抗乙型肝炎病毒新藥的體外研究進展
乙型肝炎病毒(HBV)是比較嚴格的嗜肝DNA病毒，其感染的宿主范圍狹窄。由于缺乏有效的實驗工具，抗HBV新藥的研究進展緩慢。1986年，Sureau等[1]首先報道篩選出能表達HBV全部病毒標志的細胞株。至此，HBV體外培養(yǎng)取得突破，抗HBV新藥開發(fā)有了一個良好的體外研究工具。在眾多培養(yǎng)系統(tǒng)中，以HepG2.2.15在新藥體外研究中應(yīng)用最多。該細胞株是用2個頭尾相連的HBV DNA全基因的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染受體細胞HepG2而成，可在體外無性繁殖，能夠長期穩(wěn)定的向培養(yǎng)上清中分泌HBsAg、HBeAg和完整的Dane顆粒，而且還能產(chǎn)生大量的復(fù)制中間體，是體外篩選抗HBV藥物的良好模型。
1.篩選抗HBV的化學(xué)藥物
抗HBV的化學(xué)合成藥物中，研究較多的是核苷類似物和某些抗生素類藥物。朱永廉[2]從2.2.15細胞培養(yǎng)液中提取乙肝病毒DNA，用DNA印跡法分析β-L-2',3'-雙脫氧-5-氟胞苷對乙肝病毒DNA復(fù)制的影響。發(fā)現(xiàn)該藥對HBV具有較強的抑制作用(IC50為0.05μmol/L)，而且在濃度高到足以抑制乙肝病毒復(fù)制達90%以上時，對細胞線粒體DNA合成并無影響，說明其抗HBV作用在體外有較強的選擇性。但該作用是可逆的，在停藥后12d，病毒復(fù)制即開始恢復(fù)。產(chǎn)生這種“反跳”現(xiàn)象可能由于該藥物主要抑制DNA聚合酶(HBVDNAP)，而對其他的病毒復(fù)制中間體，如超螺旋DNA(cccDNA)作用甚微。停藥后，病毒復(fù)制可以從cccDNA處重新啟動，導(dǎo)致產(chǎn)生“反跳”。
, 百拇醫(yī)藥
吳婷等[3]以2.2.15細胞分泌的HBsAg、HBeAg、HBVDNA及細胞存活率為觀察指標，綜合評價了諾西肽體外抗HBV效果。結(jié)果表明：諾西肽對HBsAg和HBeAg的治療指數(shù)(TI)分別>16和>4.8。Southern雜交結(jié)果顯示：諾西肽在12.5μg/ml濃度下對細胞內(nèi)HBVDNA的抑制率為26.4%。提示該藥可能作用于病毒生活周期的后期mRNA翻譯和蛋白質(zhì)的加工階段。此外，該藥在抑制HBV抗原的同時，顯示出明顯的促細胞生長作用，提示該藥應(yīng)用于臨床后可能發(fā)揮出抗HBV和保肝的雙重功效。他們又以同樣的指標，評價了天然多肽類抗生素恩拉霉素體外抗HBV效果[4]。結(jié)果表明，恩拉霉素對HBsAg和HBeAg的IC50分別為27和34μg/ml；TI均>4。Southern結(jié)果顯示50μg/ml恩拉霉素對細胞內(nèi)游離HBVDNA抑制率為56.8%。
2.篩選抗HBV的反義核酸
目前，基因治療是一種很有發(fā)展前景的方法，反義寡核苷酸(antisenseoligonucleotides，ASON)用于調(diào)控基因的表達已成為抗HBV研究的一個熱點問題。姚志強等[5]應(yīng)用2.2.15細胞證明：反義核酸抑制HBV基因表達具有序列特異性、劑量相關(guān)性、時效依賴性、修飾增強性、作用協(xié)同性、對宿主細胞無害性等特點。其中針對HBV mRNA SPⅡ增強子帽區(qū)、多聚腺苷信號區(qū)及S基因起始區(qū)的ASON抑制活性最高，對HBsAg抑制率可達85～90%，對HBeAg抑制率也近50～60%，反復(fù)用藥后HBV DNA同樣受到抑制。其后，有學(xué)者相繼報道針對PolyA增加信號序列、HBV前C和C基因區(qū)以及HBV基因S區(qū)和C區(qū)的翻譯起始位點的ASON對HBV表現(xiàn)出明顯的抑制效果。
, 百拇醫(yī)藥
上述工作研究的均為寡核苷酸硫代磷酸酯(PSODN)。但在進一步深入實驗之后，發(fā)現(xiàn)PSODN存在一些劑量依賴性的不良反應(yīng)，如脾腫大、血小板減少等，這些不良反應(yīng)的產(chǎn)生可能是由于寡核苷酸的多陰離子特性造成了其體內(nèi)特異性不強，多器官分布。針對這種情況，許多學(xué)者著手對其進行修飾改造，以期提高作用靶向性，降低不良反應(yīng)。
立民等人[6]證明經(jīng)陽離子脂質(zhì)體(lipofectin)介導(dǎo)后，反義寡核苷酸在加入2.2.15細胞30min后，大多進入細胞質(zhì)，而且在10min以后，大部分迅速聚積于細胞核中，它們在細胞核及細胞質(zhì)中可穩(wěn)定存在12h以上。郭軍等[7]人工合成了兩種半乳糖多聚賴氨酸導(dǎo)向配體，與熒光素標記的互補于HBVmRNA多聚腺苷酸信號部分的21聚反義硫代脫氧核苷酸(ASODN)電性結(jié)合，并與2.2.15細胞共同孵育。40min后配體組對HBsAg和HBeAg的抑制率為41～47%和28～31%，單純ASODN組為11%和5%，3d后配體組為88～89%和71～74%，對照組為64%和53%。經(jīng)分析，配體使2.2.15細胞熒光染色率達75.3%和83.8%，對照組為24.3%。后經(jīng)體內(nèi)結(jié)果證明：兩種人工配體均具有導(dǎo)向ASODN入肝細胞的功能，進而明顯提高ASODN抗HBV的活性。
, http://www.www.srpcoatings.com
鐘森等[8]針對HBV前C/C基因區(qū)設(shè)計合成了16聚硫代和脂肪鏈-硫代兩種修飾的ASON，檢測作用細胞的HBsAg、HBeAg以及HBVDNA的分泌情況。結(jié)果顯示ASON在短時作用于細胞的情況下，脂肪鏈修飾的硫代ASON的抗病毒活性顯著高于未經(jīng)脂肪鏈修飾者(P<0.002和P<0.05)。提示脂肪鏈修飾是今后ASON藥物設(shè)計和開發(fā)的一個新途徑。
3.篩選抗HBV的蛋白質(zhì)類藥物
各類干擾素為治療HBV發(fā)揮了相當重要的作用。但越來越多的實驗證明干擾素的治療效果有限，有學(xué)者轉(zhuǎn)而研究其他種蛋白質(zhì)藥物。鄧濤等[9]根據(jù)乙肝病毒核心抗原(HBcAg)的MHC-Ⅰ類分子結(jié)合的關(guān)鍵序列合成了2段抗原性多肽(PepⅠaa：18～27及PepⅡaa：141～151)，分別與轉(zhuǎn)鐵蛋白(Tf)、抗CD3的單克隆抗體(CD3McAb)和白細胞介素-2(IL-2)聯(lián)合體外誘導(dǎo)乙肝病毒抗原特異性細胞毒T細胞(HBV-CTLs)，考察其對HBV的特異性殺傷力。結(jié)果發(fā)現(xiàn)HBV-CTLs在出現(xiàn)針對2.2.15的特異性細胞毒活性，d14達高峰，分別為67%(PepⅠ+Tf+CD3McAb+IL-2)及55%(PepⅡ+Tf+CD3McAb+IL-2)。由于同時測定到Fas配體(FasL)的表達較高，并與一氧化氮(NO)的表達為正相關(guān)。作者認為Fas-FasL介導(dǎo)細胞凋亡可能是HBV-CTLs殺傷機制之一，NO可能參與了HBV-CTLs功能的調(diào)節(jié)。
, 百拇醫(yī)藥
樓敏等[10]用化學(xué)偶聯(lián)劑SPDP將鼠源性CD3與HBs單克隆抗體連接，得到HBs/CD3雙特異性抗體。實驗顯示，HBs/CD3雙特異性單克隆抗體能顯著提高LAK細胞與2.2.15細胞結(jié)合率，而且能增強其對2.2.15細胞的殺傷力，該作用與抗體濃度相關(guān)，HBsAb濃度遞增，細胞毒性作用隨之增加。對細胞毒性作用的特異性研究表明：加入HBs/CD3雙特異Ab后，LAK細胞對2.2.15細胞的殺傷力顯著高于HepG2和K562細胞組。結(jié)果表明，HBs/CD3雙特異性抗體具有雙向識別LAK細胞和2.2.15細胞的特性，可以特異地促進LAK細胞與靶細胞結(jié)合，發(fā)揮選擇性細胞毒性作用。
4.篩選抗HBV的中草藥
臨床上已經(jīng)有不少應(yīng)用中草藥治療乙型肝炎的觀察，但是尚缺乏有關(guān)的實驗依據(jù)。范濤等[11]對4種中草藥制劑體外抗HBV活性及其機制進行了研究。發(fā)現(xiàn)復(fù)方黃芪浸膏水提取液對HBsAg和HBeAg的抑制率較高，但對HBVDNA無明顯抑制，提示該藥可能作用于病毒的轉(zhuǎn)錄、翻譯和蛋白合成等環(huán)節(jié)或直接與病毒蛋白結(jié)合而致HBsAg及HBeAg滴度下降。
, 百拇醫(yī)藥
文立民等[12]以培養(yǎng)上清液中HBsAg和HBeAg滴度作為評價天然藥物抗HBV效果的指標，對板藍根、苦味葉下珠和4種中藥混合物的抗HBV作用進行了比較。結(jié)果顯示，苦味葉下珠與4種中藥的混合物抗HBV的作用較強，可望成為有潛力的抗HBV藥物。
劉莊等[13]則考察了不同品種、劑型和添加成分的葉下珠提取物抗HBV的作用。其中沱茶珍珠草抗HBV作用最明顯，在濃度為500mg/L時對HBsAg的抑制率可達100%，而未顯示出明顯的細胞毒。同時還觀察到葉下珠提取物對病毒顆粒的抑制作用不僅發(fā)生在轉(zhuǎn)錄前水平，對mRNA的翻譯可能也有影響。他們又對動物藥華蟾素體外抗HBV活性進行了研究[14]。結(jié)果顯示，該藥對HBsAg和HBeAg的ID50分別為0.08和0.07g/ml，CD50為2.5mg/ml，HBsAg為31.3，HBeAg為35.7，而且它對細胞內(nèi)HBVDNA及其復(fù)制中間體呈劑量依賴型抑制。
張均倡等[15]用2.2.15細胞株模型評價了肝康對HBsAg、HBeAg、HBVDNA的抑制效果。發(fā)現(xiàn)從用藥到見效需要3～4d，之后可出現(xiàn)明顯的量效依賴性抑制作用，維持3～5天后逐漸減弱、消失，同時發(fā)現(xiàn)病毒復(fù)制、分泌越旺盛，抑制作用越強。
, http://www.www.srpcoatings.com
目前，國外篩選的抗HBV藥物主要集中在化學(xué)合成藥物上，尤其是核苷類似物。該類藥物主要作用于HBVDNAP，而未能抑制其他的復(fù)制中間體，造成停藥后發(fā)生“反跳”，反義核酸可以與靶mRNA序列特異性結(jié)合，抑制HBV基因表達，從而達到治療效果。
雖然2.2.15細胞株只是一個體外實驗系統(tǒng)，脫離了機體中免疫系統(tǒng)對HBV產(chǎn)生影響的環(huán)境。但是該細胞模型以及其他已建立的細胞培養(yǎng)系統(tǒng)，為全面、準確評價藥物抗HBV效果提供了科學(xué)依據(jù)，為進一步開發(fā)抗HBV新藥提供了堅實的基礎(chǔ)，在抗HBV藥物的研究開發(fā)工作中起著重要的作用。
參考文獻
1.Sureauc，RometLemonnejl，MullinsjI，et al.Production of hepatitis B virus by differrentiated human hepatome celllline after transfection with cloned circular HBVDNA.Cell，1986，47∶37
, 百拇醫(yī)藥
2.朱永廉.βL2',3'雙脫氧5氟胞苷在體外對乙型肝炎病毒復(fù)制的抑制作用.浙江醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，1998，27(3)∶97
3.吳婷，黃海，周佩.諾西肽抗乙肝病毒體外實驗研究.中國抗生素雜志，1997，22(5)∶373
4.吳婷，黃海，周佩.恩拉霉素抗乙型肝炎病毒的體外實驗研究.中國病毒學(xué)，1998，13(1)∶45
5.姚志強，周永興，郭軍，等.反義核酸抗乙型肝炎病毒基因治療基礎(chǔ)研究.中華傳染病雜志，1996，14(1)∶6
6.文立民，任中原.熒光素標記的反義寡核苷酸在人肝癌細胞中的時相分布.天津醫(yī)藥，1997，25(2)∶87
7.郭軍，周永興，姚志強，等.半乳糖修飾的反義硫代寡核苷酸的肝細胞導(dǎo)向及抗乙型肝炎病毒活性研究.解放軍醫(yī)學(xué)雜志，1996，21(3)∶196
, 百拇醫(yī)藥
8.鐘森，王升啟，王玉芝，等.乙型肝炎病毒前C/C基因區(qū)硫代和脂肪鏈：硫代反義寡核苷酸的體外抗病毒研究.中華內(nèi)科雜志，1996，35(2)∶95
9.鄧濤，陳乃玲，武珊珊，等.合成多肽體外誘導(dǎo)乙肝病毒抗原特異性CTL殺傷機制研究.中國免疫學(xué)雜志，1998，14(2)∶144
10.樓敏，皇甫玉珊，程云，等.HBs/CD3雙特異性抗體介導(dǎo)LAK對HBVDNA轉(zhuǎn)染細胞的細胞毒作用.解放軍醫(yī)學(xué)雜志，1997，22(6)∶397
11.范濤，傅希賢，張國慶，等.中草藥抗乙型肝炎病毒活性及其作用機理體外實驗研究.中華實驗和臨床病毒學(xué)雜志，1996，10(1)∶27
12.文立民，李冬田，馬海倫，等.天然藥物在體外抗HBV的研究.天津醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，1996，2(2)∶15
13.劉莊，傅希賢，張乃臨，等.中草藥葉下珠不同品種和制劑體外抗乙型肝炎病毒的實驗研究.中華實驗和臨床病毒學(xué)雜志，1997，11(3)∶282
14.劉莊，傅希賢，張乃臨，等.復(fù)方華蟾素口服液抗乙型肝炎病毒體外實驗研究.中國中西醫(yī)結(jié)合雜志，1996，16(12)∶73
15.張均倡，羅上武，萬金志，等.肝康對HBV轉(zhuǎn)染細胞表達功能的影響.中國實驗方劑學(xué)雜志，1998，4(4)∶18
責(zé)任編輯：王薇, http://www.www.srpcoatings.com
1.篩選抗HBV的化學(xué)藥物
抗HBV的化學(xué)合成藥物中，研究較多的是核苷類似物和某些抗生素類藥物。朱永廉[2]從2.2.15細胞培養(yǎng)液中提取乙肝病毒DNA，用DNA印跡法分析β-L-2',3'-雙脫氧-5-氟胞苷對乙肝病毒DNA復(fù)制的影響。發(fā)現(xiàn)該藥對HBV具有較強的抑制作用(IC50為0.05μmol/L)，而且在濃度高到足以抑制乙肝病毒復(fù)制達90%以上時，對細胞線粒體DNA合成并無影響，說明其抗HBV作用在體外有較強的選擇性。但該作用是可逆的，在停藥后12d，病毒復(fù)制即開始恢復(fù)。產(chǎn)生這種“反跳”現(xiàn)象可能由于該藥物主要抑制DNA聚合酶(HBVDNAP)，而對其他的病毒復(fù)制中間體，如超螺旋DNA(cccDNA)作用甚微。停藥后，病毒復(fù)制可以從cccDNA處重新啟動，導(dǎo)致產(chǎn)生“反跳”。
, 百拇醫(yī)藥
吳婷等[3]以2.2.15細胞分泌的HBsAg、HBeAg、HBVDNA及細胞存活率為觀察指標，綜合評價了諾西肽體外抗HBV效果。結(jié)果表明：諾西肽對HBsAg和HBeAg的治療指數(shù)(TI)分別>16和>4.8。Southern雜交結(jié)果顯示：諾西肽在12.5μg/ml濃度下對細胞內(nèi)HBVDNA的抑制率為26.4%。提示該藥可能作用于病毒生活周期的后期mRNA翻譯和蛋白質(zhì)的加工階段。此外，該藥在抑制HBV抗原的同時，顯示出明顯的促細胞生長作用，提示該藥應(yīng)用于臨床后可能發(fā)揮出抗HBV和保肝的雙重功效。他們又以同樣的指標，評價了天然多肽類抗生素恩拉霉素體外抗HBV效果[4]。結(jié)果表明，恩拉霉素對HBsAg和HBeAg的IC50分別為27和34μg/ml；TI均>4。Southern結(jié)果顯示50μg/ml恩拉霉素對細胞內(nèi)游離HBVDNA抑制率為56.8%。
2.篩選抗HBV的反義核酸
目前，基因治療是一種很有發(fā)展前景的方法，反義寡核苷酸(antisenseoligonucleotides，ASON)用于調(diào)控基因的表達已成為抗HBV研究的一個熱點問題。姚志強等[5]應(yīng)用2.2.15細胞證明：反義核酸抑制HBV基因表達具有序列特異性、劑量相關(guān)性、時效依賴性、修飾增強性、作用協(xié)同性、對宿主細胞無害性等特點。其中針對HBV mRNA SPⅡ增強子帽區(qū)、多聚腺苷信號區(qū)及S基因起始區(qū)的ASON抑制活性最高，對HBsAg抑制率可達85～90%，對HBeAg抑制率也近50～60%，反復(fù)用藥后HBV DNA同樣受到抑制。其后，有學(xué)者相繼報道針對PolyA增加信號序列、HBV前C和C基因區(qū)以及HBV基因S區(qū)和C區(qū)的翻譯起始位點的ASON對HBV表現(xiàn)出明顯的抑制效果。
, 百拇醫(yī)藥
上述工作研究的均為寡核苷酸硫代磷酸酯(PSODN)。但在進一步深入實驗之后，發(fā)現(xiàn)PSODN存在一些劑量依賴性的不良反應(yīng)，如脾腫大、血小板減少等，這些不良反應(yīng)的產(chǎn)生可能是由于寡核苷酸的多陰離子特性造成了其體內(nèi)特異性不強，多器官分布。針對這種情況，許多學(xué)者著手對其進行修飾改造，以期提高作用靶向性，降低不良反應(yīng)。
立民等人[6]證明經(jīng)陽離子脂質(zhì)體(lipofectin)介導(dǎo)后，反義寡核苷酸在加入2.2.15細胞30min后，大多進入細胞質(zhì)，而且在10min以后，大部分迅速聚積于細胞核中，它們在細胞核及細胞質(zhì)中可穩(wěn)定存在12h以上。郭軍等[7]人工合成了兩種半乳糖多聚賴氨酸導(dǎo)向配體，與熒光素標記的互補于HBVmRNA多聚腺苷酸信號部分的21聚反義硫代脫氧核苷酸(ASODN)電性結(jié)合，并與2.2.15細胞共同孵育。40min后配體組對HBsAg和HBeAg的抑制率為41～47%和28～31%，單純ASODN組為11%和5%，3d后配體組為88～89%和71～74%，對照組為64%和53%。經(jīng)分析，配體使2.2.15細胞熒光染色率達75.3%和83.8%，對照組為24.3%。后經(jīng)體內(nèi)結(jié)果證明：兩種人工配體均具有導(dǎo)向ASODN入肝細胞的功能，進而明顯提高ASODN抗HBV的活性。
, http://www.www.srpcoatings.com
鐘森等[8]針對HBV前C/C基因區(qū)設(shè)計合成了16聚硫代和脂肪鏈-硫代兩種修飾的ASON，檢測作用細胞的HBsAg、HBeAg以及HBVDNA的分泌情況。結(jié)果顯示ASON在短時作用于細胞的情況下，脂肪鏈修飾的硫代ASON的抗病毒活性顯著高于未經(jīng)脂肪鏈修飾者(P<0.002和P<0.05)。提示脂肪鏈修飾是今后ASON藥物設(shè)計和開發(fā)的一個新途徑。
3.篩選抗HBV的蛋白質(zhì)類藥物
各類干擾素為治療HBV發(fā)揮了相當重要的作用。但越來越多的實驗證明干擾素的治療效果有限，有學(xué)者轉(zhuǎn)而研究其他種蛋白質(zhì)藥物。鄧濤等[9]根據(jù)乙肝病毒核心抗原(HBcAg)的MHC-Ⅰ類分子結(jié)合的關(guān)鍵序列合成了2段抗原性多肽(PepⅠaa：18～27及PepⅡaa：141～151)，分別與轉(zhuǎn)鐵蛋白(Tf)、抗CD3的單克隆抗體(CD3McAb)和白細胞介素-2(IL-2)聯(lián)合體外誘導(dǎo)乙肝病毒抗原特異性細胞毒T細胞(HBV-CTLs)，考察其對HBV的特異性殺傷力。結(jié)果發(fā)現(xiàn)HBV-CTLs在出現(xiàn)針對2.2.15的特異性細胞毒活性，d14達高峰，分別為67%(PepⅠ+Tf+CD3McAb+IL-2)及55%(PepⅡ+Tf+CD3McAb+IL-2)。由于同時測定到Fas配體(FasL)的表達較高，并與一氧化氮(NO)的表達為正相關(guān)。作者認為Fas-FasL介導(dǎo)細胞凋亡可能是HBV-CTLs殺傷機制之一，NO可能參與了HBV-CTLs功能的調(diào)節(jié)。
, 百拇醫(yī)藥
樓敏等[10]用化學(xué)偶聯(lián)劑SPDP將鼠源性CD3與HBs單克隆抗體連接，得到HBs/CD3雙特異性抗體。實驗顯示，HBs/CD3雙特異性單克隆抗體能顯著提高LAK細胞與2.2.15細胞結(jié)合率，而且能增強其對2.2.15細胞的殺傷力，該作用與抗體濃度相關(guān)，HBsAb濃度遞增，細胞毒性作用隨之增加。對細胞毒性作用的特異性研究表明：加入HBs/CD3雙特異Ab后，LAK細胞對2.2.15細胞的殺傷力顯著高于HepG2和K562細胞組。結(jié)果表明，HBs/CD3雙特異性抗體具有雙向識別LAK細胞和2.2.15細胞的特性，可以特異地促進LAK細胞與靶細胞結(jié)合，發(fā)揮選擇性細胞毒性作用。
4.篩選抗HBV的中草藥
臨床上已經(jīng)有不少應(yīng)用中草藥治療乙型肝炎的觀察，但是尚缺乏有關(guān)的實驗依據(jù)。范濤等[11]對4種中草藥制劑體外抗HBV活性及其機制進行了研究。發(fā)現(xiàn)復(fù)方黃芪浸膏水提取液對HBsAg和HBeAg的抑制率較高，但對HBVDNA無明顯抑制，提示該藥可能作用于病毒的轉(zhuǎn)錄、翻譯和蛋白合成等環(huán)節(jié)或直接與病毒蛋白結(jié)合而致HBsAg及HBeAg滴度下降。
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文立民等[12]以培養(yǎng)上清液中HBsAg和HBeAg滴度作為評價天然藥物抗HBV效果的指標，對板藍根、苦味葉下珠和4種中藥混合物的抗HBV作用進行了比較。結(jié)果顯示，苦味葉下珠與4種中藥的混合物抗HBV的作用較強，可望成為有潛力的抗HBV藥物。
劉莊等[13]則考察了不同品種、劑型和添加成分的葉下珠提取物抗HBV的作用。其中沱茶珍珠草抗HBV作用最明顯，在濃度為500mg/L時對HBsAg的抑制率可達100%，而未顯示出明顯的細胞毒。同時還觀察到葉下珠提取物對病毒顆粒的抑制作用不僅發(fā)生在轉(zhuǎn)錄前水平，對mRNA的翻譯可能也有影響。他們又對動物藥華蟾素體外抗HBV活性進行了研究[14]。結(jié)果顯示，該藥對HBsAg和HBeAg的ID50分別為0.08和0.07g/ml，CD50為2.5mg/ml，HBsAg為31.3，HBeAg為35.7，而且它對細胞內(nèi)HBVDNA及其復(fù)制中間體呈劑量依賴型抑制。
張均倡等[15]用2.2.15細胞株模型評價了肝康對HBsAg、HBeAg、HBVDNA的抑制效果。發(fā)現(xiàn)從用藥到見效需要3～4d，之后可出現(xiàn)明顯的量效依賴性抑制作用，維持3～5天后逐漸減弱、消失，同時發(fā)現(xiàn)病毒復(fù)制、分泌越旺盛，抑制作用越強。
, http://www.www.srpcoatings.com
目前，國外篩選的抗HBV藥物主要集中在化學(xué)合成藥物上，尤其是核苷類似物。該類藥物主要作用于HBVDNAP，而未能抑制其他的復(fù)制中間體，造成停藥后發(fā)生“反跳”，反義核酸可以與靶mRNA序列特異性結(jié)合，抑制HBV基因表達，從而達到治療效果。
雖然2.2.15細胞株只是一個體外實驗系統(tǒng)，脫離了機體中免疫系統(tǒng)對HBV產(chǎn)生影響的環(huán)境。但是該細胞模型以及其他已建立的細胞培養(yǎng)系統(tǒng)，為全面、準確評價藥物抗HBV效果提供了科學(xué)依據(jù)，為進一步開發(fā)抗HBV新藥提供了堅實的基礎(chǔ)，在抗HBV藥物的研究開發(fā)工作中起著重要的作用。
參考文獻
1.Sureauc，RometLemonnejl，MullinsjI，et al.Production of hepatitis B virus by differrentiated human hepatome celllline after transfection with cloned circular HBVDNA.Cell，1986，47∶37
, 百拇醫(yī)藥
2.朱永廉.βL2',3'雙脫氧5氟胞苷在體外對乙型肝炎病毒復(fù)制的抑制作用.浙江醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，1998，27(3)∶97
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