-第一節(jié) 受體與標(biāo)記配體的結(jié)合分析
脂蛋白受體主要包括乳糜粒受體(CM-R)、極低密度脂蛋白受體(VLDL-R)、低密度脂蛋白受體(LDL-R)、高密度脂蛋白受體(HDL-R)和清道夫受體(scavenger receptor)等。脂蛋白受體的檢測與一般受體檢測方法的原理及操作基本類同。目前研究最多,應(yīng)用最廣的要屬LDL-R,其他脂蛋白受體如清道夫受體、VLDL-R等的檢測方法與LDL-R基本相似,多采用125Ⅰ標(biāo)記的配體檢測或是3HTdR摻入法等。本章以LDL-R為代表介紹脂蛋白的檢測方法。
低密度脂蛋白受體(LDL-R)廣泛分布于人與動(dòng)物的各種細(xì)胞和組織,如肝細(xì)胞,成纖維細(xì)胞,血管平滑肌細(xì)胞,淋巴細(xì)胞,單核細(xì)胞及腎上腺、卵巢等。LDL-R是一種跨膜糖蛋白,位于細(xì)胞表面被膜凹的漿膜部位。主要功能是參與LDL-R的代謝過程,與含有ApoB100、ApoE的LDL、β-VLDL等結(jié)合,并內(nèi)吞入細(xì)胞,LDL-R缺乏則導(dǎo)致血中膽固醇異常。家族性高膽固醇血癥(FH)是LDL-R基因突變引起的LDL-R缺乏以致膽固醇異常的顯性遺傳性疾病。其特征為血膽固醇顯著升高、黃色瘤和早發(fā)心肌梗塞。人群中雜合子型FH(LDL-R減少)發(fā)生頻率為1/500,純合子型FH(LDL-R缺乏)較少見,發(fā)生頻率約為1/1000000,通常在兒童期即發(fā)生心肌梗塞。FH的發(fā)病率在我國也是比較高的,因此LDL-R的檢測對(duì)于篩選人群中的FH患者及預(yù)防冠心病、心肌梗塞等具有重要意義。
細(xì)胞表面的LDL-R的分析可通過以下幾種檢測方法進(jìn)行:檢測同位素或非同位素標(biāo)記的LDL與LDL-R的結(jié)合力(或率),推算受體最大結(jié)合濃度,在限制性生長條件下檢測細(xì)胞分裂抑制率。判斷LDL受體活性;用抗體直接測定LDL-R量或者對(duì)受體直接進(jìn)行蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和基因圖譜分析。
第一節(jié) 受體與標(biāo)記配體的結(jié)合分析
為了體外研究脂蛋白的細(xì)胞代謝和脂蛋白受體活性,早在1974年Goldstein和Brown就建立了成纖維細(xì)胞125I標(biāo)記LDL的配體-受體結(jié)合分析法。其基本原理是:用放射性同位素(常用125I)標(biāo)記LDL后,與細(xì)胞(通常為培養(yǎng)的單層成纖維細(xì)胞)、組織或含有LDL-R的制劑一起孵育,使LDL-R與125I-LDL充分結(jié)合,形成受體-配體復(fù)合物,再除去未結(jié)合的125I-LDL,測定結(jié)合沉淀物中的放射性。同時(shí)檢測細(xì)胞、組織或受體制劑的蛋白質(zhì)含量,即可計(jì)算出與125I-LDL結(jié)合的LDL-R量。本法由于使用同位素,采樣困難和操作過程繁瑣,且費(fèi)時(shí)、昂貴,故在臨床診斷上難以廣泛開展。
Teupser等于1996年建立了直接熒光法檢測LDL-R,他們采用1,1’二(十八烷基)-3,3',3',3'-四甲基吲哚羰基花青高氯酸鹽(1,1'-dioctadecy1-3,3,3',3'-tetramethylindocarbocyanine perchlorate,DiI)標(biāo)記LDL,原理與同位素標(biāo)記LDL相同。其操作步驟見圖20-1。直接熒光法可定量檢測附著的或非附著的各種類型的培養(yǎng)細(xì)胞(如正常人或FH病人的皮膚成纖維細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、人U-937和鼠P388D1巨噬細(xì)胞系)的LDL-R和清道夫受體,其特點(diǎn)是特異性強(qiáng),靈敏度高,不使用有機(jī)溶劑、不需預(yù)先進(jìn)行脂質(zhì)抽提,并省去了多步抽提步驟。正常人平均最大結(jié)合濃度為10.3±1.1μg/mg細(xì)胞蛋白,F(xiàn)H雜合子為5.2±0.8μg/mg細(xì)胞蛋白,F(xiàn)H純合子0.9±0.2μg/mg細(xì)胞蛋白。

圖20-1 直接熒光法測LDL-R操作步驟
亦有用膠體金標(biāo)記LDL的,但是在受體-配體結(jié)合分析法中,正常人與FH患者的測定值有較明顯的交叉現(xiàn)象,且操作比較繁瑣。
1987年Roach等比較了在硝化纖維素上用125I-LDL、生物素-LDL、生物素-LDL、膠體金-LDL和膠體金-LDL結(jié)合銀染四種方法檢測LDL-R,發(fā)現(xiàn)膠體金-LDL結(jié)合銀染的方法最為敏感,且安全、簡單、快速、便宜。比較結(jié)果見表20-1。
表20-1 硝化纖維上檢測LDL-R的幾種方法比較
| 因素 | 125I-LDL | 生物素-LDL | 膠體金-LDL | 膠體金-LDL加銀染 |
| 時(shí)間 | 12~24h | 3h | 5~10min | 20min |
| 敏感性 | 1.6fmoles | 1.6fmoles | 1.6fmoles | 193amoles |
| 線性范圍 | 0.5~15μg | 0.5~4μg | 0.5~4μg | 0.06~2μg |
百拇醫(yī)藥網(wǎng) http://www.www.srpcoatings.com/html/Dir/2003/04/03/9022.htm