采用PCR技術(shù)快速診斷MRSA感染對(duì)合理治療MRSA感染的意義(2)
3.3 樣本DNA的制備
Unal等建立了DNA快速制備方法，用lysostaphin處理細(xì)菌懸液后，再用蛋白酶K消化后即可用于擴(kuò)增。整個(gè)制備過(guò)程約在30min內(nèi)完成，大大縮短了檢測(cè)時(shí)間。
3.4 反應(yīng)過(guò)程
PCR是將樣本DNA與寡聚核苷酸引物、對(duì)熱穩(wěn)定的TaqDNA多聚酶、脫氧核苷酸(dATP，dCTP，dGTP，dTTP)、MgCl2等與適宜的反應(yīng)緩沖液混合后，重復(fù)加熱與冷卻，形成一個(gè)反復(fù)循環(huán)的PCR過(guò)程，經(jīng)25～40個(gè)循環(huán)，特異DNA片斷呈指數(shù)積聚，其數(shù)量足以用于檢測(cè)分析。
PCR過(guò)程是在三個(gè)不同溫度下完成的，即高溫變性、冷卻后引物與模板復(fù)性及在適當(dāng)溫度下的延伸。變性條件多采用94℃,30s；復(fù)性溫度直接影響PCR結(jié)果的特異性。溫度提高會(huì)增加復(fù)性的特異性，但同時(shí)會(huì)降低引物與模板復(fù)性的量，從而降低擴(kuò)增效率。降低溫度則提高擴(kuò)增效率，降低復(fù)性的特異性。因此，復(fù)性條件多為55℃,30s；雖然TaqDNA多聚酶對(duì)熱穩(wěn)定，但是過(guò)高或過(guò)低的溫度均會(huì)降低酶的活性，其最適反應(yīng)溫度在70～80℃之間,因此延伸溫度通常為72℃. 由于不同研究者設(shè)計(jì)的擴(kuò)增片斷長(zhǎng)度不同，延伸時(shí)間從5s～2min不等。TaqDNA多聚酶是一種高活性酶，在70℃時(shí)擴(kuò)增效率為每秒每個(gè)酶分子可延伸150個(gè)核苷，所以過(guò)長(zhǎng)的延伸時(shí)間似無(wú)必要。通常反應(yīng)循環(huán)數(shù)在25～40個(gè)之間。
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3.4檢測(cè)結(jié)果
擴(kuò)增產(chǎn)物一般用含溴化乙啶的瓊脂糖凝膠電泳方法檢測(cè)。經(jīng)短時(shí)間電泳后，在紫外線下觀察特定長(zhǎng)度的DNA片斷。
4、PCR方法與傳統(tǒng)方法的比較
與體外敏感試驗(yàn)及其它檢測(cè)方法相比，PCR方法在檢測(cè)的敏感性、特異性及簡(jiǎn)單快捷方面有很大優(yōu)點(diǎn)：
4.1 敏感性
MRSA耐藥性的表達(dá)分為同質(zhì)性和異質(zhì)性?xún)煞N。其中以異質(zhì)性多見(jiàn)，異質(zhì)性耐藥性的表達(dá)頻率大約只有10-7～10-3甚至更低，在接種量過(guò)低的時(shí)候，不易檢出從而出現(xiàn)假陰性結(jié)果。與之不同的是，PCR方法通過(guò)直接檢測(cè)細(xì)菌染色體上的mecA基因確定MRSA，因而不受上述試驗(yàn)條件的影響。同時(shí)由于PCR方法能對(duì)目的DNA在幾小時(shí)內(nèi)擴(kuò)大上百萬(wàn)倍，因而只有標(biāo)本DNA中僅含有極微量的mecA基因，經(jīng)25～40個(gè)反應(yīng)循環(huán)后，擴(kuò)增片斷即可用普通的瓊脂糖凝膠電泳檢出，隨著對(duì)檢測(cè)技術(shù)各個(gè)環(huán)節(jié)的改進(jìn)，對(duì)MRSA的檢測(cè)靈敏度已由起初的約103個(gè)細(xì)胞的檢出量降低到30個(gè)細(xì)胞的檢測(cè)量。
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4.2 特異性
盡管有報(bào)道認(rèn)為甲氧西林耐藥性還存在著其它耐藥機(jī)制，但PBPs的改變是其最主要的耐藥機(jī)制。且編碼PBP2a的mecA基因只存在于MRSA及其它對(duì)甲氧西林耐藥的葡萄球菌中，因而特異性很高。
由于這個(gè)特點(diǎn)，在檢測(cè)MRSA的研究中，大多研究者對(duì)PCR方法與體外敏感試驗(yàn)及核酸雜交方法進(jìn)行比較研究的結(jié)果均顯示，PCR方法與各種核酸雜交方法對(duì)MRSA的檢測(cè)結(jié)果均完全一致，且在經(jīng)過(guò)體外敏感試驗(yàn)檢測(cè)的MRSA菌株中，有98%以上的菌株顯示PCR結(jié)果陽(yáng)性，表現(xiàn)出與其它方法的一致性。
非常有意義的是，有不同研究者在PCR方法檢測(cè)MRSA的研究中，均報(bào)道有少數(shù)MSSA的PCR結(jié)果呈陽(yáng)性。即這些MSSA雖然在體外敏感試驗(yàn)中對(duì)甲氧西林機(jī)其它抗菌藥物敏感，但其染色體上卻攜帶有mecA基因。
對(duì)MRSA耐藥的研究表明，mecA基因?yàn)榫幋a特異青霉素結(jié)合蛋白PBP2a的結(jié)構(gòu)基因。mecA基因的表達(dá)受mec基因中mecI-mecR1基因的調(diào)節(jié)。mecI基因編碼MECI蛋白，該蛋白為抑制子。mecR1基因編碼MECR1蛋白，該蛋白為輔助誘導(dǎo)因子。當(dāng)細(xì)菌處于含青霉素或頭霉菌素類(lèi)抗生素cafoxitin的環(huán)境時(shí)，MECR1蛋白因接觸該類(lèi)抗生素，被結(jié)合誘導(dǎo)而活化，從而移去抑制子MECI蛋白，使處于MECI蛋白抑制之下的mecA基因活化，編碼生成PBP2a。, http://www.www.srpcoatings.com(李耘)
Unal等建立了DNA快速制備方法，用lysostaphin處理細(xì)菌懸液后，再用蛋白酶K消化后即可用于擴(kuò)增。整個(gè)制備過(guò)程約在30min內(nèi)完成，大大縮短了檢測(cè)時(shí)間。
3.4 反應(yīng)過(guò)程
PCR是將樣本DNA與寡聚核苷酸引物、對(duì)熱穩(wěn)定的TaqDNA多聚酶、脫氧核苷酸(dATP，dCTP，dGTP，dTTP)、MgCl2等與適宜的反應(yīng)緩沖液混合后，重復(fù)加熱與冷卻，形成一個(gè)反復(fù)循環(huán)的PCR過(guò)程，經(jīng)25～40個(gè)循環(huán)，特異DNA片斷呈指數(shù)積聚，其數(shù)量足以用于檢測(cè)分析。
PCR過(guò)程是在三個(gè)不同溫度下完成的，即高溫變性、冷卻后引物與模板復(fù)性及在適當(dāng)溫度下的延伸。變性條件多采用94℃,30s；復(fù)性溫度直接影響PCR結(jié)果的特異性。溫度提高會(huì)增加復(fù)性的特異性，但同時(shí)會(huì)降低引物與模板復(fù)性的量，從而降低擴(kuò)增效率。降低溫度則提高擴(kuò)增效率，降低復(fù)性的特異性。因此，復(fù)性條件多為55℃,30s；雖然TaqDNA多聚酶對(duì)熱穩(wěn)定，但是過(guò)高或過(guò)低的溫度均會(huì)降低酶的活性，其最適反應(yīng)溫度在70～80℃之間,因此延伸溫度通常為72℃. 由于不同研究者設(shè)計(jì)的擴(kuò)增片斷長(zhǎng)度不同，延伸時(shí)間從5s～2min不等。TaqDNA多聚酶是一種高活性酶，在70℃時(shí)擴(kuò)增效率為每秒每個(gè)酶分子可延伸150個(gè)核苷，所以過(guò)長(zhǎng)的延伸時(shí)間似無(wú)必要。通常反應(yīng)循環(huán)數(shù)在25～40個(gè)之間。
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3.4檢測(cè)結(jié)果
擴(kuò)增產(chǎn)物一般用含溴化乙啶的瓊脂糖凝膠電泳方法檢測(cè)。經(jīng)短時(shí)間電泳后，在紫外線下觀察特定長(zhǎng)度的DNA片斷。
4、PCR方法與傳統(tǒng)方法的比較
與體外敏感試驗(yàn)及其它檢測(cè)方法相比，PCR方法在檢測(cè)的敏感性、特異性及簡(jiǎn)單快捷方面有很大優(yōu)點(diǎn)：
4.1 敏感性
MRSA耐藥性的表達(dá)分為同質(zhì)性和異質(zhì)性?xún)煞N。其中以異質(zhì)性多見(jiàn)，異質(zhì)性耐藥性的表達(dá)頻率大約只有10-7～10-3甚至更低，在接種量過(guò)低的時(shí)候，不易檢出從而出現(xiàn)假陰性結(jié)果。與之不同的是，PCR方法通過(guò)直接檢測(cè)細(xì)菌染色體上的mecA基因確定MRSA，因而不受上述試驗(yàn)條件的影響。同時(shí)由于PCR方法能對(duì)目的DNA在幾小時(shí)內(nèi)擴(kuò)大上百萬(wàn)倍，因而只有標(biāo)本DNA中僅含有極微量的mecA基因，經(jīng)25～40個(gè)反應(yīng)循環(huán)后，擴(kuò)增片斷即可用普通的瓊脂糖凝膠電泳檢出，隨著對(duì)檢測(cè)技術(shù)各個(gè)環(huán)節(jié)的改進(jìn)，對(duì)MRSA的檢測(cè)靈敏度已由起初的約103個(gè)細(xì)胞的檢出量降低到30個(gè)細(xì)胞的檢測(cè)量。
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4.2 特異性
盡管有報(bào)道認(rèn)為甲氧西林耐藥性還存在著其它耐藥機(jī)制，但PBPs的改變是其最主要的耐藥機(jī)制。且編碼PBP2a的mecA基因只存在于MRSA及其它對(duì)甲氧西林耐藥的葡萄球菌中，因而特異性很高。
由于這個(gè)特點(diǎn)，在檢測(cè)MRSA的研究中，大多研究者對(duì)PCR方法與體外敏感試驗(yàn)及核酸雜交方法進(jìn)行比較研究的結(jié)果均顯示，PCR方法與各種核酸雜交方法對(duì)MRSA的檢測(cè)結(jié)果均完全一致，且在經(jīng)過(guò)體外敏感試驗(yàn)檢測(cè)的MRSA菌株中，有98%以上的菌株顯示PCR結(jié)果陽(yáng)性，表現(xiàn)出與其它方法的一致性。
非常有意義的是，有不同研究者在PCR方法檢測(cè)MRSA的研究中，均報(bào)道有少數(shù)MSSA的PCR結(jié)果呈陽(yáng)性。即這些MSSA雖然在體外敏感試驗(yàn)中對(duì)甲氧西林機(jī)其它抗菌藥物敏感，但其染色體上卻攜帶有mecA基因。
對(duì)MRSA耐藥的研究表明，mecA基因?yàn)榫幋a特異青霉素結(jié)合蛋白PBP2a的結(jié)構(gòu)基因。mecA基因的表達(dá)受mec基因中mecI-mecR1基因的調(diào)節(jié)。mecI基因編碼MECI蛋白，該蛋白為抑制子。mecR1基因編碼MECR1蛋白，該蛋白為輔助誘導(dǎo)因子。當(dāng)細(xì)菌處于含青霉素或頭霉菌素類(lèi)抗生素cafoxitin的環(huán)境時(shí)，MECR1蛋白因接觸該類(lèi)抗生素，被結(jié)合誘導(dǎo)而活化，從而移去抑制子MECI蛋白，使處于MECI蛋白抑制之下的mecA基因活化，編碼生成PBP2a。, http://www.www.srpcoatings.com(李耘)
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