采用PCR技術(shù)快速診斷MRSA感染對(duì)合理治療MRSA感染的意義(1)
1、傳統(tǒng)診斷方法
傳統(tǒng)的也是臨床通用的耐藥金黃色葡萄球菌(Methicillin Resistant Staphylococcus aureus, MRSA)診斷方法是體外敏感試驗(yàn)法。包括藥敏紙片擴(kuò)散法、試管二倍稀釋法和平皿二倍稀釋法。其基礎(chǔ)都是使致病菌在含抗菌藥物的環(huán)境下培養(yǎng)，根據(jù)細(xì)菌的生長與否判斷敏感度。其中紙片法以藥敏紙片周圍抑菌圈的大小判斷敏感性，后兩種方法則是以抗菌藥物對(duì)細(xì)菌的最低抑菌濃度(Minimal Inhibitory Concentration, MIC)表示細(xì)菌對(duì)抗菌藥物的敏感性。三者中以試管法和平皿法所得結(jié)果更為準(zhǔn)確，更適合于臨床耐藥菌的檢測(cè)。三者均因具有操作簡(jiǎn)便、結(jié)果直觀和費(fèi)用低廉等優(yōu)點(diǎn)，在MRSA檢測(cè)中被廣泛應(yīng)用。但對(duì)于不同耐藥機(jī)制的金葡菌，有不同的治療原則。因此，在耐藥菌檢測(cè)中，不論用哪種方法，均應(yīng)注意由于環(huán)境因素引起的假陽性、假陰性的鑒別診斷。對(duì)于傳統(tǒng)的診斷方法，檢測(cè)用抗菌藥物種類、濃度；細(xì)菌接種量；培養(yǎng)溫度；培養(yǎng)基NaCl含量、pH值以及培養(yǎng)時(shí)間等均對(duì)MRSA檢測(cè)結(jié)果有影響。為此，美國實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)全國委員會(huì)(National Committee for Clinical Laboratory Standard, NCCLS)根據(jù)美國疾病控制中心(Center for Diseases Control, CDC)的研究，發(fā)表MRSA篩選和檢測(cè)方法，并根據(jù)存在的問題進(jìn)行必要的修改。這些檢測(cè)方法被許多實(shí)驗(yàn)室參考應(yīng)用。
, http://www.www.srpcoatings.com
鑒于上述原因，許多研究者尋求用分子生物學(xué)技術(shù)建立一種更加穩(wěn)定可靠的檢測(cè)方法。在目前進(jìn)行的這類研究中，以多聚酶鏈反應(yīng)法較為簡(jiǎn)便可靠。
2、多聚酶鏈反應(yīng)
多聚酶鏈反應(yīng)(Polymerase Chain Reaction, PCR)是一種近十幾年來發(fā)展起來的體外酶法合成特異DNA片斷的分子生物學(xué)技術(shù)。自Saiki 1985年報(bào)道以來，以廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)各個(gè)領(lǐng)域的研究中，并且以應(yīng)用于感染性疾病的診斷。
PCR技術(shù)的基本原理是利用兩個(gè)根據(jù)模板DNA特異堿基序列設(shè)計(jì)的寡核苷酸為引物，在一定反應(yīng)條件下與模板特異性結(jié)合，并通過DNA多聚酶將兩個(gè)引物沿模板延長，經(jīng)過數(shù)十個(gè)反應(yīng)循環(huán)后，可產(chǎn)生百萬倍于模板量的特異性擴(kuò)增產(chǎn)物。整個(gè)反應(yīng)操作十分簡(jiǎn)便，并且由于自動(dòng)化的DNA熱循環(huán)儀和對(duì)熱穩(wěn)定的Taq多聚酶的應(yīng)用，使反應(yīng)僅需幾小時(shí)即可完成，十分迅速。
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由于PCR技術(shù)具有高敏感性、高特異性和迅速簡(jiǎn)便易操作的特點(diǎn)，已在細(xì)菌感染診斷中廣泛應(yīng)用，并且已用于耐藥菌株的檢測(cè)。為臨床早期快速準(zhǔn)確診斷和選擇合理治療方案提供了極大便利。
目前已知，MRSA的主要耐藥機(jī)制是由于細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)膜上的青霉素結(jié)合蛋白(Penicillin Binding Proteins, PBPs)有重要改變。MRSA能產(chǎn)生一種敏感金黃色葡萄球菌所沒有的PBP，稱PBP2a 或PBP2'。由于PBP2a與抗菌藥物的親和力極低且能代替其它PBPs的功能，因而細(xì)菌能夠在高濃度抗菌藥物存在的環(huán)境中得以生存。編碼PBP2a的結(jié)構(gòu)基因?yàn)閙ecA ，并受mecI和 mecR1基因的調(diào)節(jié)。mecA基因位于MRSA的環(huán)狀染色體上，現(xiàn)已被克隆，其堿基序列也以清除，這為PCR方法檢測(cè)MRSA提供了可能。
3、PCR檢測(cè)MRSA方法
3.1 基本原理
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按mecA基因所特有的堿基序列設(shè)計(jì)一對(duì)寡聚核苷酸引物，以待測(cè)菌株DNA為模板，在Taq多聚酶作用下，將引物延伸。擴(kuò)增區(qū)域由兩個(gè)引物的5'末端決定。由此mecA基因攜帶株將最終產(chǎn)生特點(diǎn)長度DNA片斷。擴(kuò)增產(chǎn)物用含溴化乙啶的瓊脂糖凝膠電泳測(cè)定，以特點(diǎn)長度的擴(kuò)增產(chǎn)物存在與否判定PCR反應(yīng)陽性或陰性，從而判定待測(cè)菌株是否為MRSA。
3.2 引物設(shè)計(jì)
堿基序列和堿基各成分的含量是引物設(shè)計(jì)能否成功的關(guān)鍵。引物中堿基序列的特異性是決定PCR特異性的最關(guān)鍵因素。研究表明，99%以上的MRSA具有mecA基因而甲氧西林敏感金黃色葡萄球菌(Methicillin Sensitive Staphylococcus aureus, MSSA)無此基因。因此，幾乎所有研究者都根據(jù)mecA基因的堿基序列設(shè)計(jì)引物。, http://www.www.srpcoatings.com(李耘)
傳統(tǒng)的也是臨床通用的耐藥金黃色葡萄球菌(Methicillin Resistant Staphylococcus aureus, MRSA)診斷方法是體外敏感試驗(yàn)法。包括藥敏紙片擴(kuò)散法、試管二倍稀釋法和平皿二倍稀釋法。其基礎(chǔ)都是使致病菌在含抗菌藥物的環(huán)境下培養(yǎng)，根據(jù)細(xì)菌的生長與否判斷敏感度。其中紙片法以藥敏紙片周圍抑菌圈的大小判斷敏感性，后兩種方法則是以抗菌藥物對(duì)細(xì)菌的最低抑菌濃度(Minimal Inhibitory Concentration, MIC)表示細(xì)菌對(duì)抗菌藥物的敏感性。三者中以試管法和平皿法所得結(jié)果更為準(zhǔn)確，更適合于臨床耐藥菌的檢測(cè)。三者均因具有操作簡(jiǎn)便、結(jié)果直觀和費(fèi)用低廉等優(yōu)點(diǎn)，在MRSA檢測(cè)中被廣泛應(yīng)用。但對(duì)于不同耐藥機(jī)制的金葡菌，有不同的治療原則。因此，在耐藥菌檢測(cè)中，不論用哪種方法，均應(yīng)注意由于環(huán)境因素引起的假陽性、假陰性的鑒別診斷。對(duì)于傳統(tǒng)的診斷方法，檢測(cè)用抗菌藥物種類、濃度；細(xì)菌接種量；培養(yǎng)溫度；培養(yǎng)基NaCl含量、pH值以及培養(yǎng)時(shí)間等均對(duì)MRSA檢測(cè)結(jié)果有影響。為此，美國實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)全國委員會(huì)(National Committee for Clinical Laboratory Standard, NCCLS)根據(jù)美國疾病控制中心(Center for Diseases Control, CDC)的研究，發(fā)表MRSA篩選和檢測(cè)方法，并根據(jù)存在的問題進(jìn)行必要的修改。這些檢測(cè)方法被許多實(shí)驗(yàn)室參考應(yīng)用。
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鑒于上述原因，許多研究者尋求用分子生物學(xué)技術(shù)建立一種更加穩(wěn)定可靠的檢測(cè)方法。在目前進(jìn)行的這類研究中，以多聚酶鏈反應(yīng)法較為簡(jiǎn)便可靠。
2、多聚酶鏈反應(yīng)
多聚酶鏈反應(yīng)(Polymerase Chain Reaction, PCR)是一種近十幾年來發(fā)展起來的體外酶法合成特異DNA片斷的分子生物學(xué)技術(shù)。自Saiki 1985年報(bào)道以來，以廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)各個(gè)領(lǐng)域的研究中，并且以應(yīng)用于感染性疾病的診斷。
PCR技術(shù)的基本原理是利用兩個(gè)根據(jù)模板DNA特異堿基序列設(shè)計(jì)的寡核苷酸為引物，在一定反應(yīng)條件下與模板特異性結(jié)合，并通過DNA多聚酶將兩個(gè)引物沿模板延長，經(jīng)過數(shù)十個(gè)反應(yīng)循環(huán)后，可產(chǎn)生百萬倍于模板量的特異性擴(kuò)增產(chǎn)物。整個(gè)反應(yīng)操作十分簡(jiǎn)便，并且由于自動(dòng)化的DNA熱循環(huán)儀和對(duì)熱穩(wěn)定的Taq多聚酶的應(yīng)用，使反應(yīng)僅需幾小時(shí)即可完成，十分迅速。
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由于PCR技術(shù)具有高敏感性、高特異性和迅速簡(jiǎn)便易操作的特點(diǎn)，已在細(xì)菌感染診斷中廣泛應(yīng)用，并且已用于耐藥菌株的檢測(cè)。為臨床早期快速準(zhǔn)確診斷和選擇合理治療方案提供了極大便利。
目前已知，MRSA的主要耐藥機(jī)制是由于細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)膜上的青霉素結(jié)合蛋白(Penicillin Binding Proteins, PBPs)有重要改變。MRSA能產(chǎn)生一種敏感金黃色葡萄球菌所沒有的PBP，稱PBP2a 或PBP2'。由于PBP2a與抗菌藥物的親和力極低且能代替其它PBPs的功能，因而細(xì)菌能夠在高濃度抗菌藥物存在的環(huán)境中得以生存。編碼PBP2a的結(jié)構(gòu)基因?yàn)閙ecA ，并受mecI和 mecR1基因的調(diào)節(jié)。mecA基因位于MRSA的環(huán)狀染色體上，現(xiàn)已被克隆，其堿基序列也以清除，這為PCR方法檢測(cè)MRSA提供了可能。
3、PCR檢測(cè)MRSA方法
3.1 基本原理
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按mecA基因所特有的堿基序列設(shè)計(jì)一對(duì)寡聚核苷酸引物，以待測(cè)菌株DNA為模板，在Taq多聚酶作用下，將引物延伸。擴(kuò)增區(qū)域由兩個(gè)引物的5'末端決定。由此mecA基因攜帶株將最終產(chǎn)生特點(diǎn)長度DNA片斷。擴(kuò)增產(chǎn)物用含溴化乙啶的瓊脂糖凝膠電泳測(cè)定，以特點(diǎn)長度的擴(kuò)增產(chǎn)物存在與否判定PCR反應(yīng)陽性或陰性，從而判定待測(cè)菌株是否為MRSA。
3.2 引物設(shè)計(jì)
堿基序列和堿基各成分的含量是引物設(shè)計(jì)能否成功的關(guān)鍵。引物中堿基序列的特異性是決定PCR特異性的最關(guān)鍵因素。研究表明，99%以上的MRSA具有mecA基因而甲氧西林敏感金黃色葡萄球菌(Methicillin Sensitive Staphylococcus aureus, MSSA)無此基因。因此，幾乎所有研究者都根據(jù)mecA基因的堿基序列設(shè)計(jì)引物。, http://www.www.srpcoatings.com(李耘)
百拇醫(yī)藥網(wǎng) http://www.www.srpcoatings.com/html/Dir/2003/09/26/98/803.htm