傳染性非典型肺炎的診療方案(之五)
實驗室檢查
(一)外周血象
1.外周血細胞分析診斷標準：
(1)多數(shù)患者白細胞計數(shù)在正常范圍內(nèi)，部分患者白細胞減低，白細胞計數(shù)參考值范圍(4～10)×109/L。
(2)大多數(shù)SARS患者淋巴細胞計數(shù)絕對值減少，呈逐步減低趨勢，并有細胞形態(tài)學變化。
2.結果解釋
國內(nèi)外不同文獻報道的結果有所差別，造成這些差別的可能原因如下：
(1)SARS-CoV主要作用于淋巴細胞(特別是T淋巴細胞)，使外周血淋巴細胞數(shù)減低，而淋巴細胞在白細胞總數(shù)中占的比例較低(參考范圍0.20～0.40)，除非淋巴細胞明顯減少，SARS患者的白細胞不會受到明顯的影響，但此時淋巴細胞絕對值會有明顯變化。另外，白細胞還受其他因素影響，如SARS患者合并感染時，中性粒細胞(占白細胞的50%以上)增高可使白細胞明顯升高。因此，初診SARS患者，觀察淋巴細胞絕對值的變化可能更有診斷意義。
, http://www.www.srpcoatings.com
(2)文獻報道，診斷淋巴細胞減低的臨界值(cutoff值)為1.2×109/L可作為診斷SARS的輔助診斷指標；(0.9-1.2)×109/L為可疑；>1.2×109/L不支持SARS診斷。
(3)值得指出的是，在SARS疫情中，多數(shù)實驗室進行血細胞分析使用的是電阻法血細胞分析儀，其血細胞分類的原理是基于白細胞形態(tài)正常，根據(jù)細胞大小產(chǎn)生的脈沖大小進行細胞分類計數(shù)。換言之，只有細胞形態(tài)正常才能保證白細胞分類計數(shù)相對準確，根據(jù)對200多例SARS或“疑似”患者血涂片的觀察，發(fā)現(xiàn)淋巴細胞和中性粒細胞均有中毒性變化及細胞體積的變化，約60%以上有“核凝”、“核固縮”和胞質中含中毒顆粒及空泡，70%以上的中性粒細胞有“核脊突”，這會影響儀器分類的準確性。因此在進行血細胞分析時，在做好防護條件下應重視血細胞顯微鏡檢查，或使用高檔“五分類”血細胞分析儀進行檢查。
(二)SARS特異性抗體
1.特異性抗體檢測標準
, 百拇醫(yī)藥
符合以下兩者之一即可判斷為SARS：
(1)平行檢測進展期血清抗體和恢復期血清抗體發(fā)現(xiàn)抗體陽轉。
(2)平行檢測進展期血清抗體和恢復期血清抗體發(fā)現(xiàn)抗體滴度4倍及以上升高。
2.技術說明
(1)方法：WHO推薦酶聯(lián)免疫吸附試驗(enzymelinked immunoabsorbent assay,ELISA)或免疫熒光試驗(immunofluorescence assay,IFA)作為血清SARS-CoV抗體檢測方法。
(2)雙份血清標本：SARS感染血清學診斷雙份血清標本是最可靠的。注意盡可能早地采取進展期標本。
(3)平行檢測：進展期和恢復期血清標本平行檢測是非常重要的。ELISA法檢測時應將雙份血清標本置于同一塊酶免疫反應板內(nèi)，IFA法檢測時應將雙份血清標本置于同一張玻片，這樣檢測抗體滴度才有可比性。
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(4)檢測抗體的種類：國內(nèi)目前SARS-CoV抗體檢測包括IgG、IgM或總抗體，其中任何一種抗體發(fā)生陽轉或4倍及以上升高，均可診斷SARS。因IgG抗體持續(xù)時間較長，最好檢測IgG抗體。
(5)試劑盒：應有國家有關機構頒發(fā)的應用許可證。
3.結果解釋
進展期血清抗體和恢復期血清抗體發(fā)現(xiàn)抗體陽轉或4倍以上升高，診斷SARS-CoV近期感染。
根據(jù)WHO的資料，ELISA法檢測患者血清SARS-CoV抗體時使用發(fā)病21天后的血清標本所得結果比較可靠，而IFA法使用發(fā)病10天后的血清標本所得結果比較可靠。絕大多數(shù)SARS患者癥狀出現(xiàn)1個月內(nèi)，應可濁出IgG抗體。
需要注意的是，有些SARS患者血清抗體(IgG和或/IgM)在進展期已為陽性，恢復期血清沒有4倍及以上升高，但這些患者雙份血清存在高滴度的抗體，可結合臨床進行診斷。未檢測到SARS-CoV抗體不能排除SARS-CoV感染。血清學抗體檢測不作為早期診斷依據(jù)，檢測及分析結果時應考慮試劑盒的質量。
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(三)SARS-CoV RNA
1.SARS-CoV RNA陽性判斷標準
應用PCR方法，符合下面三項之一者可判斷為檢測結果陽性：
(1)至少需要兩個不同部位的臨床標本檢測陽性(例：鼻咽分泌物和糞便)。
(2)收集至少間隔兩天的同一種臨床標本送檢檢測陽性(例：兩份或多份鼻咽分泌物)。
(3)在每一個待定檢測中對原臨床標本使用兩種不同的方法，或重復PCR方法檢測陽懷。
2.PCR檢測結果的確認
(1)使用原始標本重復PCR試驗；
(2)在第二個實驗室檢測同一份標本。
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3.實驗室檢測的幾個問題
對PCR檢測有如下要求：
使用PCR方法進行SARS-CoV檢測的實驗室應該有PCR工作經(jīng)驗。應采用南控程序并確認一個合作試驗室，以便于對陽笥結果進行交叉核對。
對SARS-CoV特異性PCR試驗陽性結果的確認應采用嚴格的標準，特別是在低流行區(qū)。
③SARS-CoV檢測用試劑盒應具有國家有關機構頒發(fā)的許可證，應包括已公布的對照、PCR引物及工作流程，應使用權威機構提供的RNA樣本作為陽性RNA對照。
④SARS-CoV試驗的舔生取決于標本的收集和對患者檢測的時間。采用PCR方法會得到假陰性的結果，而多個標本和多部位取材可增加試驗敏感性。
⑤嚴格執(zhí)行實驗室操作標準，避免陽性結果。
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⑥在每次PCR操作過程中，應包括合適的陰、陽性對照。在提取中應有一份陰性對照，在PCR運行中應有一份水對照，在核酸提取及PCR運行中應有一份陽性對照；患者標本檢測必須要有陽性對照，以便測出PCR抑制物(即設抑制對照)。
⑦擴增第二組基因區(qū)或進一步增加試驗的特異性。
⑧患者出現(xiàn)癥狀后5～7天內(nèi)采集標本陽性率最高。
4.標本的采集、運送及保存
(1)漱口液
①采集：采集有助于提高病毒檢出率。應在患者進食2小時后采集標本，期間盡量少喝水。取無菌生理鹽水5ml盛裝在15ml標準帶蓋密封一次性無菌塑料離心管內(nèi)。選擇發(fā)病早期(最好5天之內(nèi))的病例。采樣時可讓患者先咳嗽數(shù)聲，然后用5ml無菌生理鹽水漱口，漱口時讓患者頭部后仰，發(fā)出“噢聲”，讓采樣液在咽部轉動3-5秒，隨后通過紙漏斗緩緩吐回離心管中。
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②運送與保存：標本應置于冰塊環(huán)境中(預先準備冰壺)在2小時內(nèi)盡快送至實驗室。標本至實驗室后，應盡快進行處理及檢測，如果在24小時內(nèi)可安排檢測，標本可置于4℃保存。如果未能安排檢測，則放-20℃保存，需要長期保存應置于-70℃。
(2)糞便
①采集：使用清潔便盆盛裝患者糞便，用滅菌竹簽挑取含膿、血或黏液的糞便置于15ml標準帶密封一次性無菌塑料離心管內(nèi)。
②運送與保存：標本應置于冰塊環(huán)境中(預先準備冰壺)在2小時內(nèi)盡快送至實驗室。標本至實驗室后，應盡快進行處理及檢測，如果在24小時內(nèi)可安排檢測，標本可置于4℃保存。如果未能安排檢測，則放-20℃保存，需要長期保存應置于-70℃。
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(一)外周血象
1.外周血細胞分析診斷標準：
(1)多數(shù)患者白細胞計數(shù)在正常范圍內(nèi)，部分患者白細胞減低，白細胞計數(shù)參考值范圍(4～10)×109/L。
(2)大多數(shù)SARS患者淋巴細胞計數(shù)絕對值減少，呈逐步減低趨勢，并有細胞形態(tài)學變化。
2.結果解釋
國內(nèi)外不同文獻報道的結果有所差別，造成這些差別的可能原因如下：
(1)SARS-CoV主要作用于淋巴細胞(特別是T淋巴細胞)，使外周血淋巴細胞數(shù)減低，而淋巴細胞在白細胞總數(shù)中占的比例較低(參考范圍0.20～0.40)，除非淋巴細胞明顯減少，SARS患者的白細胞不會受到明顯的影響，但此時淋巴細胞絕對值會有明顯變化。另外，白細胞還受其他因素影響，如SARS患者合并感染時，中性粒細胞(占白細胞的50%以上)增高可使白細胞明顯升高。因此，初診SARS患者，觀察淋巴細胞絕對值的變化可能更有診斷意義。
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(2)文獻報道，診斷淋巴細胞減低的臨界值(cutoff值)為1.2×109/L可作為診斷SARS的輔助診斷指標；(0.9-1.2)×109/L為可疑；>1.2×109/L不支持SARS診斷。
(3)值得指出的是，在SARS疫情中，多數(shù)實驗室進行血細胞分析使用的是電阻法血細胞分析儀，其血細胞分類的原理是基于白細胞形態(tài)正常，根據(jù)細胞大小產(chǎn)生的脈沖大小進行細胞分類計數(shù)。換言之，只有細胞形態(tài)正常才能保證白細胞分類計數(shù)相對準確，根據(jù)對200多例SARS或“疑似”患者血涂片的觀察，發(fā)現(xiàn)淋巴細胞和中性粒細胞均有中毒性變化及細胞體積的變化，約60%以上有“核凝”、“核固縮”和胞質中含中毒顆粒及空泡，70%以上的中性粒細胞有“核脊突”，這會影響儀器分類的準確性。因此在進行血細胞分析時，在做好防護條件下應重視血細胞顯微鏡檢查，或使用高檔“五分類”血細胞分析儀進行檢查。
(二)SARS特異性抗體
1.特異性抗體檢測標準
, 百拇醫(yī)藥
符合以下兩者之一即可判斷為SARS：
(1)平行檢測進展期血清抗體和恢復期血清抗體發(fā)現(xiàn)抗體陽轉。
(2)平行檢測進展期血清抗體和恢復期血清抗體發(fā)現(xiàn)抗體滴度4倍及以上升高。
2.技術說明
(1)方法：WHO推薦酶聯(lián)免疫吸附試驗(enzymelinked immunoabsorbent assay,ELISA)或免疫熒光試驗(immunofluorescence assay,IFA)作為血清SARS-CoV抗體檢測方法。
(2)雙份血清標本：SARS感染血清學診斷雙份血清標本是最可靠的。注意盡可能早地采取進展期標本。
(3)平行檢測：進展期和恢復期血清標本平行檢測是非常重要的。ELISA法檢測時應將雙份血清標本置于同一塊酶免疫反應板內(nèi)，IFA法檢測時應將雙份血清標本置于同一張玻片，這樣檢測抗體滴度才有可比性。
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(4)檢測抗體的種類：國內(nèi)目前SARS-CoV抗體檢測包括IgG、IgM或總抗體，其中任何一種抗體發(fā)生陽轉或4倍及以上升高，均可診斷SARS。因IgG抗體持續(xù)時間較長，最好檢測IgG抗體。
(5)試劑盒：應有國家有關機構頒發(fā)的應用許可證。
3.結果解釋
進展期血清抗體和恢復期血清抗體發(fā)現(xiàn)抗體陽轉或4倍以上升高，診斷SARS-CoV近期感染。
根據(jù)WHO的資料，ELISA法檢測患者血清SARS-CoV抗體時使用發(fā)病21天后的血清標本所得結果比較可靠，而IFA法使用發(fā)病10天后的血清標本所得結果比較可靠。絕大多數(shù)SARS患者癥狀出現(xiàn)1個月內(nèi)，應可濁出IgG抗體。
需要注意的是，有些SARS患者血清抗體(IgG和或/IgM)在進展期已為陽性，恢復期血清沒有4倍及以上升高，但這些患者雙份血清存在高滴度的抗體，可結合臨床進行診斷。未檢測到SARS-CoV抗體不能排除SARS-CoV感染。血清學抗體檢測不作為早期診斷依據(jù)，檢測及分析結果時應考慮試劑盒的質量。
, 百拇醫(yī)藥
(三)SARS-CoV RNA
1.SARS-CoV RNA陽性判斷標準
應用PCR方法，符合下面三項之一者可判斷為檢測結果陽性：
(1)至少需要兩個不同部位的臨床標本檢測陽性(例：鼻咽分泌物和糞便)。
(2)收集至少間隔兩天的同一種臨床標本送檢檢測陽性(例：兩份或多份鼻咽分泌物)。
(3)在每一個待定檢測中對原臨床標本使用兩種不同的方法，或重復PCR方法檢測陽懷。
2.PCR檢測結果的確認
(1)使用原始標本重復PCR試驗；
(2)在第二個實驗室檢測同一份標本。
, 百拇醫(yī)藥
3.實驗室檢測的幾個問題
對PCR檢測有如下要求：
使用PCR方法進行SARS-CoV檢測的實驗室應該有PCR工作經(jīng)驗。應采用南控程序并確認一個合作試驗室，以便于對陽笥結果進行交叉核對。
對SARS-CoV特異性PCR試驗陽性結果的確認應采用嚴格的標準，特別是在低流行區(qū)。
③SARS-CoV檢測用試劑盒應具有國家有關機構頒發(fā)的許可證，應包括已公布的對照、PCR引物及工作流程，應使用權威機構提供的RNA樣本作為陽性RNA對照。
④SARS-CoV試驗的舔生取決于標本的收集和對患者檢測的時間。采用PCR方法會得到假陰性的結果，而多個標本和多部位取材可增加試驗敏感性。
⑤嚴格執(zhí)行實驗室操作標準，避免陽性結果。
, http://www.www.srpcoatings.com
⑥在每次PCR操作過程中，應包括合適的陰、陽性對照。在提取中應有一份陰性對照，在PCR運行中應有一份水對照，在核酸提取及PCR運行中應有一份陽性對照；患者標本檢測必須要有陽性對照，以便測出PCR抑制物(即設抑制對照)。
⑦擴增第二組基因區(qū)或進一步增加試驗的特異性。
⑧患者出現(xiàn)癥狀后5～7天內(nèi)采集標本陽性率最高。
4.標本的采集、運送及保存
(1)漱口液
①采集：采集有助于提高病毒檢出率。應在患者進食2小時后采集標本，期間盡量少喝水。取無菌生理鹽水5ml盛裝在15ml標準帶蓋密封一次性無菌塑料離心管內(nèi)。選擇發(fā)病早期(最好5天之內(nèi))的病例。采樣時可讓患者先咳嗽數(shù)聲，然后用5ml無菌生理鹽水漱口，漱口時讓患者頭部后仰，發(fā)出“噢聲”，讓采樣液在咽部轉動3-5秒，隨后通過紙漏斗緩緩吐回離心管中。
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②運送與保存：標本應置于冰塊環(huán)境中(預先準備冰壺)在2小時內(nèi)盡快送至實驗室。標本至實驗室后，應盡快進行處理及檢測，如果在24小時內(nèi)可安排檢測，標本可置于4℃保存。如果未能安排檢測，則放-20℃保存，需要長期保存應置于-70℃。
(2)糞便
①采集：使用清潔便盆盛裝患者糞便，用滅菌竹簽挑取含膿、血或黏液的糞便置于15ml標準帶密封一次性無菌塑料離心管內(nèi)。
②運送與保存：標本應置于冰塊環(huán)境中(預先準備冰壺)在2小時內(nèi)盡快送至實驗室。標本至實驗室后，應盡快進行處理及檢測，如果在24小時內(nèi)可安排檢測，標本可置于4℃保存。如果未能安排檢測，則放-20℃保存，需要長期保存應置于-70℃。
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