中華基因網(wǎng)技術(shù)部 王嘉嘉
基因芯片及其技術(shù)是融微電子學(xué)、生物學(xué)、物理學(xué)、化學(xué)、計算機(jī)科學(xué)為一體的高度交叉的新科技，一旦被廣泛應(yīng)用與臨床，它將在一些重癥傳染病、惡性腫瘤、自身免疫性疾病、神經(jīng)性疾病等方面，發(fā)生巨大的革命性的變革，基因技術(shù)在疾病的診斷、檢測及治療用藥等方面有廣闊的應(yīng)用、研究價值。
一、基本概念
基因芯片(gene chip)，又稱DNA芯片，是指將許多特定的寡核苷酸片段或基因片段作為探針，有規(guī)律地排列固定于支持物上，樣品DNA/RNA通過PCR擴(kuò)增、體外轉(zhuǎn)錄等技術(shù)摻入熒光標(biāo)記分子，然后按堿基配對原理進(jìn)行雜交，再通過熒光檢測系統(tǒng)等對芯片進(jìn)行掃描，并配以計算機(jī)系統(tǒng)對每一探針上的熒光信號作出比較和檢測，從而迅速得出所要的信息[1]。基因芯片技術(shù)具有多樣品并行處理能力、分析速度快、所需樣品量少、污染少等優(yōu)點，近年來在臨床診斷、藥物篩選、指導(dǎo)臨床用藥及治療等研究領(lǐng)域帶來革新性的影響。
二、基因芯片的主要類型
基因芯片的類型按分類方法不同可分為不同的類型[2]
1、無機(jī)片基和有機(jī)合成物片基的基因芯片
以基因芯片的片基或支持物的不同可以分為無機(jī)片基和有機(jī)合成物片基，前者主要有半導(dǎo)體硅片和玻璃片等，其上的探針主要以原位聚合的方法合成；后者主要有特定孔徑的硝酸纖維膜和尼龍膜，其上的探針主要是預(yù)先合成后通過特殊的微量點樣裝置或儀器滴加到片基上。另有以聚丙烯膜支持物用傳統(tǒng)的亞磷酰胺固相法原位合成高密度探針序列。
2、原位合成和預(yù)先合成然后點樣的基因芯片
以探針陣列的形式分為原位合成與預(yù)先合成然后點樣兩種。芯片制備的原理是利用照相平板印刷技術(shù)將探針排列的序列即陣列圖"印"到支持物上，在這些陣列點上結(jié)合上專一的化學(xué)基因。原位合成主要是指光引導(dǎo)合成技術(shù)，該技術(shù)是照相平板印刷技術(shù)與固相合成技術(shù)、計算機(jī)技術(shù)以及分子生物學(xué)等多學(xué)科相互滲透的結(jié)果。預(yù)先合成然后點樣法在多聚物的設(shè)計方面與前者相似，合成工作用傳統(tǒng)的DNA 合成儀進(jìn)行。合成后再用特殊的點樣裝置將其以較高密度分布于硝酸纖維膜或經(jīng)過處理的玻片上。
3、基因表達(dá)芯片和DNA測序芯片
根據(jù)芯片的功能可分為基因表達(dá)譜芯片和DNA測序芯片兩類。基因表達(dá)芯片可以將克隆到的成千上萬個基因特異的探針或其cDNA片段固定在一塊DNA芯片上，對來源于不同的個體(正常人與患者)、組織、細(xì)胞周期、發(fā)育階段、分化階段、病變、刺激(包括不同誘導(dǎo)、不同治療手段)下的細(xì)胞內(nèi)mRNA或反轉(zhuǎn)錄后產(chǎn)生的cDNA進(jìn)行檢測，從而對這些基因表達(dá)的個體特異性、組織特異性、發(fā)育階段特異性、分化階段特異性、病變特異性、刺激特異性進(jìn)行綜合的分析和判斷，迅速將某個或幾個基因與疾病聯(lián)系起來，極大地加快這些基因功能的確定，同時可進(jìn)一步研究基因與基因間相互作用的關(guān)系。DNA 測序芯片則是基于雜交測序發(fā)展起來的。其原理是，任何線狀的單鏈DNA或RNA序列均可分解成 一系列堿基數(shù)固定、錯落而重疊的寡核苷酸，又稱亞序列(subsequence)，假如我們能把原序列所有這些錯落重疊的亞序列全部檢測出來，就可據(jù)此重新組建出原序列。
另外也可根據(jù)所用探針的類型不同分為cDNA微陣列(或cDNA微陣列芯片)和寡核苷酸陣列(或芯片)，根據(jù)應(yīng)用領(lǐng)域不同而制備的專用芯片如毒理學(xué)芯片(Toxchip)、病毒檢測芯片(如肝炎病毒檢測芯片)、P53基因檢測芯片等。
又可以按生物化學(xué)反應(yīng)過程分：
通常的生物化學(xué)反應(yīng)過程包括三步，即樣品的制備，生化反應(yīng)、結(jié)果的檢測和分析�？蓪⑦@三步不同步驟集成為不同用途的生物芯片，所以據(jù)此可將生物芯片分為不同的類型。例如用于樣品制備的生物芯片，生化反應(yīng)生物芯片及各種檢測用生物芯片等。
三、臨床上的應(yīng)用前景
1、疾病診斷
基因芯片在感染性疾病、遺傳性疾病、重癥傳染病和惡性腫瘤等疾病的臨床診斷方面具有獨特的優(yōu)勢。與傳統(tǒng)檢測方法相比，它可以在一張芯片同時對多個病人進(jìn)行多種疾病的檢測，無需機(jī)體免疫應(yīng)答反應(yīng)期，能及早診斷，待測樣品用量��；能特異性檢測病原微生物的亞型及變異；可幫助醫(yī)生及患者從"系統(tǒng)、血管、組織和細(xì)胞層次(通常稱之為'第二階段醫(yī)學(xué)')"轉(zhuǎn)變到"DNA、RNA、蛋白質(zhì)及其相互作用層次(第三階段醫(yī)學(xué))"上了解疾病的發(fā)生、發(fā)展過程，這些特點使得醫(yī)務(wù)人員在短時間內(nèi)，可以掌握大量的疾病診斷信息，這些信息有助于醫(yī)生在短時間內(nèi)找到正確的治療措施。眾所周知，腫瘤和遺傳疾病發(fā)生的根本原因是由于遺傳物質(zhì)發(fā)生了改變，檢測基因突變對于闡明腫瘤及遺傳病的分子機(jī)制、疾病的早期診斷具有重要意義。目前，Affymetrix公司已開發(fā)出P53基因芯片，是將已知P53基因全長序列和已知突變的探針固定在芯片上，這將有助于惡性腫瘤的早期診斷。華盛頓大學(xué)的分子生物學(xué)系與病理系聯(lián)合研究了卵巢癌中基因表達(dá)譜的變化[3]，他們將5766個基因探針固定于芯片上，其中5376個分別選自卵巢癌、卵巢表面上皮細(xì)胞及正常卵巢的cDNA文庫，另外還有342個來自EST克隆，包括一些已知確定的管家基因、細(xì)胞因子和因子受體基因、生長因子和受體基因、與細(xì)胞分裂相關(guān)的基因以及新近確定的腫瘤相關(guān)基因，找出在卵巢癌組織中過度表達(dá)的30個有GenBank收錄的基因，如高表達(dá)的有CD9(GenBank錄入號：M38690)、Epithelial glycoprotein (GenBank錄入號：M32306)、P27(GenBank錄入號：X67325)等，這證明了利用基因芯片分析復(fù)雜生物體系中分子變化的可行性。又如，Hacia等[4]在1.28 cm×1.28 cm的芯片上固定了9.66×104個長度為20 nt的寡核苷酸探針，用于檢測乳腺癌基因BRCA1的exon11 (3.45 kb)中所有可能的堿基置換、插入和缺失(1～5 bp)突變。在15例患者樣品中，發(fā)現(xiàn)有14例有基因突變，類型包括點突變、插入及缺失等；在20例對照樣品中均未檢出假陽性結(jié)果。又如，Heller等[5]采用基因表達(dá)譜芯片研究了類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、腸炎基因的特征性表達(dá)活性，發(fā)現(xiàn)已知炎癥相關(guān)基因，如腫瘤壞死因子、白介素和粒細(xì)胞集落刺激因子在組織中有表達(dá)。還發(fā)現(xiàn)一些以前未知的與炎癥相關(guān)基因的表達(dá)，如人基質(zhì)金屬彈性蛋白酶(human matrix metallo-elastase)和黑素瘤生長刺激因子(melanoma growth stimulatory factor)。同時，與一個來自外周血基因文庫的1046個cDNA克隆的陣列作這兩種病變狀態(tài)基因差異表達(dá)的比較，發(fā)現(xiàn)在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎組織中金屬蛋白酶組織抑制物1，鐵蛋白輕鏈和錳超氧化物歧化酶表達(dá)明顯升高 。通過該研究，確定了許多基因與這兩種病變的關(guān)系，為探討基因芯片在診斷感染性疾病方面提供了新的思路�，F(xiàn)在，肝炎病毒檢測芯片、多種惡性腫瘤相關(guān)病毒基因芯片等多種芯片已面市，相信不久的將來，會有更多的基因芯片用于臨床。
2、藥物篩選
芯片技術(shù)具有高通量、大規(guī)模、平行性等特點可以進(jìn)行新藥的篩選，尤其對我國傳統(tǒng)的中藥有效成分進(jìn)行篩選�；蛐酒瑢τ谒幬锇袠�(biāo)的發(fā)現(xiàn)、多靶位同步高通量藥物篩選、藥物作用的分子機(jī)理、藥物活性及毒性評價方面都有其它方法無可比擬的優(yōu)越性，能夠從基因水平解釋藥物的作用機(jī)理，可以用基因芯片分析用藥前后機(jī)體的不同組織、器官基因表達(dá)的差異，國外幾乎所有的主要制藥公司都不同程度地采用了基因芯片技術(shù)來尋找藥物靶標(biāo)，查檢藥物的毒性或副作用。例如，Kapp U等[6]用包含950個基因探針的基因芯片比較何杰金氏病細(xì)胞系L428及KMH2與EB病的B淋巴細(xì)胞系LGL-GK的基因表達(dá)譜，發(fā)現(xiàn)何杰金氏病源的細(xì)胞系中白細(xì)胞介素-13(IL-13)及白細(xì)胞介素-5(IL-5)表達(dá)異常增高，用IL-13抗體處理何杰金氏病院源細(xì)胞系可顯著抑制其增殖，此發(fā)現(xiàn)提示，IL-13可能以自分泌形式促進(jìn)何杰金氏相關(guān)細(xì)胞增殖,IL-13及其信號傳導(dǎo)途徑可能成為何杰金氏病治療及藥物篩選的新靶點。芯片用于大規(guī)模的藥物篩選研究可以省略大量的動物試驗，縮短藥物篩選所用時間，這可大大節(jié)省新藥開發(fā)經(jīng)費，并且可對由于不良反應(yīng)而放棄的藥物進(jìn)行重新評價，選取可適用的患者群，實現(xiàn)個性化治療。Michael Wilson 等[7]使用包含有肺結(jié)核桿菌基因組PRF的97%的序列的基因芯片，對應(yīng)用抗結(jié)核桿菌藥物異煙肼誘導(dǎo)前后表達(dá)的變化，結(jié)果證明肺結(jié)核桿菌中脂肪酸合成酶Ⅱ、FbpC、efpA、fadE23、fadE24和 基因發(fā)生改變與耐藥性有關(guān)，并為新藥物作用的靶目標(biāo)研究及指導(dǎo)抑制這些靶目標(biāo)試劑和藥物的合成提供指導(dǎo)。研究各種藥物對不同基因的作用，從而在劑量和成分搭配上做到精確無誤。相信在不久的將來，藥品說明書上的適用癥和禁忌癥都會改為適用基因型和禁忌基因型，使得藥品更加針對不同個體的不同疾病，達(dá)到療效更佳、副作用更小的目的。
3、指導(dǎo)用藥及治療方案
種族、個體等因素都會導(dǎo)致遺傳背景的差異，臨床上，同樣劑量的藥物對于不同患者在藥物療效與副作用方面會有很大差異，如果利用基因芯片技術(shù)對患者進(jìn)行診斷再開處方，就可以對患者實施個體化治療。疾病一般不是由單個基因引起的， 在治療中很多同種疾病的具體病因是因人而異的，所以用藥也因人而異，例如，現(xiàn)用于治療ADIS的藥物[8]主要是病毒逆轉(zhuǎn)錄酶RT和蛋白酶PRO的抑制劑，但在用藥3-12個月后常出現(xiàn)耐藥，其原因是rt、pro基因產(chǎn)生一個或多個點突變，對藥物的耐受能力成倍增加，如果將這些基因突變部位的全部序列構(gòu)建為DNA芯片，則可快速地檢測患者是哪些基因發(fā)生突變，從而可對癥施藥，指導(dǎo)臨床治療和預(yù)后。傳統(tǒng)的中醫(yī)藥講究的是整體治療觀，在中藥基因組學(xué)和中藥化學(xué)組學(xué)中，多成分、多靶點治療是基點，關(guān)鍵就是分析出成分譜與活性譜，實現(xiàn)精確篩選和配置，?quot;復(fù)方"的形式作用于致病基因組。
4、預(yù)防醫(yī)學(xué)
在嬰兒出生前，可用生物芯片進(jìn)行有效的產(chǎn)前篩查和診斷，防止患有先天性疾病的嬰兒出生。而在嬰兒出生后，即可采用基因芯片技術(shù)來分析其基因圖譜，不僅可預(yù)測出他日后可以長多高，還可預(yù)測其患某些疾病的潛在可能性有多大，以便采取預(yù)防措施。
四、前景展望
盡管基因芯片發(fā)展時間不長，迄今在醫(yī)學(xué)研究實際應(yīng)用中的例子還不多，但由于芯片技術(shù)與傳統(tǒng)的雜交技術(shù)相比，有檢測系統(tǒng)微型化，對樣品的需要量非常少，效率高，能高通量檢測DNA序列，更好地解釋基因之間表達(dá)的相互關(guān)系及檢測基因表達(dá)變化的靈敏度高等優(yōu)點，基因芯片在醫(yī)學(xué)上的應(yīng)用前景無疑是非常廣闊的。但目前基因芯片還處在研究階段，要成為臨床可以普遍采用的技術(shù)仍有一些問題急待解決，隨著研究的不斷深入和技術(shù)的更加完善，基因芯片一定會在生命科學(xué)研究領(lǐng)域發(fā)揮出其非凡的作用�；蛐酒夹g(shù)將為我們提供一條認(rèn)識生命本質(zhì)的捷徑。
參考文獻(xiàn)
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3. Wang K, Gan, L,Jeffery E, et al. Gene,1999,229(1-2):101～108
4. Hacia JG, Brody LC, Chee MS, et al. Detection of heterozygous mutation in BRCA1 using high density oligonucleotide arrays and two-color fluorescence analysis[J]. Nat Genet, 1996, 14(4): 441-447.
5. Heller RA, Schena M, Chai A, et al. Discovery and analysis of inflammatory disease-related genes using cDNA microarray[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 1997, 94(6): 2150-2155.
6. Kapp U,Yeh WC,Patterson B,et al,Interleukin 13 is secreted by and atimulates the growth of Hodgkin and Reed-Sternberg cells.J Exp Med 1999 Jun 21;189(12):1939-46
7. Michael W,Joseph D,et al. Exploring drug-insuced alterations in gene express in My cobacterium tuberculosis by microarray hybridization, Issue 22, 12833-12838,October 26,1999
8. Lipshutz D, Morris D, Chee M et al. Using oligonucleotide pribe array to access genetic diversity. Biotechniques,1995,19(3):422-447
, http://www.www.srpcoatings.com百拇醫(yī)藥網(wǎng) http://www.www.srpcoatings.com/html/Dir/2003/04/03/9423.htm