臨床上將C10以上的脂肪酸稱為游離脂肪酸(free fatty acid,FFA)或非酯化脂肪酸(nonesterified fatty acid,NFFA),正常血清中含有油酸(18:1,W9)占54%,軟脂酸(16:0)占34%,硬脂酸(18:0)占6%,是其主要的NFFA。另外還有月桂酸(12:0)、肉豆蔻酸(14:0)和花生四烯酸(20:4,W6,9,12,15)等含量很少的脂肪酸。與其他脂質(zhì)比較,NFFA在血中濃度很低,其含量水平極易受脂代謝,糖代謝和內(nèi)分泌機(jī)能等因素影響,血中NFFA半壽期為1~2min,極短。血清中的NFFA是與清蛋白結(jié)合進(jìn)行運(yùn)輸,屬于一種極簡(jiǎn)單的脂蛋白。
測(cè)定血清NFFA法有滴定法。比色法,原子分光光度法,高壓液相層析法和酶法等。一般多以酶法測(cè)定。作NFFA測(cè)定的標(biāo)本一定要注意在4℃條件下分離血清并盡快進(jìn)行測(cè)定。因?yàn)檠杏懈鞣N脂肪酶存在,極易也極快使血中TG和PL的酯型脂肪酸分解成非酯化的FFA,使血中NFFA值上升。貯存標(biāo)本僅限于24h內(nèi),若保存三天,其值約升高30%,使結(jié)果不準(zhǔn)確。
1.非酶法測(cè)定
非酶法測(cè)定包括滴定法、比色法、原子吸收分光光度法和高壓液相層析法。前三種方法準(zhǔn)確性差;高壓液相層析法,儀器太昂貴,不便于批量操作。
2.酶測(cè)定法
主要用脂肪酶測(cè)定。血清中游離脂肪酸可分別測(cè)定酶水解后的產(chǎn)物乙酰CoA或AMP或輔酶A(CoA)進(jìn)行定量。酶法測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確可靠,快速,易于批量檢測(cè)。測(cè)定原理如圖15-6所示。

圖15-6 血清主要FFA酶法測(cè)定圖
□:內(nèi)物質(zhì)作為生成量與變化量進(jìn)行測(cè)定;ACS:乙酰CoA合成酶;MK:肌激酶; PK:丙酮酸激酶;POD:丙酮酸氧化酶;DTNB:α-磺基苯甲酸;ACO:乙酰CoA氧化酶;ACD:乙酰CoA脫氫酶。
一、光度法
1.原理
血清中游離脂肪酸經(jīng)抽提到高密度銅試劑中,形成銅皂在上層溶劑中,再用二苯卡巴肼與銅顯色,進(jìn)行定量。
2.試劑組成
| 代號(hào) | 種類 | 濃度 | 組成 | 貯存2~8℃ | 有效期 |
| R-1 | 抽提劑 | 氯仿:庚烷:甲醇=5:5:1(V/V) | |||
| R-2 | 緩沖液 | 33mmol/L | KH2PO44.539g/L 100ml+Na2HPO4·2H2O5.983g/l 50ml調(diào)pH至6.4 | ||
| R-3 | 銅貯液 | 500mmol/L | Cu(NO3)2·3H2o 12.07g加H2O→100ml | ||
| R-4 | 三乙醇胺 | 1.0mol/L | 三乙醇胺10ml,加水→100ml | ||
| R-5 | NaOH液 | 1mol/L | |||
| R-6 | 銅試劑 | R-3 10ml+R-4 10ml+R-6 6ml +H2O→100ml調(diào)pH至8.1 | |||
| R-7 | 二苯卡 巴肼液 | 二苯卡巴肼(乙醇)液(4g/L)10ml+R-4 0.1ml | 臨用前配制 | ||
| R-8 | 軟脂酸標(biāo)準(zhǔn)貯存液 | 2mmol/L | 軟脂酸51.2mg溶于100ml R-1液 | 冷藏 | |
| R-9 | R-8的應(yīng)用液 | 500μmol/L | 用R-1液稀釋 | 冷藏 |
3.操作
按圖15-7操作。
4.計(jì)算
血清游離脂肪酸(μmol/L)=ESA/EST×500
二、酶法
1.原理
血清中游離脂肪酸或非酯化脂肪酸(NEFA),經(jīng)酶試劑作用生成紫色化合物,其顏色深淺與NEFA含量成正比。

2.試劑組成
| 代號(hào) | 種類 | 組成 | 濃度貯存 | 貯存 |
| R1 | 緩沖液 | 磷酸緩沖液 MgCl2液 去垢劑 | 0.04mmol/LpH6.9 3mol/L | |
| R2 | 酶/輔酶 | 乙酰CoA合成酶 抗壞血酸氧化酶 CoA ATP 4-AAP 溶于10ml R1液中 | ≥0.3U/ml ≥1.5U/ml 0.9mmol/L 5.0mmol/L 1.5mmol/L |
冷藏5日 |
| R3 | 酶稀釋液 | 苯氧乙醇 去垢劑 | 0.3%(V/V) | |
| R4 | 馬來酰亞胺 該試劑與R3等體積混合 | 10.6mmol/L | ||
| R5 | 酶試劑 | 乙酰CoA氧化酶 過氧化物酶 TOOS 混合上述試劑,再等體積R4試劑混合 | ≥10U/ml 7.5U/ml 0.2mmol/L |
冷藏5日 |
| R6 | 標(biāo)準(zhǔn)液 | 1mmol/L | 冷藏 |
*應(yīng)用帶玻塞離心管
3.操作
按圖15-8操作。
4.計(jì)算


圖15-7 血清非酯化脂肪酸測(cè)定(光度法)操作圖

圖15-8 血清非脂化脂肪酸測(cè)定(酶法)操作圖
(胡漢寧 儲(chǔ)建中)
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