-第一節(jié) 膽固醇測定
血漿中的脂類包括膽固醇、膽固醇脂、甘油三酯、磷脂和非酯化脂肪酸等。
目前，對有關(guān)脂類代謝疾患的診斷和治療過程，均必須檢測血漿(清)中的脂類，通過其含量的變化，對臨床疾患提供協(xié)助診斷的依據(jù)。有關(guān)醫(yī)學科研工作，脂類的定量檢測也是一項必備的研究項目。
1.膽固醇測定
血漿中膽固醇及其酯的含量檢測，從方法學上可分為兩大類：一類是化學法包括抽提法和直接測定法，這類方法目前仍在沿用；另一類是酶法測定，方法敏感特異快速，并能自動化分析，已常規(guī)應(yīng)用。化學測定法種類多，由于顯色反應(yīng)的特異性不同，其結(jié)果有一定的差異。目前公認的參考方法是Abell-Kendall(L-B反應(yīng))法。另外，三氯化鐵-硫酸反應(yīng)法(Zak法)具有顯色穩(wěn)定法、操作簡便、靈敏度約5倍于L-B反應(yīng)法，膽固醇酯與游離膽固醇顯色程度比較接近等優(yōu)點，缺點是特異性差，干擾因素比L-B法多，如冰醋酸中含有的乙醛酸，血清樣品中的血紅蛋白，膽紅素以及硫酸的質(zhì)量等因素均可影響Zak方法的準確性，Zak法更適合于科研使用。酶法測定血清膽固醇的方法已被廣泛采用，國產(chǎn)試劑已能滿足臨床的需要。膽固醇測定用的標準品，按美國國家標準局(NBS)出品純度達99.8%,是國際公認的參考物，國內(nèi)李健齋等已純化制成符合這一要求的膽固醇純品，已供臨床檢測血清膽固醇使用。
2.甘油三酯測定
血漿甘油三酯的測定，目前多以化學法和酶法定量�；瘜W法測定甘油三酯是以脂蛋白變性，水解成甘油，并以甘油為計算依據(jù)。酶法是以特異酶水解甘油三酯，除去脂肪酸，再測定甘油，方法特異，準確而快速，臨床廣為應(yīng)用。目前甘油三酯測定的方法主要以定量甘油為依據(jù)，然而血清樣品中存在有游離甘油，如何從反應(yīng)過程中的總甘油中減去游離甘油，多年來一直在研究討論這一問題。若不減去，其測定值將會高于血清樣品中的真值，如果要減去，就必須先測出血清樣品中的游離甘油，甘油三酯的測定方法將增加一個繁雜的步驟，實際工作中難以做到。有報道血清樣品中的游離甘油實際量是0.07～0.13mmol/L，相當于甘油三酯的0.5～6.0mmol/L，為此建議，實測的甘油三酯量減去一個校正系數(shù)即：
甘油三酯(mmol/L)=[0.98×總甘油(mmol/L)]-0.07(mmol/L)。
這一校正系數(shù)也僅適用于健康人，對臨床病人并不一定適用。據(jù)報道，血清樣品的游離甘油一直是個未知數(shù)，無法測準。為此，目前臨床測定血清甘油三酯時，基本上未考慮游離甘油，因為其含量很少，暫且忽略不記。甘油三酯測定的參考物，推薦三油酸甘油酯和三軟脂酸甘油酯混合物(2：1，W/W)，此參考物適用于化學法。在酶法測定中，仍以高純度的三油酸甘油酯為參考物。
3.磷脂測定
血清磷脂包括卵磷脂、溶血卵磷脂、神經(jīng)磷脂、腦磷脂和其他少量磷脂。如需要分別檢測各種磷脂，可以通過薄層層析法、柱層析法和高壓液相色譜法。目前，臨床僅測定血清磷脂總量。血清磷脂總量的測定方法有化學方法和酶法兩大類�；瘜W法是以磷脂中的磷為定量依據(jù)，因為每磷脂分子中都含有一個磷酸根，故將磷脂的磷稱為脂性磷。由于血清中磷脂大部分為卵磷脂，其分子量中磷約占4%，故將脂性磷換算成磷脂的系數(shù)，一般為25。由于化學法均需要抽提，再測抽提液中的磷脂的磷，血清中的磷酸鹽不可能混入抽提液中，因此血清中的磷酸鹽對磷脂測定的干擾很少。酶法是利用磷脂酶進行定量測定。生物體中磷脂酶包括磷脂酶A1、A2、C和D四種。磷脂酶D特異性差，均可水解卵磷脂、溶血卵磷脂和神經(jīng)磷脂，三者約占血清總磷脂的95%，臨床多用含磷脂酶d 的試劑進行磷脂的定量測定。
4.游離脂肪酸測定
游離脂肪酸屬于未酯化的一類脂肪酸，故又稱為非酯化脂肪酸，其量很少，采用方法必須是靈敏的方法，還需要避免脂肪水解產(chǎn)生脂肪酸的干擾。測定方法有：①滴定法需要微量滴定裝置，因為要通過肉眼觀察顏色，難免會有主觀因素的影響，所以難以測定準確，很難用于常規(guī)；②光度法，以銅皂法常用；③酶法，主要采用特異性不強的脂肪酶D進行檢測，方法特異，快速準確，已常規(guī)應(yīng)用于臨床。
第一節(jié) 膽固醇測定
血清中膽固醇包括CE和FC，酯型的CE占70%，F(xiàn)C占30%。CE中的C3的-OH在LCAT作用下，可分別結(jié)合亞油酸(43%)、油酸(24%)、軟脂酸(10%)、亞麻油酸(6%)、花生四烯酸(6%)、硬脂酸(3%)等脂肪酸結(jié)合而成。血清中膽固醇在LDL中最多，其次是HDL和VLDL、CM最少。血清總膽固醇測定方法分為化學法和酶法兩大類。
1.化學法
化學法一般包括：①抽提；②皂化；③毛地黃皂苷沉淀純化；④顯色比色四個階段。代表性的方法有Sperry-Webb法，通過①～④步驟操作過程。常規(guī)操作中多采用省去了②、③�；蛘哂檬∪ア�、③步驟的Zak-Henly法及省去③步驟的Abell-Kendall法，現(xiàn)將此法作為標準參考方法予以引用。
2.酵法測定
CE在膽固醇酯酶(cholesterol esterase)作用下水解成FC和NFFA，TC再經(jīng)膽固醇氧化酶(cholesterol oxidase,COD)氧化成△4膽甾烯酮和H2O2。再分別定量O2的消耗或者H2O2的生成量，或者△4膽甾烯酮生成量,以作為TC的定量依據(jù)。該法是目前常規(guī)的應(yīng)用方法，快速準確，標本用量少，便于自動生化分析儀作批量測定。
一、Abell-Kendall改良法
1.原理
血清加入醇溶性氫氧化鉀，使膽固醇從脂蛋白中分離出來，同時使膽固醇酯加水分解成游離膽固醇，加石油醚振搖、抽提，使膽固醇移入石油醚層，分離并取一定量的石油醚層，蒸發(fā)至干，再進行Liebermann-Burchard 顯色反應(yīng)，620nm比色定量。該法可用于基本功訓練及組織細胞膽固醇的提取定量。
2.試劑組成
| 代號 | 種類 | 濃度 | 組 成 | 貯存2～8℃ | 有效時間 |
| R1 | 乙醇 | 優(yōu)質(zhì)純 | |||
| R2 | 石油醚 | 沸點68℃，特級純 | |||
| R3 | 水醋酸 | 分析純 | |||
| R4 | 無水醋酸 | 膽固醇分析用，不含HCI | |||
| R5 | 濃硫酸 | 分析純 | |||
| R6 | KOH液 | 33%(W/W) | KOH10g+H2O 20ml | ||
| R7 | 乙醇性KOH液 | R194ml+R66ml | 臨用前配制 | ||
| R8 | Liebermann | 配制后 | |||
| Burchard | R420體積+R51體積+R310體積 | 1h | |||
| 試劑* | 內(nèi)用完 | ||||
| R9 | 膽固醇標準液 | 5.17mmol/L | 膽固醇標準品200mg+R1→100ml | 0 |
*：在三角燒瓶內(nèi)，加入無水醋酸，于冰水中冷至10℃以下，再慢慢加入濃硫酸，混合，靜置10min，又加冰醋酸混勻，備用。
3.操作
圖15-1 血清膽固醇(Abell法)測定操作圖
按圖15-1操作。
4.計算
標準總膽固醇濃度=ESA/EST×5.17(mmol/L)
二、酶法(CEH、COD-POD法)
首先將血清中膽固醇酯在膽固醇酯酶(CEH)水解為游離膽固醇和脂肪酸，膽固醇在膽固醇氧化酶(COD)作用下，生成△4-膽甾烯酮和H2O2，再H2O2經(jīng)過氧化物酶(POD)作用在4-氨基安替比林(4-AA-P)及N-乙基-N-(3-磺基醋酸)-3甲氧基苯胺(N-ethyl-N-(3-sulfopropyl)-manisidine,ESPAS)參與下，生成紅色醌亞胺色素。
H2O2+ESPAS+4-氨基安替比林→紅色醌亞胺色素
(一)手工測定法
1.試劑組成
| 代號 | 種類 | 濃度 | 組成 | 貯2～8℃ | 有效時間 |
| Na2HPO4 | 50mmol/L | ||||
| Na2H2PO4 | 50mmol/L | ||||
| 膽酸鈉 | 3mmol/L | ||||
| 4-氨基安替比林 | 0.82mmol/L | ||||
| R1* | ESPAS | 14mmol/L | 24h | ||
| Carbowax-6000 | 0.17mmol/L | ||||
| CEH | 33U/L | ||||
| COD | 117U/L | ||||
| POD | 6700U/L | ||||
| R2 | 標準液 | 5.17mmol/L | 用異丙醇溶解膽固醇 |
*混勻，調(diào)pH至6.70±0.10(25℃)，或購買試劑盒。酶以活性單位表示。
2.操作
按圖15-2操作。
3.計算
標準總膽固醇濃度=ESA/EST×5.17(mmol/L)
(二)自動化分析儀測定
以CL-7200型全自動生化分析儀檢測為例。
1.試劑組成
A液：CEH、POD、抗壞血酸氧化酶等。
B液：COD、4-氨基安替比林等。
圖15-2 血清膽固醇測定(酶法)操作圖
2.上機參數(shù)
| 項 目 | 參 數(shù) |
| 方 法 | 終點法 |
| 波 長 | 雙波長(540nm，700nm) |
| 反應(yīng)溫度 | 37℃ |
| 試劑A反應(yīng)時間 | 2～3min |
| 試劑B反應(yīng)時間 | 5～6min |
| 樣本用量 | 3μl |
| 試劑A用量 | 250μl |
| 試劑B用量 | 120μl |
| 單位 | mmol/L |
3.操作過程
4.計算
以△A=A2-A1，根據(jù)同樣處理之標準或質(zhì)控物計算，打印結(jié)果。
5.注意事項
(1)試劑與樣本量可根據(jù)分析儀要求按比例改變。
(2)試劑在有效內(nèi)2～8℃避光食保存。
(3)膽固醇含量超過200mmol/L，需用生理鹽水稀釋再測。
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