人卵母細胞體外成熟培養(yǎng)研究現(xiàn)狀
【文獻標識碼】 A 【文章編號】 1680-6115(2003)10-0892-03
人卵母細胞在胚胎第8周時就開始了第一次減數(shù)分裂，出生時初級卵母細胞已經(jīng)過第一次減數(shù)分裂前期，處于前期和中期之間的靜止期(核網(wǎng)期)，并長期停留在此階段，直至青春期在適當?shù)募に丨h(huán)境下，引發(fā)原來靜止的減數(shù)分裂重新恢復，才開始分批分期完成第一次減數(shù)分裂，產(chǎn)生成熟的卵母細胞和第一極體，此過程稱為卵母細胞成熟。1935年，Pincus和Enzman [1] 觀察到將兔卵母細胞從卵泡中移出后，卵母細胞可在體外自發(fā)地排出第一極體，生殖工程由此開辟了一個新的研究領(lǐng)域———卵母細胞的體外成熟(In-vitro Maturation，IVM)培養(yǎng)。卵母細胞的體外成熟是指將GV期或GV前期的卵母細胞在體外培養(yǎng)，達到次級卵母細胞(MⅡ)，能夠正常受精、發(fā)育和著床，包括完整的卵泡培養(yǎng) [2] 和單純的卵丘復合體培養(yǎng)。目前應用于輔助生殖技術(shù)的主要限于后者。嚴格意義上的IVM是從未經(jīng)促排卵刺激的卵巢取得的卵子在體外成熟。
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1 卵母細胞的體外成熟過程
1.1 IVM主要包括細胞漿及細胞核的成熟 細胞核的成熟是指第一次減數(shù)分裂的重新啟動及完成，即生殖泡(Gerˉminal Vesical，GV)期的活化，當雌性哺乳動物性成熟后，在垂體促性腺激素刺激下，卵泡開始發(fā)育。血清黃體生成素(LH)峰出現(xiàn)前，卵母細胞減數(shù)分裂仍停留在第一次減數(shù)分裂GV期;血清LH峰出現(xiàn)后，生殖泡破裂(Germinal Vesical Breakdown，GVBD)活化，表現(xiàn)為核膜崩解，染色質(zhì)凝聚。24h或48h后，卵母細胞從卵泡中排出，并分裂成次級卵母細胞和第一極體，進入MⅡ期。而細胞漿的成熟則是一系列蛋白質(zhì)的合成過程。體外成熟時，生殖泡破裂前后細胞質(zhì)內(nèi)合成大量蛋白質(zhì)，它們對卵母細胞自身成熟有極其重要的作用，其中最為顯著是激活成熟促進因子(MPF)和細胞生長抑制因子(CSF)的活性。MPF直接催化一些與細胞分裂有關(guān)的蛋白質(zhì)磷酸化，促使細胞由間期向M期轉(zhuǎn)化，而CSF則促進和維持MPF活性的充分表現(xiàn)，使細胞維系在M期狀態(tài)。實驗證明，牛卵母細胞成熟培養(yǎng)其中加入蛋白合成抑制劑，如亞胺環(huán)己酮、嘌呤霉素均可阻止GVBD的發(fā)生。這些合成的蛋白還與卵母細胞受精后的發(fā)育能力有關(guān)。
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1.2 卵泡刺激素(FSH)的應用 Veek [3] 等從44個超排卵周期中獲取了74個人卵母細胞，將其中未成熟的卵母細胞置于含15%的胎兒臍帶血清(FCS)的Ham’F-10中培養(yǎng)22～35h后授精，44個胚胎發(fā)育。移植給30例病人，8例妊娠，2例分娩出正常的嬰兒。這是卵母細胞體外成熟培養(yǎng)技術(shù)臨床應用的世界首例報道。但是由于該研究中的不成熟卵母細胞來源于促超排卵，因此并非純粹意義上體外成熟培養(yǎng)。此后，許多研究者的工作與Veek的相似，均是從促超排卵后獲取不成熟卵母細胞并進行短暫的體外培養(yǎng)，促其成熟。直至1991年，Cha [4] 等才開始真正意義的不成熟卵母細胞體外成熟培養(yǎng)的臨床應用研究。他們從因良性病變而被切除的23個卵巢標本中回收了274個不成熟卵母細胞，分別培養(yǎng)于含50%滅活的人卵泡液或15%FCS的Ham’F-10液中，成熟率分別為55.8%與35.7%。最后產(chǎn)生的5個胚胎移植入一例卵巢早衰的病人，成功妊娠并娩出三胞胎女嬰;Wynm [5] 做了17例應用FSH和9例不用FSH的患者，發(fā)現(xiàn)平均獲卵數(shù)、成熟率和得到的MⅡ期卵子都有顯著差異，分別為67%和51%，71.1%和43.5%，48和21個。說明短時間應用FSH可以提高獲卵率以及卵子發(fā)育能力，達到MⅡ期。在卵泡生長期給予足夠量的FSH，才能使卵泡不發(fā)生閉鎖，卵子獲得充足的減數(shù)分裂能力。在未成熟卵的培養(yǎng)過程中發(fā)現(xiàn)應用FSH的卵丘復合體細胞的數(shù)量幾乎是沒有應用FSH的兩倍，這是一個非常有利的因素，可以更積極地合成成熟促進因子、激素和能量物質(zhì)，以及促進有毒物質(zhì)的代謝。1994年，Trounson [6] 等研究了多囊卵巢綜合征病人的不成熟卵母細胞體外成熟和受精發(fā)育的能力，發(fā)現(xiàn)經(jīng)過加入含卵泡刺激素(FSH)及人絨毛膜促性腺激素(hCG)的培養(yǎng)基培養(yǎng)后，81%不成熟卵母細胞在48～54h發(fā)育至MⅡ期，體外受精(IVF)的受精率為34%，56%受精卵卵裂至8個細胞或更多細胞。同時，將部分胚胎移植給其中一未排卵的多囊卵巢綜合征的病人，獲足月妊娠并分娩一正常嬰兒。認為，來源于多囊卵巢綜合征病人的不成熟卵母細胞也能體外成熟。
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2 影響卵母細胞體外成熟培養(yǎng)的因素
人不成熟卵母細胞IVM培養(yǎng)實驗研究中，成熟率和受精率都不理想，胚胎移植后妊娠率則更低。
2.1 IVM成熟率 (1)部分卵母細胞體外培養(yǎng)后未獲得完全成熟的能力。有人認為人類未受外源性的促性腺激素刺激的卵母細胞體外成熟率達到30%～50%，而經(jīng)人絕經(jīng)期促性腺激素(HMG)/hCG方案誘導排卵而獲取的卵母細胞達到MⅡ近90%。推測卵母細胞成熟能力的獲得可能與促性腺激素的刺激作用有關(guān)，具體機制不詳;(2)不成熟卵母細胞在體外環(huán)境中退化。有人觀察到在自然月經(jīng)周期的第7～10天收集的不成熟卵母細胞，3/4已出現(xiàn)退化征象，這部分卵母細胞已不能回復到成熟的軌道上來，影響體外成熟率;(3)隨著年齡的增長，卵巢中氧自由基逐漸積聚，對處于第一次減數(shù)分裂靜止期的卵母細胞影響很大，在這段時間內(nèi)，氧自由基能降低卵母細胞活性，降低不成熟卵母細胞的體外成熟率。
2.2 體外培養(yǎng)成熟的卵母細胞體外受精率低、胚胎發(fā)育潛能低
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2.2.1 透明帶硬化 以前在嚙齒類動物的研究發(fā)現(xiàn)，卵子在無血清培養(yǎng)基進行體外成熟易形成透明帶硬化，精子的穿透受阻以致受精失敗。透明帶硬化的原因認為是體外培養(yǎng)過程中放射冠細胞胞外分泌一種蛋白酶催化造成的。Futuin是血清中的一種α胰蛋白酶抑制因子，有與其濃度相關(guān)的抑制透明帶硬化的作用 [7，8] 。ICSI技術(shù)發(fā)展后，研究者運用該項技術(shù)解決了這個問題。IVM卵母細胞用傳統(tǒng)IVM技術(shù)的受精率為45%，而采用ICSI技術(shù)的受精率為90%。
2.2.2 精原核和卵原核形成不同步 主要是精原核形成落后引起。這與卵母細胞細胞質(zhì)不完全成熟有關(guān)。IVM包括胞質(zhì)的成熟和胞核的成熟，Smith [9] 等的研究發(fā)現(xiàn)，盡管在IVM中，胞核能正常成熟，但明顯缺乏胞質(zhì)的成熟，胞質(zhì)的成熟包括卵胞漿內(nèi)微管的發(fā)育、膜表面表達精子膜融合蛋白受體、胞質(zhì)獲得使精子染色質(zhì)解釋以及指導受精卵蛋白質(zhì)合成的能力等，與卵母細胞合成與胞質(zhì)成熟相關(guān)蛋白的能力有關(guān)，如中期促進因子。中期促進因子的活性低，周期素和其它控制細胞周期的物質(zhì)的缺乏將引起卵裂的阻滯。而胞質(zhì)的不完全成熟也影響了受精卵的進一步卵裂。
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2.3 不能獲得足夠數(shù)量的不成熟卵母細胞而導致可供移植的胚胎數(shù)目及質(zhì)量下降也是一個重要原因 與體內(nèi)成熟的卵母細胞相比，來源于體外培養(yǎng)成熟的卵母細胞，其胚胎發(fā)育相對較差，因此獲取一定數(shù)量的不成熟卵母細胞對于提高IVM的成功率具有特別重要的意義。研究證實，從PCOS患者獲取的不成熟卵母細胞比非PCOS明顯增加，目前IVM多以PCOS或多囊卵巢患者為研究對象。至于在獲取不成熟卵母細胞前是否需要進行促性腺激素刺激一直存在爭議。研究結(jié)果顯示，小劑量FSH能夠有效地提高卵母細胞獲取率和受精率。提示在避免引起卵巢過度刺激綜合征的同時，小劑量FSH刺激可能有利于形成一批大小比較均勻的卵泡，增加不成熟卵母細胞的獲取率，從而為進行下一步的體外成熟提供了比較充足的卵母細胞來源 [10] 。
2.4 ET后妊娠率低 (1)胚胎的發(fā)育和子宮內(nèi)膜的發(fā)育不同步。多數(shù)學者認為在短期使用少量雌激素準備內(nèi)膜，可提高妊娠率;(2)隨著年齡的增長，配子非整倍體發(fā)生率增加和氧自由基的大量積聚，勢必影響胚胎的活性，使胚胎在移植子宮后發(fā)育阻滯;(3)發(fā)生染色體退化的卵母細胞雖具有受精和卵裂的潛能，但形成的胚胎不能著床或雖著床而僅表現(xiàn)為生化妊娠(即β-hCG短暫升高)。當然，導致卵母細胞體外成熟率低、受精率不高、胚胎移植后妊娠率更低的原因還有其它方面，需要進一步深入實驗分析。
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3 IVM取卵的方式和時機
IVM發(fā)展到現(xiàn)在，收集的不成熟卵母細胞大多是來自竇卵泡。其中的不成熟卵母細胞有GV或MI期。收集這些來自竇卵泡的不成熟卵的方式大致有兩種:體內(nèi)和體外取卵。體內(nèi)取卵可借助于腹腔鏡或經(jīng)陰道超聲引導下進行卵泡穿刺取卵，前者在經(jīng)陰道超聲引導下卵泡穿刺術(shù)未發(fā)展起來前，一直是IVM獲得卵母細胞的主要方法，也可用于IVM收集不成熟卵母細胞，但由于這種方法造成的創(chuàng)傷大，應用受限;經(jīng)陰道超聲卵泡穿刺術(shù)為目前使用最廣的IVF取卵方式，也可用來作為獲取不成熟卵母細胞的方法。但是，用于IVF取卵的穿刺針斜面過大、針尖過長，因此不適于穿刺不成熟的卵泡。Trounson等改進了穿刺針的形狀和穿刺的方式，并有效地應用到IVM取卵;體外取卵就是從離體的卵巢標本取卵，以因良性婦科病變而手術(shù)切除的卵巢作為標本來源，在體視顯微鏡下直視取卵，用無菌的穿刺針在體視鏡下穿刺卵泡以獲得不成熟卵母細胞。該項技術(shù)操作簡單，易于掌握，已被廣泛采用，其取卵的效果并不亞于經(jīng)陰道超聲引導下穿刺取卵。最近，國內(nèi)有研究報道， 從IVF-ET治療周期卵泡液中發(fā)現(xiàn)了大量竇前卵泡，IVM培養(yǎng)近28天后，成熟率為38.1%，這一方法的建立增加了研究IVM培養(yǎng)卵母細胞的標本來源，是我國科研人員在生殖領(lǐng)域的重大貢獻 [11] 。對于在月經(jīng)周期何時取卵為最佳時間的問題，一直爭論不休。有人認為收集的卵母細胞數(shù)量與取卵時間無關(guān);但是考慮到卵母細胞成熟率的問題時，部分學者認為卵泡期收集的卵母細胞體外成熟率要高
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于黃體期收集的卵母細胞，故他們趨向于卵泡期取卵。
4 獲取卵母細胞臨床方案
4.1 不用促卵泡生長激素刺激 月經(jīng)過少的患者每日肌注黃體酮20mg，或用陰道黃體酮栓300mg，連用10天后停用，待撤退性出血的第3天做B超，以排除卵巢囊腫。在此后監(jiān)測主導卵泡的大小，一般在月經(jīng)的第8～12天，即主導卵泡的直徑達10～12mm時肌注hCG10000萬U。并在當日開始連續(xù)口服戊酸雌二醇6mg調(diào)節(jié)子宮內(nèi)膜的生長。卵泡直徑>4mm的卵泡都進行穿刺，并沖洗3次。在取卵日開始連續(xù)肌注黃體酮40mg，或用陰道黃體酮栓300mg進行黃體支持。
4.2 短時間應用促卵泡生長激素刺激 在月經(jīng)的第2天用FSH300IU，第4天用150IU，在第6天用150IU。不用hCG，第7天經(jīng)陰道取卵。在月經(jīng)的第2，6，12天抽靜脈血查FSH，LH，E 2，P，并用B超監(jiān)測子宮內(nèi)膜。取卵當日開始連續(xù)應用戊酸雌二醇6mg和黃體酮40mg準備子宮
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內(nèi)膜。
4.3 取卵 所有患者均在使用促性腺激素釋放激素激動劑后15天或撤退性出血后第5天，采用小劑量FSH進行刺激，F(xiàn)SH的應用時間一般為5～7天，于FSH刺激后5～8天，或于周期的第11～14天取卵，取卵前17h肌注人絨毛膜促性腺激素10000IU，取卵當天最大卵泡直徑不超過10mm。于月經(jīng)后第3天開始用人類尿促性腺激素(HMG)150IU肌肉注射，共4天，發(fā)現(xiàn)雙側(cè)卵巢有直徑8～10mm卵泡8個，直徑4～7mm卵泡6個。給予hCG10000IU。34h后取卵。同時，于注射hCG日開始補充β雌二醇2mg/d，于胚胎移植日加用黃體酮60mg/d肌肉注射 [12] 。
5 IVM培養(yǎng)的時間
從理論上推斷，體外培養(yǎng)的時間越長，達到MⅡ期的卵子越多。所以有的生殖中心在體外成熟在36h，有的在44h，有的在48h后拆除顆粒細胞進行ICSI。Mikkelsen [13] 發(fā)現(xiàn)縮短IVM的培養(yǎng)時間并不會影響胚胎發(fā)育的能力，在體外成熟28h和36h的卵子成熟率、受精率、分裂率和妊娠率沒有顯著差異。體外成熟的時間過長，反而使卵子失去了最佳的受精時機，出現(xiàn)皮質(zhì)顆粒的過早釋放以及透明帶硬化。透明帶硬化使得卵子受精和囊胚孵出障礙。而過早的剝離卵丘復合體細胞，使卵子與其間的聯(lián)系中斷，也不利于減數(shù)分裂的有效進行。即使與卵丘復合體細胞共培養(yǎng)也達不到理想的效果。
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6 IVM的臨床意義
6.1 與IVF、ICSI結(jié)合治療某些不孕癥 Barens [14] 等將IVM技術(shù)與顯微授精技術(shù)結(jié)合治療不孕癥，獲得成功。目前，已有越來越多的IVM結(jié)合IVF或卵泡漿內(nèi)單精子注射(ICSI)技術(shù)成功地應用于臨床的病例報道。迄今，世界上已有約20～30個采用該技術(shù)妊娠的正常嬰兒分娩。文獻報道，利用體外成熟的卵母細胞受精后胚胎移植以治療卵巢早衰(POF)。同時，利用IVM+IVF+ET技術(shù)提供正常胚胎給患有嚴重的、明顯遺傳傾向的遺傳病人，作為控制某些遺傳病傳代的設(shè)想也早被人們提出。
6.2 避免IVF嚴重并發(fā)癥的產(chǎn)生及IVM優(yōu)勢 如多囊卵巢綜合征和有排卵并有大量小卵泡發(fā)育的不育癥病人，對外源性激素刺激異常敏感，易于產(chǎn)生超刺激反應，引起卵巢過度刺激綜合征(OHSS);其次，在誘發(fā)的卵泡期中，卵泡產(chǎn)生高雌激素水平和在排卵后引發(fā)高雌激素水平，對于乳腺癌、卵巢癌和其它一些依賴性激素的癌癥(如黑色素瘤)是個潛在危險因素。因此，有的學者提倡用IVM技術(shù)取代藥物誘導排卵。因為正常婦女月經(jīng)周期中，約有10～50個卵泡同時發(fā)育，如果能在發(fā)育早期獲得這些不成熟卵母細胞，進行IVM培養(yǎng)，則可避免藥物促超排卵引發(fā)的上述危險�？梢怨�(jié)省用于募集卵泡的藥物費用;重新利用常規(guī)IVF中收集的不成熟卵;可以作為研究卵子發(fā)生減數(shù)分裂異常和非整倍體的模型;為冷凍卵子提供了一條出路，因為冷凍GV期卵子可以避開MⅡ期卵子減數(shù)分裂紡垂體的易損傷期。
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6.3 供卵 供卵正被提到生殖工程領(lǐng)域的議事日程上來，但臨床醫(yī)師卻苦于供卵來源缺乏。IVM技術(shù)解決了這一難題。因良性婦科疾病(如子宮內(nèi)膜異位癥、纖維瘤、子宮肌瘤、宮外孕等)而切除的卵巢組織或因罹患重癥疾病如癌癥需使用細胞毒藥物的年輕未生育女性病人的卵巢組織，均可用作IVF的供卵來源。如果IVM技術(shù)和卵母細胞冷凍技術(shù)結(jié)合則可建立一個和精子庫相應的卵子庫。
IVM的前景為生殖醫(yī)學家們所看好。雖然IVM技術(shù)還不成熟，還存在諸多的問題，但經(jīng)過不懈努力必將成為生殖工程領(lǐng)域中一項新興的技術(shù)。它有助于深入了解卵母細胞發(fā)育動力學，拓寬了治療不孕癥的思路。
參考文獻
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(收稿日期:2003-06-12)
(編輯 小川), 百拇醫(yī)藥(李蓉 湯惠茹 蔡志明)
人卵母細胞在胚胎第8周時就開始了第一次減數(shù)分裂，出生時初級卵母細胞已經(jīng)過第一次減數(shù)分裂前期，處于前期和中期之間的靜止期(核網(wǎng)期)，并長期停留在此階段，直至青春期在適當?shù)募に丨h(huán)境下，引發(fā)原來靜止的減數(shù)分裂重新恢復，才開始分批分期完成第一次減數(shù)分裂，產(chǎn)生成熟的卵母細胞和第一極體，此過程稱為卵母細胞成熟。1935年，Pincus和Enzman [1] 觀察到將兔卵母細胞從卵泡中移出后，卵母細胞可在體外自發(fā)地排出第一極體，生殖工程由此開辟了一個新的研究領(lǐng)域———卵母細胞的體外成熟(In-vitro Maturation，IVM)培養(yǎng)。卵母細胞的體外成熟是指將GV期或GV前期的卵母細胞在體外培養(yǎng)，達到次級卵母細胞(MⅡ)，能夠正常受精、發(fā)育和著床，包括完整的卵泡培養(yǎng) [2] 和單純的卵丘復合體培養(yǎng)。目前應用于輔助生殖技術(shù)的主要限于后者。嚴格意義上的IVM是從未經(jīng)促排卵刺激的卵巢取得的卵子在體外成熟。
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1.1 IVM主要包括細胞漿及細胞核的成熟 細胞核的成熟是指第一次減數(shù)分裂的重新啟動及完成，即生殖泡(Gerˉminal Vesical，GV)期的活化，當雌性哺乳動物性成熟后，在垂體促性腺激素刺激下，卵泡開始發(fā)育。血清黃體生成素(LH)峰出現(xiàn)前，卵母細胞減數(shù)分裂仍停留在第一次減數(shù)分裂GV期;血清LH峰出現(xiàn)后，生殖泡破裂(Germinal Vesical Breakdown，GVBD)活化，表現(xiàn)為核膜崩解，染色質(zhì)凝聚。24h或48h后，卵母細胞從卵泡中排出，并分裂成次級卵母細胞和第一極體，進入MⅡ期。而細胞漿的成熟則是一系列蛋白質(zhì)的合成過程。體外成熟時，生殖泡破裂前后細胞質(zhì)內(nèi)合成大量蛋白質(zhì)，它們對卵母細胞自身成熟有極其重要的作用，其中最為顯著是激活成熟促進因子(MPF)和細胞生長抑制因子(CSF)的活性。MPF直接催化一些與細胞分裂有關(guān)的蛋白質(zhì)磷酸化，促使細胞由間期向M期轉(zhuǎn)化，而CSF則促進和維持MPF活性的充分表現(xiàn)，使細胞維系在M期狀態(tài)。實驗證明，牛卵母細胞成熟培養(yǎng)其中加入蛋白合成抑制劑，如亞胺環(huán)己酮、嘌呤霉素均可阻止GVBD的發(fā)生。這些合成的蛋白還與卵母細胞受精后的發(fā)育能力有關(guān)。
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1.2 卵泡刺激素(FSH)的應用 Veek [3] 等從44個超排卵周期中獲取了74個人卵母細胞，將其中未成熟的卵母細胞置于含15%的胎兒臍帶血清(FCS)的Ham’F-10中培養(yǎng)22～35h后授精，44個胚胎發(fā)育。移植給30例病人，8例妊娠，2例分娩出正常的嬰兒。這是卵母細胞體外成熟培養(yǎng)技術(shù)臨床應用的世界首例報道。但是由于該研究中的不成熟卵母細胞來源于促超排卵，因此并非純粹意義上體外成熟培養(yǎng)。此后，許多研究者的工作與Veek的相似，均是從促超排卵后獲取不成熟卵母細胞并進行短暫的體外培養(yǎng)，促其成熟。直至1991年，Cha [4] 等才開始真正意義的不成熟卵母細胞體外成熟培養(yǎng)的臨床應用研究。他們從因良性病變而被切除的23個卵巢標本中回收了274個不成熟卵母細胞，分別培養(yǎng)于含50%滅活的人卵泡液或15%FCS的Ham’F-10液中，成熟率分別為55.8%與35.7%。最后產(chǎn)生的5個胚胎移植入一例卵巢早衰的病人，成功妊娠并娩出三胞胎女嬰;Wynm [5] 做了17例應用FSH和9例不用FSH的患者，發(fā)現(xiàn)平均獲卵數(shù)、成熟率和得到的MⅡ期卵子都有顯著差異，分別為67%和51%，71.1%和43.5%，48和21個。說明短時間應用FSH可以提高獲卵率以及卵子發(fā)育能力，達到MⅡ期。在卵泡生長期給予足夠量的FSH，才能使卵泡不發(fā)生閉鎖，卵子獲得充足的減數(shù)分裂能力。在未成熟卵的培養(yǎng)過程中發(fā)現(xiàn)應用FSH的卵丘復合體細胞的數(shù)量幾乎是沒有應用FSH的兩倍，這是一個非常有利的因素，可以更積極地合成成熟促進因子、激素和能量物質(zhì)，以及促進有毒物質(zhì)的代謝。1994年，Trounson [6] 等研究了多囊卵巢綜合征病人的不成熟卵母細胞體外成熟和受精發(fā)育的能力，發(fā)現(xiàn)經(jīng)過加入含卵泡刺激素(FSH)及人絨毛膜促性腺激素(hCG)的培養(yǎng)基培養(yǎng)后，81%不成熟卵母細胞在48～54h發(fā)育至MⅡ期，體外受精(IVF)的受精率為34%，56%受精卵卵裂至8個細胞或更多細胞。同時，將部分胚胎移植給其中一未排卵的多囊卵巢綜合征的病人，獲足月妊娠并分娩一正常嬰兒。認為，來源于多囊卵巢綜合征病人的不成熟卵母細胞也能體外成熟。
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2 影響卵母細胞體外成熟培養(yǎng)的因素
人不成熟卵母細胞IVM培養(yǎng)實驗研究中，成熟率和受精率都不理想，胚胎移植后妊娠率則更低。
2.1 IVM成熟率 (1)部分卵母細胞體外培養(yǎng)后未獲得完全成熟的能力。有人認為人類未受外源性的促性腺激素刺激的卵母細胞體外成熟率達到30%～50%，而經(jīng)人絕經(jīng)期促性腺激素(HMG)/hCG方案誘導排卵而獲取的卵母細胞達到MⅡ近90%。推測卵母細胞成熟能力的獲得可能與促性腺激素的刺激作用有關(guān)，具體機制不詳;(2)不成熟卵母細胞在體外環(huán)境中退化。有人觀察到在自然月經(jīng)周期的第7～10天收集的不成熟卵母細胞，3/4已出現(xiàn)退化征象，這部分卵母細胞已不能回復到成熟的軌道上來，影響體外成熟率;(3)隨著年齡的增長，卵巢中氧自由基逐漸積聚，對處于第一次減數(shù)分裂靜止期的卵母細胞影響很大，在這段時間內(nèi)，氧自由基能降低卵母細胞活性，降低不成熟卵母細胞的體外成熟率。
2.2 體外培養(yǎng)成熟的卵母細胞體外受精率低、胚胎發(fā)育潛能低
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2.2.1 透明帶硬化 以前在嚙齒類動物的研究發(fā)現(xiàn)，卵子在無血清培養(yǎng)基進行體外成熟易形成透明帶硬化，精子的穿透受阻以致受精失敗。透明帶硬化的原因認為是體外培養(yǎng)過程中放射冠細胞胞外分泌一種蛋白酶催化造成的。Futuin是血清中的一種α胰蛋白酶抑制因子，有與其濃度相關(guān)的抑制透明帶硬化的作用 [7，8] 。ICSI技術(shù)發(fā)展后，研究者運用該項技術(shù)解決了這個問題。IVM卵母細胞用傳統(tǒng)IVM技術(shù)的受精率為45%，而采用ICSI技術(shù)的受精率為90%。
2.2.2 精原核和卵原核形成不同步 主要是精原核形成落后引起。這與卵母細胞細胞質(zhì)不完全成熟有關(guān)。IVM包括胞質(zhì)的成熟和胞核的成熟，Smith [9] 等的研究發(fā)現(xiàn)，盡管在IVM中，胞核能正常成熟，但明顯缺乏胞質(zhì)的成熟，胞質(zhì)的成熟包括卵胞漿內(nèi)微管的發(fā)育、膜表面表達精子膜融合蛋白受體、胞質(zhì)獲得使精子染色質(zhì)解釋以及指導受精卵蛋白質(zhì)合成的能力等，與卵母細胞合成與胞質(zhì)成熟相關(guān)蛋白的能力有關(guān)，如中期促進因子。中期促進因子的活性低，周期素和其它控制細胞周期的物質(zhì)的缺乏將引起卵裂的阻滯。而胞質(zhì)的不完全成熟也影響了受精卵的進一步卵裂。
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2.3 不能獲得足夠數(shù)量的不成熟卵母細胞而導致可供移植的胚胎數(shù)目及質(zhì)量下降也是一個重要原因 與體內(nèi)成熟的卵母細胞相比，來源于體外培養(yǎng)成熟的卵母細胞，其胚胎發(fā)育相對較差，因此獲取一定數(shù)量的不成熟卵母細胞對于提高IVM的成功率具有特別重要的意義。研究證實，從PCOS患者獲取的不成熟卵母細胞比非PCOS明顯增加，目前IVM多以PCOS或多囊卵巢患者為研究對象。至于在獲取不成熟卵母細胞前是否需要進行促性腺激素刺激一直存在爭議。研究結(jié)果顯示，小劑量FSH能夠有效地提高卵母細胞獲取率和受精率。提示在避免引起卵巢過度刺激綜合征的同時，小劑量FSH刺激可能有利于形成一批大小比較均勻的卵泡，增加不成熟卵母細胞的獲取率，從而為進行下一步的體外成熟提供了比較充足的卵母細胞來源 [10] 。
2.4 ET后妊娠率低 (1)胚胎的發(fā)育和子宮內(nèi)膜的發(fā)育不同步。多數(shù)學者認為在短期使用少量雌激素準備內(nèi)膜，可提高妊娠率;(2)隨著年齡的增長，配子非整倍體發(fā)生率增加和氧自由基的大量積聚，勢必影響胚胎的活性，使胚胎在移植子宮后發(fā)育阻滯;(3)發(fā)生染色體退化的卵母細胞雖具有受精和卵裂的潛能，但形成的胚胎不能著床或雖著床而僅表現(xiàn)為生化妊娠(即β-hCG短暫升高)。當然，導致卵母細胞體外成熟率低、受精率不高、胚胎移植后妊娠率更低的原因還有其它方面，需要進一步深入實驗分析。
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3 IVM取卵的方式和時機
IVM發(fā)展到現(xiàn)在，收集的不成熟卵母細胞大多是來自竇卵泡。其中的不成熟卵母細胞有GV或MI期。收集這些來自竇卵泡的不成熟卵的方式大致有兩種:體內(nèi)和體外取卵。體內(nèi)取卵可借助于腹腔鏡或經(jīng)陰道超聲引導下進行卵泡穿刺取卵，前者在經(jīng)陰道超聲引導下卵泡穿刺術(shù)未發(fā)展起來前，一直是IVM獲得卵母細胞的主要方法，也可用于IVM收集不成熟卵母細胞，但由于這種方法造成的創(chuàng)傷大，應用受限;經(jīng)陰道超聲卵泡穿刺術(shù)為目前使用最廣的IVF取卵方式，也可用來作為獲取不成熟卵母細胞的方法。但是，用于IVF取卵的穿刺針斜面過大、針尖過長，因此不適于穿刺不成熟的卵泡。Trounson等改進了穿刺針的形狀和穿刺的方式，并有效地應用到IVM取卵;體外取卵就是從離體的卵巢標本取卵，以因良性婦科病變而手術(shù)切除的卵巢作為標本來源，在體視顯微鏡下直視取卵，用無菌的穿刺針在體視鏡下穿刺卵泡以獲得不成熟卵母細胞。該項技術(shù)操作簡單，易于掌握，已被廣泛采用，其取卵的效果并不亞于經(jīng)陰道超聲引導下穿刺取卵。最近，國內(nèi)有研究報道， 從IVF-ET治療周期卵泡液中發(fā)現(xiàn)了大量竇前卵泡，IVM培養(yǎng)近28天后，成熟率為38.1%，這一方法的建立增加了研究IVM培養(yǎng)卵母細胞的標本來源，是我國科研人員在生殖領(lǐng)域的重大貢獻 [11] 。對于在月經(jīng)周期何時取卵為最佳時間的問題，一直爭論不休。有人認為收集的卵母細胞數(shù)量與取卵時間無關(guān);但是考慮到卵母細胞成熟率的問題時，部分學者認為卵泡期收集的卵母細胞體外成熟率要高
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于黃體期收集的卵母細胞，故他們趨向于卵泡期取卵。
4 獲取卵母細胞臨床方案
4.1 不用促卵泡生長激素刺激 月經(jīng)過少的患者每日肌注黃體酮20mg，或用陰道黃體酮栓300mg，連用10天后停用，待撤退性出血的第3天做B超，以排除卵巢囊腫。在此后監(jiān)測主導卵泡的大小，一般在月經(jīng)的第8～12天，即主導卵泡的直徑達10～12mm時肌注hCG10000萬U。并在當日開始連續(xù)口服戊酸雌二醇6mg調(diào)節(jié)子宮內(nèi)膜的生長。卵泡直徑>4mm的卵泡都進行穿刺，并沖洗3次。在取卵日開始連續(xù)肌注黃體酮40mg，或用陰道黃體酮栓300mg進行黃體支持。
4.2 短時間應用促卵泡生長激素刺激 在月經(jīng)的第2天用FSH300IU，第4天用150IU，在第6天用150IU。不用hCG，第7天經(jīng)陰道取卵。在月經(jīng)的第2，6，12天抽靜脈血查FSH，LH，E 2，P，并用B超監(jiān)測子宮內(nèi)膜。取卵當日開始連續(xù)應用戊酸雌二醇6mg和黃體酮40mg準備子宮
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內(nèi)膜。
4.3 取卵 所有患者均在使用促性腺激素釋放激素激動劑后15天或撤退性出血后第5天，采用小劑量FSH進行刺激，F(xiàn)SH的應用時間一般為5～7天，于FSH刺激后5～8天，或于周期的第11～14天取卵，取卵前17h肌注人絨毛膜促性腺激素10000IU，取卵當天最大卵泡直徑不超過10mm。于月經(jīng)后第3天開始用人類尿促性腺激素(HMG)150IU肌肉注射，共4天，發(fā)現(xiàn)雙側(cè)卵巢有直徑8～10mm卵泡8個，直徑4～7mm卵泡6個。給予hCG10000IU。34h后取卵。同時，于注射hCG日開始補充β雌二醇2mg/d，于胚胎移植日加用黃體酮60mg/d肌肉注射 [12] 。
5 IVM培養(yǎng)的時間
從理論上推斷，體外培養(yǎng)的時間越長，達到MⅡ期的卵子越多。所以有的生殖中心在體外成熟在36h，有的在44h，有的在48h后拆除顆粒細胞進行ICSI。Mikkelsen [13] 發(fā)現(xiàn)縮短IVM的培養(yǎng)時間并不會影響胚胎發(fā)育的能力，在體外成熟28h和36h的卵子成熟率、受精率、分裂率和妊娠率沒有顯著差異。體外成熟的時間過長，反而使卵子失去了最佳的受精時機，出現(xiàn)皮質(zhì)顆粒的過早釋放以及透明帶硬化。透明帶硬化使得卵子受精和囊胚孵出障礙。而過早的剝離卵丘復合體細胞，使卵子與其間的聯(lián)系中斷，也不利于減數(shù)分裂的有效進行。即使與卵丘復合體細胞共培養(yǎng)也達不到理想的效果。
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6 IVM的臨床意義
6.1 與IVF、ICSI結(jié)合治療某些不孕癥 Barens [14] 等將IVM技術(shù)與顯微授精技術(shù)結(jié)合治療不孕癥，獲得成功。目前，已有越來越多的IVM結(jié)合IVF或卵泡漿內(nèi)單精子注射(ICSI)技術(shù)成功地應用于臨床的病例報道。迄今，世界上已有約20～30個采用該技術(shù)妊娠的正常嬰兒分娩。文獻報道，利用體外成熟的卵母細胞受精后胚胎移植以治療卵巢早衰(POF)。同時，利用IVM+IVF+ET技術(shù)提供正常胚胎給患有嚴重的、明顯遺傳傾向的遺傳病人，作為控制某些遺傳病傳代的設(shè)想也早被人們提出。
6.2 避免IVF嚴重并發(fā)癥的產(chǎn)生及IVM優(yōu)勢 如多囊卵巢綜合征和有排卵并有大量小卵泡發(fā)育的不育癥病人，對外源性激素刺激異常敏感，易于產(chǎn)生超刺激反應，引起卵巢過度刺激綜合征(OHSS);其次，在誘發(fā)的卵泡期中，卵泡產(chǎn)生高雌激素水平和在排卵后引發(fā)高雌激素水平，對于乳腺癌、卵巢癌和其它一些依賴性激素的癌癥(如黑色素瘤)是個潛在危險因素。因此，有的學者提倡用IVM技術(shù)取代藥物誘導排卵。因為正常婦女月經(jīng)周期中，約有10～50個卵泡同時發(fā)育，如果能在發(fā)育早期獲得這些不成熟卵母細胞，進行IVM培養(yǎng)，則可避免藥物促超排卵引發(fā)的上述危險�？梢怨�(jié)省用于募集卵泡的藥物費用;重新利用常規(guī)IVF中收集的不成熟卵;可以作為研究卵子發(fā)生減數(shù)分裂異常和非整倍體的模型;為冷凍卵子提供了一條出路，因為冷凍GV期卵子可以避開MⅡ期卵子減數(shù)分裂紡垂體的易損傷期。
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6.3 供卵 供卵正被提到生殖工程領(lǐng)域的議事日程上來，但臨床醫(yī)師卻苦于供卵來源缺乏。IVM技術(shù)解決了這一難題。因良性婦科疾病(如子宮內(nèi)膜異位癥、纖維瘤、子宮肌瘤、宮外孕等)而切除的卵巢組織或因罹患重癥疾病如癌癥需使用細胞毒藥物的年輕未生育女性病人的卵巢組織，均可用作IVF的供卵來源。如果IVM技術(shù)和卵母細胞冷凍技術(shù)結(jié)合則可建立一個和精子庫相應的卵子庫。
IVM的前景為生殖醫(yī)學家們所看好。雖然IVM技術(shù)還不成熟，還存在諸多的問題，但經(jīng)過不懈努力必將成為生殖工程領(lǐng)域中一項新興的技術(shù)。它有助于深入了解卵母細胞發(fā)育動力學，拓寬了治療不孕癥的思路。
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(收稿日期:2003-06-12)
(編輯 小川), 百拇醫(yī)藥(李蓉 湯惠茹 蔡志明)
百拇醫(yī)藥網(wǎng) http://www.www.srpcoatings.com/html/Dir/2004/05/10/39/61/89.htm