磷酸二酯酶與陰莖勃起
近年來，隨著勃起神經(jīng)遞質(zhì)和海綿體平滑肌功能等有關(guān)陰莖勃起機(jī)制研究的巨大進(jìn)展，出現(xiàn)了許多治療勃起功能障礙的藥物，并取得較好的療效，如罌粟堿、西地那非、泛地那非和塔地那非等。上述藥物的作用均與控制陰莖勃起的的關(guān)鍵因素磷酸二酯酶(phosphodiesterases，PDEs)有關(guān)，對(duì)其深入了解有助于陰莖勃起機(jī)制的理解和勃起功能障礙療法的開發(fā)。
一、陰莖勃起的分子機(jī)制
陰莖勃起的分子機(jī)制是各種性刺激作用于陰莖海綿體中氧化氮能神經(jīng)的nNOS(neuronal nitric oxide synthase， 神經(jīng)源性一氧化氮合酶)及血管內(nèi)皮細(xì)胞的eNOS(endothelial NOS， 內(nèi)皮源性一氧化氮合酶)，后者分解左旋精氨酸生成NO(nitric oxide， 一氧化氮)。NO作用于海綿體平滑肌細(xì)胞內(nèi)的靶分子sGC(soluble guanylate cyclase， 可溶型鳥苷酸環(huán)化酶)，使GTP轉(zhuǎn)化為第二信使cGMP，后者激活PKG-I (cGMP-dependent protein kinase I， cGMP依賴性蛋白激酶I)，使平滑肌細(xì)胞內(nèi)Ca2+降低，引起平滑肌舒張。PKG-I在陰莖海綿體平滑肌細(xì)胞有表達(dá)，并分為兩型：PKG-Iα和PKG-Iβ(它們?cè)贜-末端結(jié)構(gòu)差異)，PKG-Iβ起主導(dǎo)作用。海綿體平滑肌舒張的誘導(dǎo)還可能與cGMP依賴性蛋白激酶及離子通道的活化有關(guān)，如細(xì)胞內(nèi)Ca2+離子的轉(zhuǎn)移和鉀通道開放，平滑肌細(xì)胞去極化。有人認(rèn)為，cGMP 對(duì)非興奮細(xì)胞Ca2+內(nèi)流的作用是濃度依賴性的，低濃度 cGMP激活Ca2+內(nèi)流，而高濃度則抑制。
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5型磷酸二脂酶(type 5 phosphodiesterase，PDE5)可水解cGMP變?yōu)闊o活性的GMP，使平滑肌細(xì)胞內(nèi)Ca2+增加，平滑肌收縮導(dǎo)致陰莖疲軟。
陰莖勃起的質(zhì)量(硬度和維持時(shí)間)取決于NO、cGMP等舒張因素與NE、PDE5等收縮因素的平衡關(guān)系。如NO主導(dǎo)，則陰莖勃起；如PDE5主導(dǎo)，則陰莖疲軟。多數(shù)勃起功能障礙(ED)發(fā)生的直接原因是NO減少或/和PDE5增高，NO/PDE5負(fù)平衡。
二、磷酸二酯酶及其在陰莖海綿體組織的表達(dá)
磷酸二酯酶(PDEs)由至少15個(gè)基因編碼，分為11個(gè)家族和21個(gè)亞族，其中6個(gè)家族(PDE1、PDE3、PDE4、PDE5、PDE8和PDE11等)中又有2-3個(gè)以上的基因編碼或剪切體(共53個(gè))。PDEs分類的基礎(chǔ)是其不同的氨基酸序列、對(duì)cAMP和/或cGMP的親合力、水解cNMP的動(dòng)力學(xué)特性及對(duì)PDE特異性抑制劑的敏感性等。每個(gè)PDE 包含一個(gè)特有的催化區(qū)域，長(zhǎng)約270個(gè)氨基酸，位于蛋白的碳末端。在PDEs的氨基末端包含一個(gè)調(diào)節(jié)區(qū)，PDEs之間不同，有鈣/鈣調(diào)素結(jié)合位點(diǎn)、cNMP 結(jié)合位點(diǎn)、膜定位區(qū)域和磷酸化位點(diǎn)。
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NO與cNMP信號(hào)的聯(lián)系是通過控制不同亞型的PDE實(shí)現(xiàn)的。不同類型的PDE分布各有不同重點(diǎn)，如PDE1(Ca2+/鈣調(diào)素calmodulin刺激)是腦、腎和平滑肌同功酶，PDE2(cGMP刺激)是腎上腺皮質(zhì)同功酶，PDE3(cAMP特異，cGMP抑制)是平滑肌、血小板及心肌同功酶，抑制劑為milrinone，PDE4(cAMP特異)是腦和肺淋巴組織同功酶，PDE5(cGMP結(jié)合， cGMP特異)是陰莖海綿體、血管、內(nèi)臟、消化道、視網(wǎng)膜、氣管平滑肌和血小板同功酶，PDE6(cGMP特異)是人視網(wǎng)膜光感受器同功酶，PDE7(cAMP特異)是骨骼肌、心臟和淋巴細(xì)胞同功酶，PDE8 (cAMP特異)分布廣泛，是睪丸、卵巢和腸管同功酶，PDE9 (cGMP特異)是脾、小腸和大腦同功酶，PDE10 是大腦、睪丸和甲狀腺同功酶，PDE11(與PDE5 類似，但有不同的生化特性。有三型PDE11A1、PDE11A2和PDE11A3)是骨骼肌、血管及內(nèi)臟平滑肌、垂體、肝臟和腎臟同功酶。
PDE5(cGMP結(jié)合，cGMP特異)是陰莖海綿體、血管、內(nèi)臟、消化道、視網(wǎng)膜、氣管平滑肌和血小板同功酶。PDE5有三型：PDE5A1(Km6.2)、PDE5A2(Km5.75)和PDE5A3(Km6.06)。PDE5A1的cDNA編碼一個(gè)100 kDa的蛋白，與牛PDE5A1有95%同源，在酵母表達(dá)的人重組PDE5A1水解cGMP的Km為6.1μM，其作用可為zaprinast(IC50：505nM)所抑制。PDE5A2是人PDE5A基因的5`剪切變異體，預(yù)測(cè)編碼95 kDa的蛋白，有833個(gè)氨基酸，其氨基端有8個(gè)獨(dú)有的氨基酸，與PDE5A1蛋白不同。PDE5A3 碳末端的823個(gè)氨基酸與PDE5A1、PDE5A2 同源。PDE5A基因定位于人染色體4q26的CEPH YACs851A5、851B10和935F6。PDE5A的cDNA全序列長(zhǎng)約為3.1kb，編碼875個(gè)氨基酸的蛋白，分子量為100 kD。由人PDE5 mRNA轉(zhuǎn)錄翻譯出的蛋白質(zhì)(PDE5)包括三個(gè)功能區(qū)域：(1)催化區(qū)，第588-829氨基酸；(2)cGMP結(jié)合區(qū)，第152-536氨基酸；(3)磷酸化位點(diǎn)，第102氨基酸。
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截止目前，利用RT-PCR法和Nothern Blot分析法已發(fā)現(xiàn)人陰莖海綿體組織中有14種PDE的mRNA表達(dá)。其中有能水解cAMP和cGMP的PDE1A、PDE1B、PDE1C、PDE2A和PDE10A，有cAMP特異性的PDE3A、PDE4A-D、PDE7A和PDE8A，以及cGMP特異性的PDE5A和PDE9A。在PDE的多種同功酶之間，存在著廣泛的交叉作用，如cGMP可抑制PDE3的活性，而前者又為PDE1、PDE2、PDE5、PDE9和PDE10等水解。由此可見，細(xì)胞內(nèi)第二信使cAMP和cGMP的降解遠(yuǎn)比想象的復(fù)雜�，F(xiàn)已認(rèn)識(shí)到，在人陰莖海綿體平滑肌的舒縮控制中，cAMP與cGMP同樣重要。
在人陰莖海綿體平滑肌細(xì)胞懸液中已分離出的PDE蛋白有PDE2、PDE3、PDE4和PDE5。但四種PDES的共表達(dá)并非意味著它們有同等重要性，功能試驗(yàn)分析提示PDE3和PDE5在人海綿體組織內(nèi)起中心調(diào)節(jié)作用，兩者在人海綿體組織表達(dá)的量也能說明上述問題。
, 百拇醫(yī)藥 PDE5mRNA在人陰莖海綿體及主動(dòng)脈平滑肌、心臟、胎盤、骨骼肌及胰腺等組織均有表達(dá)。Stief認(rèn)為人陰莖海綿體平滑肌的張力主要由cAMP特異，cGMP抑制的PDE3控制，而Ballard等則認(rèn)為在陰莖海綿體平滑肌細(xì)胞中降解cNMP 的主要是PDE5。但無論如何，兩種結(jié)論都是有事實(shí)依據(jù)的：海綿體注射milrinone(PDE3抑制劑)和口服西地那非(sildenafil，PDE5抑制劑)均能誘發(fā)陰莖勃起。
三、磷酸二酯酶與陰莖勃起功能障礙
(一) PDE5抑制劑與陰莖勃起功能障礙的治療
數(shù)十年來，非選擇性PDE抑制劑如咖啡因、茶堿和IBMX等已被用于研究環(huán)核苷酸(cNMP)和PDE活性的生理學(xué)影響。雖屬同類藥物，但上述抑制劑缺乏特異性，它們阻斷幾乎所有已知PDEs的催化活性，在治療的同時(shí)可能伴發(fā)過多的不良反應(yīng)。臨床應(yīng)用的第一個(gè)選擇性PDE抑制劑是用于治療某些心臟病的PDE3抑制劑(如milrinone)，另一藥物咯利普蘭是選擇性PDE4抑制劑，具有擴(kuò)張支氣管和抗炎癥的效果，而它對(duì)其他的PDEs，只有在極高濃度時(shí)才有影響。這些特性使其具有較高的選擇性和特異性作用。
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近年已經(jīng)開發(fā)了對(duì)PDE5有高度選擇性和效能的一些藥物，如淫羊霍甙(icariin)和扎普司特(zaprinast)等，后者是一種與cGMP結(jié)構(gòu)類似的藥物，它是比茶堿和IBMX等藥物選擇性更強(qiáng)的PDEs抑制劑。扎普司特高效能和高選擇性的作用使其成為更有選擇性的藥理學(xué)制劑。在扎普司特的促動(dòng)下，另一個(gè)主要的在選擇性方面取得飛躍的藥物，是在上世紀(jì)九十年代早期發(fā)展的枸緣酸西地那非(sildenafil citrate，PDE5:IC50=3.5nmol；萬(wàn)艾可-Viagra，在1998年上市銷售)。此外更多的化合物如鹽酸泛地那非(vardenafil，PDE5:IC50=0.14nmol)和塔地那非(Tadalafil，PDE5:IC50=6.7nmol)等也已進(jìn)入歐洲市場(chǎng)。其它高效和高選擇性的PDE5抑制劑也在研發(fā)中，并可利用西地那非5年臨床應(yīng)用所獲得的大量信息。截至目前，在全世界已經(jīng)有一千六百萬(wàn)多人接受一億多個(gè)西地那非處方。
應(yīng)用PDE5抑制劑治療勃起功能障礙，雖然有著關(guān)于功效和安全性的問題，但是也有與口服給藥方便和隨意性好相關(guān)的優(yōu)點(diǎn)�？诜庨_始起效的時(shí)間受藥物吸收率和通過血液循環(huán)時(shí)間所限制。期望PDE5抑制劑起效發(fā)生在通常適合大多數(shù)夫妻的需要的短時(shí)間內(nèi)。勃起監(jiān)測(cè)儀RigiScan觀測(cè)結(jié)果表明，勃起功能障礙病人接受50mg西地那非，隨即接受視覺性刺激最早開始起作用是在12分鐘。在此研究中，17例接受西地那非的病人中有14例對(duì)視覺性刺激起反應(yīng)(82%)。而14例有反應(yīng)的患者中12例(86%)在30分鐘內(nèi)達(dá)到勃起。同樣的在RigiScan的研究中用視覺性刺激，接受20mg或40mg泛地那非后勃起開始的平均時(shí)間是26分鐘(n=21)，接受10mg塔地那非的患者平均起效時(shí)間為45分鐘(n=61)。
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PDE5抑制劑的副反應(yīng)常是短暫的和可逆性的，有頭痛、面色潮紅、消化不良、鼻塞、肌痛、背痛和視覺顏色紊亂。特別應(yīng)關(guān)注的是PDE5抑制劑和NO- cGMP系統(tǒng)的相互作用，已知西地那非能放大硝酸酯類藥物治療心絞痛時(shí)的降血壓效應(yīng)。這種協(xié)同作用主要是因?yàn)镻DE5分布在所有血管平滑肌上。提供外源性的NO時(shí)，導(dǎo)致cGMP產(chǎn)生增加，西地那非增加cGMP的水平并且發(fā)生大范圍的血管舒張。這個(gè)相互作用是和通過NO-cGMP途徑作用的PDE5抑制劑相關(guān)的。停止硝酸酯類藥物和安全應(yīng)用PDE5抑制劑治療之間的時(shí)間窗對(duì)長(zhǎng)效PDE5抑制劑存在更多問題。
口服給藥的另一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是可靠性。一項(xiàng)研究顯示應(yīng)用西地那非治療勃起功能障礙和海綿體內(nèi)注射前列腺素的病人有相同的自信心。對(duì)于任何給藥途徑，必須權(quán)衡其方便性、有效性和安全性，滿足病人的需要。
積累有關(guān)PDE5抑制劑安全和效力的數(shù)據(jù)是非常重要的。西地那非在1998年進(jìn)入市場(chǎng)，有長(zhǎng)期應(yīng)用記錄，11000個(gè)病人參與臨床試驗(yàn)。在臨床試驗(yàn)中，應(yīng)用西地那非(100mg)后，43%-85%(均數(shù)為82%)以上的器質(zhì)性ED病人勃起功能改善。西地那非有效率的差異主要源于ED的病因，如前列腺根治性切除術(shù)后病人的療效可能低至43%，而有輕微神經(jīng)性病變病人的有效率高達(dá)85%。西地那非的可耐受的副反應(yīng)發(fā)生率較低，并且由于副反應(yīng)事件而停止用藥率也很低。最近一項(xiàng)調(diào)查報(bào)告證實(shí)，西地那非服用者因心梗死亡率較同齡對(duì)照組并無增高。
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近期開發(fā)出的PDE5的抑制劑，如泛地那非和塔地那非的療效和安全性也已得到初步證實(shí)。泛地那非是貝爾公司開發(fā)的高效PDE5抑制劑，已證實(shí)其能在NO前體物存在的條件下誘發(fā)兔陰莖勃起。Klotz等報(bào)告用泛地那非(10mg或20mg，單劑口服)治療21例ED患者，試驗(yàn)采用隨機(jī)、雙盲交叉方式進(jìn)行。服藥后，所有患者均接受VSS(visual sexual stimulation)-RigiScan檢測(cè)。結(jié)果顯示，低劑量泛地那非(10mg)患者較服用安慰劑的患者勃起(硬度>；60%)持續(xù)時(shí)間增加24.4 min(陰莖根部)和24.8 min(陰莖頭部)；高劑量泛地那非(20 mg)患者較安慰劑組患者勃起(硬度>；60%)持續(xù)時(shí)間增加37.2 min(陰莖根部)和28.7 min(陰莖頭部)。單劑泛地那非(10 mg和20 mg)服用后達(dá)到最大血藥濃度時(shí)間(Tmax)分別平均為0.9 h和0.7 h，達(dá)峰后藥物濃度半數(shù)遞減時(shí)間分別為4.2 h和3.9 h。藥物的不良反應(yīng)主要是輕度的血壓下降和心率加速，未觀察到心電圖和化驗(yàn)指標(biāo)的變化。
, 百拇醫(yī)藥 在一項(xiàng)多中心、雙盲、空白對(duì)照試驗(yàn)中，179例患者(平均年齡56歲)接受了塔地那非(2、5、10或25 mg)治療。結(jié)果顯示除2 mg組外，塔地那非能顯著改善患者的IIEF-Q3(問題3：性交時(shí)維持勃起能力)和IIEF-Q4(問題4：性交至完畢時(shí)維持勃起的能力)。與西地那非和泛地那非不同的是，塔地那非的體內(nèi)半衰期長(zhǎng)達(dá)18h，其藥效可達(dá)24h。塔地那非治療最常見的不良反應(yīng)是頭痛和消化不良，治療中患者化驗(yàn)檢查、心電圖和血壓等無明顯變化。
西地那非和泛地那非有相似的化學(xué)結(jié)構(gòu)，但后者有一個(gè)甲基結(jié)構(gòu)，因此當(dāng)應(yīng)用于大量病人時(shí)可能導(dǎo)致不同的臨床效果。由于西地那非對(duì)PDE5的抑制已近極限，因而不能指望泛地那非和塔地那非的療效更高。而且由于應(yīng)用時(shí)間的限制，目前尚無足夠資料證實(shí)泛地那非和塔地那非長(zhǎng)期應(yīng)用和高危人群應(yīng)用的安全性。
(二) 針對(duì)磷酸二酯酶的基因治療
以PDE5基因反義寡脫氧核苷酸直接轉(zhuǎn)染人陰莖海綿體，只抑制PDE5在海綿平滑肌細(xì)胞的表達(dá)，進(jìn)而增加平滑肌細(xì)胞內(nèi)cGMP濃度，促進(jìn)海綿體平滑肌的舒張，增強(qiáng)陰莖的勃起，同時(shí)又可避免對(duì)其它組織、器官的副作用。截至目前，ED的該種基因治療國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)尚未見報(bào)告。人PDE5mRNA長(zhǎng)為3041bp，內(nèi)有21個(gè)外顯子。最近，Lin等發(fā)現(xiàn)有一個(gè)長(zhǎng)為139 bp的啟動(dòng)子序列包含了第一外顯子(78 bp)，在PDE5基因的轉(zhuǎn)錄中起關(guān)鍵作用。封閉其序列，可干擾PDE5基因的轉(zhuǎn)錄及PDE5的合成。我們?cè)O(shè)計(jì)的人PDE5基因反義寡核苷酸(含第1外顯子部分序列)，長(zhǎng)為20bp， 與脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑DOTAP共同轉(zhuǎn)染人陰莖海綿體原代細(xì)胞后，可直接結(jié)合到DNA雙鏈的特定部位，形成三聚體，影響轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合，使轉(zhuǎn)錄過程不能啟動(dòng)。還能與PDE5DNA以堿基互補(bǔ)原則相結(jié)合形成DNA-RNA復(fù)合物， 易被RNA酶所破壞，另一方面DNA-RNA復(fù)合物和RNA-RNA復(fù)合物阻斷了mRNA的轉(zhuǎn)錄或mRNA與某些轉(zhuǎn)錄蛋白質(zhì)相結(jié)合， 從而抑制PDE5的合成。
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本研究結(jié)果顯示，反義實(shí)驗(yàn)組平滑肌細(xì)胞內(nèi)cGMP在轉(zhuǎn)染后1-6h顯著增高(28.18%-37.98%)，高于兩對(duì)照組(p=0.000-0.018)。轉(zhuǎn)染后10-48h， 反義組細(xì)胞的cGMP與兩對(duì)照組無顯著差別(p=0.146-0.816)。由于培養(yǎng)細(xì)胞數(shù)量有限，未能觀察到48h后的變化。另外，在實(shí)驗(yàn)中加入NO供體能否進(jìn)一步增加細(xì)胞內(nèi)cGMP的水平則是深入研究的內(nèi)容。盡管cGMP能抑制PDE3，可能使細(xì)胞內(nèi)cAMP濃度增加，但本研究未能觀察到上述變化。其原因可能是本實(shí)驗(yàn)中cGMP的增加不足以明顯抑制PDE3，還有可能是時(shí)間有限未能觀察到cAMP的變化。
本題涉及的治療基因目標(biāo)明確，即PDE5 ，而且向陰莖海綿體組織轉(zhuǎn)染靶向性好，將來解決了轉(zhuǎn)染基因的降解問題后，相信該項(xiàng)治療的前景良好。當(dāng)然，該項(xiàng)治療的持久性和可控性也是重要的問題，轉(zhuǎn)染基因的長(zhǎng)期表達(dá)(持久性)需要進(jìn)一步的研究，與萬(wàn)艾可相似，該項(xiàng)治療也需性刺激才能發(fā)揮作用。
四、結(jié)語(yǔ)
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選擇性PDE5抑制劑是一類新的有前途的治療勃起功能障礙的高效的藥物。每一種藥物基于其特有的分子結(jié)構(gòu)而具有獨(dú)特的藥理學(xué)特性。然而，對(duì)PDE5催化位點(diǎn)親和性的不同導(dǎo)致體外效能不同，但不影響體內(nèi)臨床效能。此外，因?yàn)楹推渌黀DEs的交叉親和性，每一種PDE5抑制劑有不同的選擇性和安全范圍。西地那非是PDE5抑制劑最先應(yīng)用的，通過5年廣泛臨床應(yīng)用，有效性和特別好的耐受性得到廣泛承認(rèn)。然而，PDE5抑制劑代表一類新的藥物種類，為確保繼續(xù)出現(xiàn)的治療勃起功能障礙藥物品種的安全性，必須對(duì)它們進(jìn)行仔細(xì)的臨床評(píng)估。
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責(zé)任編輯：王薇, 百拇醫(yī)藥
一、陰莖勃起的分子機(jī)制
陰莖勃起的分子機(jī)制是各種性刺激作用于陰莖海綿體中氧化氮能神經(jīng)的nNOS(neuronal nitric oxide synthase， 神經(jīng)源性一氧化氮合酶)及血管內(nèi)皮細(xì)胞的eNOS(endothelial NOS， 內(nèi)皮源性一氧化氮合酶)，后者分解左旋精氨酸生成NO(nitric oxide， 一氧化氮)。NO作用于海綿體平滑肌細(xì)胞內(nèi)的靶分子sGC(soluble guanylate cyclase， 可溶型鳥苷酸環(huán)化酶)，使GTP轉(zhuǎn)化為第二信使cGMP，后者激活PKG-I (cGMP-dependent protein kinase I， cGMP依賴性蛋白激酶I)，使平滑肌細(xì)胞內(nèi)Ca2+降低，引起平滑肌舒張。PKG-I在陰莖海綿體平滑肌細(xì)胞有表達(dá)，并分為兩型：PKG-Iα和PKG-Iβ(它們?cè)贜-末端結(jié)構(gòu)差異)，PKG-Iβ起主導(dǎo)作用。海綿體平滑肌舒張的誘導(dǎo)還可能與cGMP依賴性蛋白激酶及離子通道的活化有關(guān)，如細(xì)胞內(nèi)Ca2+離子的轉(zhuǎn)移和鉀通道開放，平滑肌細(xì)胞去極化。有人認(rèn)為，cGMP 對(duì)非興奮細(xì)胞Ca2+內(nèi)流的作用是濃度依賴性的，低濃度 cGMP激活Ca2+內(nèi)流，而高濃度則抑制。
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5型磷酸二脂酶(type 5 phosphodiesterase，PDE5)可水解cGMP變?yōu)闊o活性的GMP，使平滑肌細(xì)胞內(nèi)Ca2+增加，平滑肌收縮導(dǎo)致陰莖疲軟。
陰莖勃起的質(zhì)量(硬度和維持時(shí)間)取決于NO、cGMP等舒張因素與NE、PDE5等收縮因素的平衡關(guān)系。如NO主導(dǎo)，則陰莖勃起；如PDE5主導(dǎo)，則陰莖疲軟。多數(shù)勃起功能障礙(ED)發(fā)生的直接原因是NO減少或/和PDE5增高，NO/PDE5負(fù)平衡。
二、磷酸二酯酶及其在陰莖海綿體組織的表達(dá)
磷酸二酯酶(PDEs)由至少15個(gè)基因編碼，分為11個(gè)家族和21個(gè)亞族，其中6個(gè)家族(PDE1、PDE3、PDE4、PDE5、PDE8和PDE11等)中又有2-3個(gè)以上的基因編碼或剪切體(共53個(gè))。PDEs分類的基礎(chǔ)是其不同的氨基酸序列、對(duì)cAMP和/或cGMP的親合力、水解cNMP的動(dòng)力學(xué)特性及對(duì)PDE特異性抑制劑的敏感性等。每個(gè)PDE 包含一個(gè)特有的催化區(qū)域，長(zhǎng)約270個(gè)氨基酸，位于蛋白的碳末端。在PDEs的氨基末端包含一個(gè)調(diào)節(jié)區(qū)，PDEs之間不同，有鈣/鈣調(diào)素結(jié)合位點(diǎn)、cNMP 結(jié)合位點(diǎn)、膜定位區(qū)域和磷酸化位點(diǎn)。
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NO與cNMP信號(hào)的聯(lián)系是通過控制不同亞型的PDE實(shí)現(xiàn)的。不同類型的PDE分布各有不同重點(diǎn)，如PDE1(Ca2+/鈣調(diào)素calmodulin刺激)是腦、腎和平滑肌同功酶，PDE2(cGMP刺激)是腎上腺皮質(zhì)同功酶，PDE3(cAMP特異，cGMP抑制)是平滑肌、血小板及心肌同功酶，抑制劑為milrinone，PDE4(cAMP特異)是腦和肺淋巴組織同功酶，PDE5(cGMP結(jié)合， cGMP特異)是陰莖海綿體、血管、內(nèi)臟、消化道、視網(wǎng)膜、氣管平滑肌和血小板同功酶，PDE6(cGMP特異)是人視網(wǎng)膜光感受器同功酶，PDE7(cAMP特異)是骨骼肌、心臟和淋巴細(xì)胞同功酶，PDE8 (cAMP特異)分布廣泛，是睪丸、卵巢和腸管同功酶，PDE9 (cGMP特異)是脾、小腸和大腦同功酶，PDE10 是大腦、睪丸和甲狀腺同功酶，PDE11(與PDE5 類似，但有不同的生化特性。有三型PDE11A1、PDE11A2和PDE11A3)是骨骼肌、血管及內(nèi)臟平滑肌、垂體、肝臟和腎臟同功酶。
PDE5(cGMP結(jié)合，cGMP特異)是陰莖海綿體、血管、內(nèi)臟、消化道、視網(wǎng)膜、氣管平滑肌和血小板同功酶。PDE5有三型：PDE5A1(Km6.2)、PDE5A2(Km5.75)和PDE5A3(Km6.06)。PDE5A1的cDNA編碼一個(gè)100 kDa的蛋白，與牛PDE5A1有95%同源，在酵母表達(dá)的人重組PDE5A1水解cGMP的Km為6.1μM，其作用可為zaprinast(IC50：505nM)所抑制。PDE5A2是人PDE5A基因的5`剪切變異體，預(yù)測(cè)編碼95 kDa的蛋白，有833個(gè)氨基酸，其氨基端有8個(gè)獨(dú)有的氨基酸，與PDE5A1蛋白不同。PDE5A3 碳末端的823個(gè)氨基酸與PDE5A1、PDE5A2 同源。PDE5A基因定位于人染色體4q26的CEPH YACs851A5、851B10和935F6。PDE5A的cDNA全序列長(zhǎng)約為3.1kb，編碼875個(gè)氨基酸的蛋白，分子量為100 kD。由人PDE5 mRNA轉(zhuǎn)錄翻譯出的蛋白質(zhì)(PDE5)包括三個(gè)功能區(qū)域：(1)催化區(qū)，第588-829氨基酸；(2)cGMP結(jié)合區(qū)，第152-536氨基酸；(3)磷酸化位點(diǎn)，第102氨基酸。
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截止目前，利用RT-PCR法和Nothern Blot分析法已發(fā)現(xiàn)人陰莖海綿體組織中有14種PDE的mRNA表達(dá)。其中有能水解cAMP和cGMP的PDE1A、PDE1B、PDE1C、PDE2A和PDE10A，有cAMP特異性的PDE3A、PDE4A-D、PDE7A和PDE8A，以及cGMP特異性的PDE5A和PDE9A。在PDE的多種同功酶之間，存在著廣泛的交叉作用，如cGMP可抑制PDE3的活性，而前者又為PDE1、PDE2、PDE5、PDE9和PDE10等水解。由此可見，細(xì)胞內(nèi)第二信使cAMP和cGMP的降解遠(yuǎn)比想象的復(fù)雜�，F(xiàn)已認(rèn)識(shí)到，在人陰莖海綿體平滑肌的舒縮控制中，cAMP與cGMP同樣重要。
在人陰莖海綿體平滑肌細(xì)胞懸液中已分離出的PDE蛋白有PDE2、PDE3、PDE4和PDE5。但四種PDES的共表達(dá)并非意味著它們有同等重要性，功能試驗(yàn)分析提示PDE3和PDE5在人海綿體組織內(nèi)起中心調(diào)節(jié)作用，兩者在人海綿體組織表達(dá)的量也能說明上述問題。
, 百拇醫(yī)藥 PDE5mRNA在人陰莖海綿體及主動(dòng)脈平滑肌、心臟、胎盤、骨骼肌及胰腺等組織均有表達(dá)。Stief認(rèn)為人陰莖海綿體平滑肌的張力主要由cAMP特異，cGMP抑制的PDE3控制，而Ballard等則認(rèn)為在陰莖海綿體平滑肌細(xì)胞中降解cNMP 的主要是PDE5。但無論如何，兩種結(jié)論都是有事實(shí)依據(jù)的：海綿體注射milrinone(PDE3抑制劑)和口服西地那非(sildenafil，PDE5抑制劑)均能誘發(fā)陰莖勃起。
三、磷酸二酯酶與陰莖勃起功能障礙
(一) PDE5抑制劑與陰莖勃起功能障礙的治療
數(shù)十年來，非選擇性PDE抑制劑如咖啡因、茶堿和IBMX等已被用于研究環(huán)核苷酸(cNMP)和PDE活性的生理學(xué)影響。雖屬同類藥物，但上述抑制劑缺乏特異性，它們阻斷幾乎所有已知PDEs的催化活性，在治療的同時(shí)可能伴發(fā)過多的不良反應(yīng)。臨床應(yīng)用的第一個(gè)選擇性PDE抑制劑是用于治療某些心臟病的PDE3抑制劑(如milrinone)，另一藥物咯利普蘭是選擇性PDE4抑制劑，具有擴(kuò)張支氣管和抗炎癥的效果，而它對(duì)其他的PDEs，只有在極高濃度時(shí)才有影響。這些特性使其具有較高的選擇性和特異性作用。
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近年已經(jīng)開發(fā)了對(duì)PDE5有高度選擇性和效能的一些藥物，如淫羊霍甙(icariin)和扎普司特(zaprinast)等，后者是一種與cGMP結(jié)構(gòu)類似的藥物，它是比茶堿和IBMX等藥物選擇性更強(qiáng)的PDEs抑制劑。扎普司特高效能和高選擇性的作用使其成為更有選擇性的藥理學(xué)制劑。在扎普司特的促動(dòng)下，另一個(gè)主要的在選擇性方面取得飛躍的藥物，是在上世紀(jì)九十年代早期發(fā)展的枸緣酸西地那非(sildenafil citrate，PDE5:IC50=3.5nmol；萬(wàn)艾可-Viagra，在1998年上市銷售)。此外更多的化合物如鹽酸泛地那非(vardenafil，PDE5:IC50=0.14nmol)和塔地那非(Tadalafil，PDE5:IC50=6.7nmol)等也已進(jìn)入歐洲市場(chǎng)。其它高效和高選擇性的PDE5抑制劑也在研發(fā)中，并可利用西地那非5年臨床應(yīng)用所獲得的大量信息。截至目前，在全世界已經(jīng)有一千六百萬(wàn)多人接受一億多個(gè)西地那非處方。
應(yīng)用PDE5抑制劑治療勃起功能障礙，雖然有著關(guān)于功效和安全性的問題，但是也有與口服給藥方便和隨意性好相關(guān)的優(yōu)點(diǎn)�？诜庨_始起效的時(shí)間受藥物吸收率和通過血液循環(huán)時(shí)間所限制。期望PDE5抑制劑起效發(fā)生在通常適合大多數(shù)夫妻的需要的短時(shí)間內(nèi)。勃起監(jiān)測(cè)儀RigiScan觀測(cè)結(jié)果表明，勃起功能障礙病人接受50mg西地那非，隨即接受視覺性刺激最早開始起作用是在12分鐘。在此研究中，17例接受西地那非的病人中有14例對(duì)視覺性刺激起反應(yīng)(82%)。而14例有反應(yīng)的患者中12例(86%)在30分鐘內(nèi)達(dá)到勃起。同樣的在RigiScan的研究中用視覺性刺激，接受20mg或40mg泛地那非后勃起開始的平均時(shí)間是26分鐘(n=21)，接受10mg塔地那非的患者平均起效時(shí)間為45分鐘(n=61)。
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PDE5抑制劑的副反應(yīng)常是短暫的和可逆性的，有頭痛、面色潮紅、消化不良、鼻塞、肌痛、背痛和視覺顏色紊亂。特別應(yīng)關(guān)注的是PDE5抑制劑和NO- cGMP系統(tǒng)的相互作用，已知西地那非能放大硝酸酯類藥物治療心絞痛時(shí)的降血壓效應(yīng)。這種協(xié)同作用主要是因?yàn)镻DE5分布在所有血管平滑肌上。提供外源性的NO時(shí)，導(dǎo)致cGMP產(chǎn)生增加，西地那非增加cGMP的水平并且發(fā)生大范圍的血管舒張。這個(gè)相互作用是和通過NO-cGMP途徑作用的PDE5抑制劑相關(guān)的。停止硝酸酯類藥物和安全應(yīng)用PDE5抑制劑治療之間的時(shí)間窗對(duì)長(zhǎng)效PDE5抑制劑存在更多問題。
口服給藥的另一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是可靠性。一項(xiàng)研究顯示應(yīng)用西地那非治療勃起功能障礙和海綿體內(nèi)注射前列腺素的病人有相同的自信心。對(duì)于任何給藥途徑，必須權(quán)衡其方便性、有效性和安全性，滿足病人的需要。
積累有關(guān)PDE5抑制劑安全和效力的數(shù)據(jù)是非常重要的。西地那非在1998年進(jìn)入市場(chǎng)，有長(zhǎng)期應(yīng)用記錄，11000個(gè)病人參與臨床試驗(yàn)。在臨床試驗(yàn)中，應(yīng)用西地那非(100mg)后，43%-85%(均數(shù)為82%)以上的器質(zhì)性ED病人勃起功能改善。西地那非有效率的差異主要源于ED的病因，如前列腺根治性切除術(shù)后病人的療效可能低至43%，而有輕微神經(jīng)性病變病人的有效率高達(dá)85%。西地那非的可耐受的副反應(yīng)發(fā)生率較低，并且由于副反應(yīng)事件而停止用藥率也很低。最近一項(xiàng)調(diào)查報(bào)告證實(shí)，西地那非服用者因心梗死亡率較同齡對(duì)照組并無增高。
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近期開發(fā)出的PDE5的抑制劑，如泛地那非和塔地那非的療效和安全性也已得到初步證實(shí)。泛地那非是貝爾公司開發(fā)的高效PDE5抑制劑，已證實(shí)其能在NO前體物存在的條件下誘發(fā)兔陰莖勃起。Klotz等報(bào)告用泛地那非(10mg或20mg，單劑口服)治療21例ED患者，試驗(yàn)采用隨機(jī)、雙盲交叉方式進(jìn)行。服藥后，所有患者均接受VSS(visual sexual stimulation)-RigiScan檢測(cè)。結(jié)果顯示，低劑量泛地那非(10mg)患者較服用安慰劑的患者勃起(硬度>；60%)持續(xù)時(shí)間增加24.4 min(陰莖根部)和24.8 min(陰莖頭部)；高劑量泛地那非(20 mg)患者較安慰劑組患者勃起(硬度>；60%)持續(xù)時(shí)間增加37.2 min(陰莖根部)和28.7 min(陰莖頭部)。單劑泛地那非(10 mg和20 mg)服用后達(dá)到最大血藥濃度時(shí)間(Tmax)分別平均為0.9 h和0.7 h，達(dá)峰后藥物濃度半數(shù)遞減時(shí)間分別為4.2 h和3.9 h。藥物的不良反應(yīng)主要是輕度的血壓下降和心率加速，未觀察到心電圖和化驗(yàn)指標(biāo)的變化。
, 百拇醫(yī)藥 在一項(xiàng)多中心、雙盲、空白對(duì)照試驗(yàn)中，179例患者(平均年齡56歲)接受了塔地那非(2、5、10或25 mg)治療。結(jié)果顯示除2 mg組外，塔地那非能顯著改善患者的IIEF-Q3(問題3：性交時(shí)維持勃起能力)和IIEF-Q4(問題4：性交至完畢時(shí)維持勃起的能力)。與西地那非和泛地那非不同的是，塔地那非的體內(nèi)半衰期長(zhǎng)達(dá)18h，其藥效可達(dá)24h。塔地那非治療最常見的不良反應(yīng)是頭痛和消化不良，治療中患者化驗(yàn)檢查、心電圖和血壓等無明顯變化。
西地那非和泛地那非有相似的化學(xué)結(jié)構(gòu)，但后者有一個(gè)甲基結(jié)構(gòu)，因此當(dāng)應(yīng)用于大量病人時(shí)可能導(dǎo)致不同的臨床效果。由于西地那非對(duì)PDE5的抑制已近極限，因而不能指望泛地那非和塔地那非的療效更高。而且由于應(yīng)用時(shí)間的限制，目前尚無足夠資料證實(shí)泛地那非和塔地那非長(zhǎng)期應(yīng)用和高危人群應(yīng)用的安全性。
(二) 針對(duì)磷酸二酯酶的基因治療
以PDE5基因反義寡脫氧核苷酸直接轉(zhuǎn)染人陰莖海綿體，只抑制PDE5在海綿平滑肌細(xì)胞的表達(dá)，進(jìn)而增加平滑肌細(xì)胞內(nèi)cGMP濃度，促進(jìn)海綿體平滑肌的舒張，增強(qiáng)陰莖的勃起，同時(shí)又可避免對(duì)其它組織、器官的副作用。截至目前，ED的該種基因治療國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)尚未見報(bào)告。人PDE5mRNA長(zhǎng)為3041bp，內(nèi)有21個(gè)外顯子。最近，Lin等發(fā)現(xiàn)有一個(gè)長(zhǎng)為139 bp的啟動(dòng)子序列包含了第一外顯子(78 bp)，在PDE5基因的轉(zhuǎn)錄中起關(guān)鍵作用。封閉其序列，可干擾PDE5基因的轉(zhuǎn)錄及PDE5的合成。我們?cè)O(shè)計(jì)的人PDE5基因反義寡核苷酸(含第1外顯子部分序列)，長(zhǎng)為20bp， 與脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑DOTAP共同轉(zhuǎn)染人陰莖海綿體原代細(xì)胞后，可直接結(jié)合到DNA雙鏈的特定部位，形成三聚體，影響轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合，使轉(zhuǎn)錄過程不能啟動(dòng)。還能與PDE5DNA以堿基互補(bǔ)原則相結(jié)合形成DNA-RNA復(fù)合物， 易被RNA酶所破壞，另一方面DNA-RNA復(fù)合物和RNA-RNA復(fù)合物阻斷了mRNA的轉(zhuǎn)錄或mRNA與某些轉(zhuǎn)錄蛋白質(zhì)相結(jié)合， 從而抑制PDE5的合成。
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本研究結(jié)果顯示，反義實(shí)驗(yàn)組平滑肌細(xì)胞內(nèi)cGMP在轉(zhuǎn)染后1-6h顯著增高(28.18%-37.98%)，高于兩對(duì)照組(p=0.000-0.018)。轉(zhuǎn)染后10-48h， 反義組細(xì)胞的cGMP與兩對(duì)照組無顯著差別(p=0.146-0.816)。由于培養(yǎng)細(xì)胞數(shù)量有限，未能觀察到48h后的變化。另外，在實(shí)驗(yàn)中加入NO供體能否進(jìn)一步增加細(xì)胞內(nèi)cGMP的水平則是深入研究的內(nèi)容。盡管cGMP能抑制PDE3，可能使細(xì)胞內(nèi)cAMP濃度增加，但本研究未能觀察到上述變化。其原因可能是本實(shí)驗(yàn)中cGMP的增加不足以明顯抑制PDE3，還有可能是時(shí)間有限未能觀察到cAMP的變化。
本題涉及的治療基因目標(biāo)明確，即PDE5 ，而且向陰莖海綿體組織轉(zhuǎn)染靶向性好，將來解決了轉(zhuǎn)染基因的降解問題后，相信該項(xiàng)治療的前景良好。當(dāng)然，該項(xiàng)治療的持久性和可控性也是重要的問題，轉(zhuǎn)染基因的長(zhǎng)期表達(dá)(持久性)需要進(jìn)一步的研究，與萬(wàn)艾可相似，該項(xiàng)治療也需性刺激才能發(fā)揮作用。
四、結(jié)語(yǔ)
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選擇性PDE5抑制劑是一類新的有前途的治療勃起功能障礙的高效的藥物。每一種藥物基于其特有的分子結(jié)構(gòu)而具有獨(dú)特的藥理學(xué)特性。然而，對(duì)PDE5催化位點(diǎn)親和性的不同導(dǎo)致體外效能不同，但不影響體內(nèi)臨床效能。此外，因?yàn)楹推渌黀DEs的交叉親和性，每一種PDE5抑制劑有不同的選擇性和安全范圍。西地那非是PDE5抑制劑最先應(yīng)用的，通過5年廣泛臨床應(yīng)用，有效性和特別好的耐受性得到廣泛承認(rèn)。然而，PDE5抑制劑代表一類新的藥物種類，為確保繼續(xù)出現(xiàn)的治療勃起功能障礙藥物品種的安全性，必須對(duì)它們進(jìn)行仔細(xì)的臨床評(píng)估。
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責(zé)任編輯：王薇, 百拇醫(yī)藥
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