黃芪總皂甙對病毒性心肌炎小鼠心肌損傷及肌漿網(wǎng)鈣泵的影響(1)
黃芪治療病毒性心肌炎(VMC)具有一定的療效[1],但黃芪含有多種皂甙、黃酮、多糖，以及氨基酸、亞油酸、生物堿、膽堿、β-谷甾醇等復雜的化學成分，為深入探討其藥效及作用機制，本研究觀查了黃芪總皂甙對病毒性心肌炎小鼠心肌損傷的保護作用及其對心肌肌漿網(wǎng)鈣泵的影響。
一、材料和方法
1.動物 4周齡雄性純種BALB/c小鼠(南京醫(yī)科大學動物中心提供)，共84只。
2.病毒 柯薩奇B 3親心肌病毒株(CVB3m),由上海第二醫(yī)科大學微生物學教研室劉晶星教授贈送。病毒原液效價，50%組織感染率(TCID50)為10-6。
3.藥物和試劑 (1)黃芪總皂甙注射液(AS)：黃芪總皂甙由南京中醫(yī)藥大學中醫(yī)藥研究院從蒙古黃芪中提取，為淡黃色粉末，經(jīng)鑒定為三萜類皂甙；參照文獻[2]以黃芪甲甙(中國藥品生物制品檢定所出品)為標準測定，所提黃芪總皂甙中含26%的黃芪甲甙。以生理鹽水溶解，調(diào)pH至7.4，0.45μm微孔濾膜過濾,得1mg/ml的AS，分裝備用。(2)黃芪注射液(AI.4g/2ml).(3)試劑：對-硝基酚(p-NP)、對-硝基苯磷酸(p-NPP)，Hepes，EGTA，TritonX-100均購自Sigma公司，其余為國產(chǎn)分析純。
, http://www.www.srpcoatings.com
4.病毒感染及分組給藥 BALB/c小鼠隨機分成4組。模型組(感染加生理鹽水)，22只；AS組(感染加AS)，26只；AI組(感染加AI)，18只；對照組，18只。模型組、AS、AI組分別于實驗當天每鼠腹腔注射0.1ml,2×104TCID50的CVB3m; 對照組每鼠腹腔注射0.1ml不含病毒的培養(yǎng)液.于病毒感染后開始，模型組及對照組小鼠每只每天腹腔注射生理鹽水0.15ml，AS組小鼠則每只腹腔注射AS 0.15ml,AI組每只腹腔注射AI 0.15ml，各組小鼠均連續(xù)7天腹腔注射。
5.標本取材 于實驗第8天,從小鼠眼眶取血,分離血清待檢.取血后處死,取心臟中下1/3處的部分心肌,用10%福爾馬林固定待用.取其余心室肌組織,-70℃保存?zhèn)溆谩?br/>
6.觀測指標
6.1統(tǒng)計小鼠死亡率.
, http://www.www.srpcoatings.com
6.2心肌肌鈣蛋白I(cardiac troponin I , cTnI)血清cTnI含量,采用本室建立的改良Bodor夾心ELISA法測定[3],濃度單位為μg/L.
6.3病理組織學檢查 10%福爾馬林固定的心肌用石蠟包埋后作連續(xù)切片,HE染色,光鏡下觀察心肌病理改變,并參考文獻方法[4]計算心肌病理組織學積分.每張切片計算其中心肌壞死及炎癥面積與整個心肌切片面積的比值:無病變計0分,病變面積75%計4分。
6.4肌漿網(wǎng)鈣泵(Sarco/Endoplasmic Ca-ATP ase ,SERCA)活力 心肌SERCA活力,采用本室改良建立的 p-NPP法測定[5].反映體系含心肌勻漿,20mmol/L Hepes pH7.4 . 1mmol/L Mgcl2, 1mmol/L EGTA,0.01‰ TritonX-100, 100mmol/L KCL .加或不加0.8mmol/L CaCl2,預溫 37℃ 10min加 10mmol/L
p-NPP37℃反應30min.結(jié)束時用冷緩沖液終止反應,在波長410nm處測定p-NP生成量,與標準 p-NP濃度曲線比較,并與時間及組織蛋白量相比即得SERCA活力單位(μmol/g pro.min).
7.統(tǒng)計學分析 均數(shù)組間比較用t檢驗.率的比較用х2檢驗,cTnI數(shù)據(jù)用秩和檢驗。, http://www.www.srpcoatings.com(陸曙 張寄南 楊笛 徐晉丹 陳相健 方五旺 馬文珠)
一、材料和方法
1.動物 4周齡雄性純種BALB/c小鼠(南京醫(yī)科大學動物中心提供)，共84只。
2.病毒 柯薩奇B 3親心肌病毒株(CVB3m),由上海第二醫(yī)科大學微生物學教研室劉晶星教授贈送。病毒原液效價，50%組織感染率(TCID50)為10-6。
3.藥物和試劑 (1)黃芪總皂甙注射液(AS)：黃芪總皂甙由南京中醫(yī)藥大學中醫(yī)藥研究院從蒙古黃芪中提取，為淡黃色粉末，經(jīng)鑒定為三萜類皂甙；參照文獻[2]以黃芪甲甙(中國藥品生物制品檢定所出品)為標準測定，所提黃芪總皂甙中含26%的黃芪甲甙。以生理鹽水溶解，調(diào)pH至7.4，0.45μm微孔濾膜過濾,得1mg/ml的AS，分裝備用。(2)黃芪注射液(AI.4g/2ml).(3)試劑：對-硝基酚(p-NP)、對-硝基苯磷酸(p-NPP)，Hepes，EGTA，TritonX-100均購自Sigma公司，其余為國產(chǎn)分析純。
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4.病毒感染及分組給藥 BALB/c小鼠隨機分成4組。模型組(感染加生理鹽水)，22只；AS組(感染加AS)，26只；AI組(感染加AI)，18只；對照組，18只。模型組、AS、AI組分別于實驗當天每鼠腹腔注射0.1ml,2×104TCID50的CVB3m; 對照組每鼠腹腔注射0.1ml不含病毒的培養(yǎng)液.于病毒感染后開始，模型組及對照組小鼠每只每天腹腔注射生理鹽水0.15ml，AS組小鼠則每只腹腔注射AS 0.15ml,AI組每只腹腔注射AI 0.15ml，各組小鼠均連續(xù)7天腹腔注射。
5.標本取材 于實驗第8天,從小鼠眼眶取血,分離血清待檢.取血后處死,取心臟中下1/3處的部分心肌,用10%福爾馬林固定待用.取其余心室肌組織,-70℃保存?zhèn)溆谩?br/>
6.觀測指標
6.1統(tǒng)計小鼠死亡率.
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6.2心肌肌鈣蛋白I(cardiac troponin I , cTnI)血清cTnI含量,采用本室建立的改良Bodor夾心ELISA法測定[3],濃度單位為μg/L.
6.3病理組織學檢查 10%福爾馬林固定的心肌用石蠟包埋后作連續(xù)切片,HE染色,光鏡下觀察心肌病理改變,并參考文獻方法[4]計算心肌病理組織學積分.每張切片計算其中心肌壞死及炎癥面積與整個心肌切片面積的比值:無病變計0分,病變面積75%計4分。
6.4肌漿網(wǎng)鈣泵(Sarco/Endoplasmic Ca-ATP ase ,SERCA)活力 心肌SERCA活力,采用本室改良建立的 p-NPP法測定[5].反映體系含心肌勻漿,20mmol/L Hepes pH7.4 . 1mmol/L Mgcl2, 1mmol/L EGTA,0.01‰ TritonX-100, 100mmol/L KCL .加或不加0.8mmol/L CaCl2,預溫 37℃ 10min加 10mmol/L
p-NPP37℃反應30min.結(jié)束時用冷緩沖液終止反應,在波長410nm處測定p-NP生成量,與標準 p-NP濃度曲線比較,并與時間及組織蛋白量相比即得SERCA活力單位(μmol/g pro.min).
7.統(tǒng)計學分析 均數(shù)組間比較用t檢驗.率的比較用х2檢驗,cTnI數(shù)據(jù)用秩和檢驗。, http://www.www.srpcoatings.com(陸曙 張寄南 楊笛 徐晉丹 陳相健 方五旺 馬文珠)
百拇醫(yī)藥網(wǎng) http://www.www.srpcoatings.com/html/Dir/2003/09/26/99/308.htm