋巴細(xì)胞是否具有功能，能否形成繼發(fā)或原發(fā)性免疫反應(yīng)的研究結(jié)果不盡統(tǒng)一；③將由不同類型淋巴細(xì)胞組成的移植物移植于SCID鼠，T細(xì)胞易獲免疫重建，分離到的大多數(shù)人T細(xì)胞屬于CD45RO+和HLA-DR+記憶和激活T細(xì)胞。但雖然有高水平的Ig在小鼠外周血得以檢測，活性B細(xì)胞的數(shù)目卻極其有限，因而盡管有來自于記憶B細(xì)胞的繼發(fā)性抗體反應(yīng)產(chǎn)生，卻難以形成原發(fā)性抗體[10]。另外，SCID鼠雖然T、B淋巴細(xì)胞免疫功能缺陷，但在胸腺、脾臟和淋巴結(jié)內(nèi)含有一定數(shù)量的巨噬細(xì)胞，在脾臟和外周血中還可見中性粒細(xì)胞，而且SCID鼠具有正常的NK和LAK細(xì)胞功能[11]，這些特征都是在移植試驗和骨髓干細(xì)胞分化等研究中值得注意的問題。
, 百拇醫(yī)藥
由于SCID鼠體內(nèi)本身所具有的鼠免疫球蛋白含量極低，用于異種單克隆抗體生產(chǎn)，可避免宿主本身免疫球蛋白的污染，建立具人化免疫功能SCID鼠后，SCID鼠能針對抗原產(chǎn)生具保護(hù)作用的人特異性抗體。因此人們在探索人單克隆抗體制備途徑的研究中，設(shè)計建立人化的SCID鼠，使獲取經(jīng)任意預(yù)定抗原免疫的人特異性抗體成為可能。目前已有對EBV( Epstein Barr virus)和HIV-1(human immunodeficenty virus tpye 1)[12]等抗體制備的研究。但植入后的人抗體形成細(xì)胞數(shù)量尚少，活力較弱，且無較合適的免疫增強劑諸如佐劑的配合，使特異性抗體的分泌滴度較低，并且，目前已注意到人化SCID鼠很難對那些外周血淋巴細(xì)胞的供者未接觸的陌生抗原產(chǎn)生免疫應(yīng)答而分泌抗體，供體的免疫經(jīng)歷和免疫狀況是影響人化SCID鼠免疫應(yīng)答能力的重要因素[7，13]。人們還發(fā)現(xiàn)人化SCID鼠對抗原產(chǎn)生特異性抗體能力并不與其人IgG的分泌狀況相平行，這應(yīng)是人外周淋巴細(xì)胞供者個體因素的反映結(jié)果。有些學(xué)者認(rèn)為[3，11]用抗原免疫人化SCID鼠應(yīng)在人體外周淋巴細(xì)胞移植后第一天開始最佳，第一天腹腔注射抗原懸液，每隔兩周重復(fù)一次，第三次重復(fù)后隔一周再加強一次，注射的抗原量隨抗原的種類不同而不同，分別在第二次免疫和第五次免疫后檢測血清中特異性抗體的滴度。
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設(shè)想通過構(gòu)建人化SCID鼠來解決人單克隆抗體制備中不易獲取任意預(yù)定抗原激活的B細(xì)胞及人細(xì)胞融合困難的難題，為人單克隆抗體的研制帶來了新的希望。雖然有成功的例子[13，14]，但從更多的報道來看[13，15]，其中許多環(huán)節(jié)如人外周血淋巴細(xì)胞供者的選擇、人外周血淋巴細(xì)胞的移植數(shù)量和方式、抗原免疫的最佳方案、人化SCID鼠對陌生抗原的免疫應(yīng)答等都有待進(jìn)一步研究[16]。只有當(dāng)經(jīng)抗原免疫后的人源化SCID鼠能產(chǎn)生足夠高滴度的特異性抗體時，將其用于人單克隆抗體制備才具有現(xiàn)實意義。
目前構(gòu)建的人化SCID鼠仍存在許多未解決的問題，可喜的是將人體免疫系統(tǒng)移植到SCID鼠體內(nèi)的這種異種移植是成功的。隨著進(jìn)一步深入的探索和不斷改進(jìn)，我們相信，用人外周血淋巴細(xì)胞構(gòu)建的SCID鼠可以被制成更接近人類本身免疫系統(tǒng)的模型，并將在檢測人體免疫應(yīng)答、揭示HIV感染、腫瘤以及自身免疫系統(tǒng)疾病等的發(fā)病機理，以及人單克隆抗體的制備等領(lǐng)域中得以廣泛應(yīng)用。
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作者簡介：吳嵐曉(1975-)，女(漢族)，福建福州人，第一軍醫(yī)大學(xué)，碩士
審校者：第一軍醫(yī)大學(xué)熱帶病研究室李明
參考文獻(xiàn)
1 Bosma GC et al .Nature ,1985;301:527-530
2 Moiser DE et al .Nature,1988；335:256-259
3 Shiroki R et al .Transplantation,1997;63
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16 Crow AR et al .Br J Haematol,1999;104(4):919-924, http://www.www.srpcoatings.com
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