微小殘留病定量檢測的研究進展
【文獻標識碼】 A 【文章編號】 1684-2030(2003)08-0699-03
臨床上多數(shù)急性白血病患者診斷時體內(nèi)約有10 10 ～10 12 個白血病細胞，經(jīng)化療后，可以降到10 8 以下，臨床和血液細胞學達到完全緩解，此時用傳統(tǒng)形態(tài)學方法難以檢測到。微小殘留病(minimal residual disease，MRD)即指此種白血病患者經(jīng)過治療后體內(nèi)仍殘留白血病細胞的一種狀態(tài)�，F(xiàn)在許多學者認識到白血病復發(fā)的原因是殘留的白血病細胞克隆增殖的結果。因此，定量檢測MRD對療效評價，化療方案的確定，預后判斷，復發(fā)監(jiān)測和移植物凈化都有著重要的意義，也是近期研究的熱點。本文就此領域的研究進展作一簡要綜述。
MRD的檢測始于20世紀70年代末，到目前還未十分完善。國內(nèi)外學者提出過多種方法以便檢測出白血病患者緩解后體內(nèi)殘存的白血病細胞。早期方法的精確度、敏感度、特異性較差，如骨髓形態(tài)學檢查，細胞培養(yǎng)，染色體檢測，代謝酶測定等，只能粗略定性而已;80年代末90年代初，隨著分子生物學和流式細胞儀等檢測方法提出，檢測技術的精確度、敏感度、特異性不斷提高，并逐步由定性檢測發(fā)展到定量檢測。
, http://www.www.srpcoatings.com
1 MRD檢測方法
檢測方法主要有分子生物學和分子免疫學方法。
1.1 聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction，PCR) 目前PCR技術已成為分子生物學中最強有力和最普通的檢測方法。PCR技術以其快速、靈敏、簡便等優(yōu)點被學者廣泛應用于MRD研究，而PCR方法本身又在使用中不斷地得到發(fā)展，形成了一系列適用于不同目的的特殊方法。目前常用于定量監(jiān)測MRD的PCR技術類型有:(1)極限稀釋法;(2)競爭性定量PCR;(3)定量逆轉錄PCR;(4)熒光定量PCR和實時定量PCR等。
1.1.1 極限稀釋法(limiting dilution quantitative PCR) 即做一系列依倍稀釋管(常見以10倍數(shù)稀釋)，由其PCR擴增陰性管的稀釋度即可確定極限稀釋的倍數(shù)計算出此稀釋度時PCR反應液中的目的基因含量。此法操作簡單，可有效擴增不同目的基因，且得到的信號強而清晰。1996年Ouspenˉskaia MV [1] 等利用基因定量檢測MRD水平就是此法應用。但本法定量不準確，只能半定量，且操作時易被污染，近兩年來國外使用的學者漸少。
, 百拇醫(yī)藥
1.1.2 競爭性定量PCR(quantitative competitive PCR) 即在反應體系中靶基因的擴增與已知量的內(nèi)參照模板進行競爭，通過所擴增的內(nèi)參照模板的量做一線性圖，來對目標基因定量。由于待測模板與內(nèi)參照模板序列相同或相近，易形成異源雙鏈，影響了精確定量，目前在定量檢測中已經(jīng)較少單獨使用，常與其他方法聯(lián)合形成新的方法，如競爭性巢式PCR等。Guo JQ [2] 等比較競爭性巢式PCR與實時定量PCR在BCR-ABL融合基因上的差異，選取285位經(jīng)STI-571、干擾素或骨髓移植治療患者的435份外周血或骨髓樣本，采用競爭性巢式PCR、實時定量PCR、FISH和Western blotting等方法檢測Bcr-Abl，結果表明實時定量PCR敏感度稍遜于手工競爭性巢式PCR。但手工操作對操作人員的要求較高，且不能同時大樣本進行，只見于科學研究中，臨床上難以大規(guī)模應用。
1.1.3 定量逆轉錄PCR(quantitative reverse transcriptase PCR) 即先將靶mRNA逆轉錄成靶cDNA，然后靶cDNA的擴增與在反應體系中事先加入的已知量的片斷進行競爭，通過所擴增的競爭性片斷的量做一線性圖，來對目標片段定量。本法實際是逆轉錄PCR和競爭性定量PCR的聯(lián)合。優(yōu)點是擴增RNA分子的序列非常靈敏，能夠在復雜的來源中檢測和分離cDNA序列，比常規(guī)文庫為基礎的cDNA克隆方法有很多優(yōu)越性;速度快，材料少，能以細胞總RNA為材料不受大量污染tRNA和rRNA的影響;近年來被許多學者用于MRD的檢測，取得了較多的成果。早在1996年，Kazushi Inoue [3] 等應用RT-PCR檢測WT1在白血病患者治療后的表達，31人常規(guī)化療，23人骨髓移植，發(fā)現(xiàn)WT1基因表達的水平與預后有著明顯關聯(lián):WT1表達水平愈低，其完全緩解率更高，無病生存期和總生存期更長;慢性粒細胞白血病患者慢性期WT1非常低，隨至進展期和急變期逐漸增高，與病情有一定的關聯(lián)。
, http://www.www.srpcoatings.com
1.1.4實時定量PCR(real-time quantitative PCR，RQ-PCR)和熒光定量PCR(fluorescence quantitive PCR，F(xiàn)Q-PCR) 都是基于熒光能量傳遞技術(fluorescence resonance energy transfer，F(xiàn)RET)，通過檢測PCR過程的熒光訊號而得知靶基因的初始濃度。目前常用的復合探針法是綜合了Roche和MB兩種技術的優(yōu)點而改進的定量PCR方法。RQ-PCR和FQ-PCR的應用簡化了檢測過程，其反應速度快，靈敏度高，特異性強，可重復性好，是目前國外學者研究MRD首選的檢測手段。Nakagawa T [4] 等利用RQ-PCR監(jiān)測7位AML患者的MRD，其染色體異常為t(8;21)，其中4人行化療加異基因骨髓移植治療，另3人治療僅為化療。結果顯示;Allo-BMT中有2人經(jīng)歷復發(fā)，其AML1-MTG8mRNA被顯示有數(shù)量上的增長，在反復化療和供體淋巴輸注后完全緩解，AML1-MTG8表達水平下降。同樣地Marcucci [5] 等用PQ-PCR擴增CBFβ/MYH11融合轉錄本已用于MRD監(jiān)測和評估具有inv(16)(p13q22)的AML患者的危險性。
, 百拇醫(yī)藥
1.2 流式細胞術(flow cytometry，F(xiàn)CM) 是通過測量射門參數(shù)在單細胞水平辨認細胞形態(tài)、大小和熒光特征。其優(yōu)點是速度快，每秒可檢測5000～10000個細胞;自動化，可以用計算機記錄處理并對各個細胞進行多參數(shù)分析;敏感性高，可達10～4，僅次于PCR�，F(xiàn)有部分研究者利用單克隆抗體結合多色熒光標記，極大地提高了FCM在MRD檢測的特異性和敏感性，促進了FCM在臨床上的推廣應用。Bjorkˉlund E [6] 等利用流式細胞術和活/射門分析技術隨訪70位兒童急淋患者，中位數(shù)53個月，發(fā)現(xiàn)預后與白血病殘留水平密切相關，認為該技術對進一步的研究和提高療效有較高價值。
1.3 熒光原位雜交(fluorescence in situ hybridization，F(xiàn)ISH) 是通過特定分子的標記探針與染色體原位雜交和熒光顯色，測定中期染色體和間期細胞核中特定的DNA序列的一種基因分析技術�，F(xiàn)隨著外熒光濾色片制備技術的提高，應用不同的外熒光濾色征組合，使之改進為多色熒光原位雜交技術(multicolor FISH，M-FISH)。Varella-Garcia M [7] 等將CD34+細胞分選結合應用FISH對t(8;21)陽性的AML進行MRD檢測，彌補了FISH的假陽性，同時間接提供了殘留t(8;21)細胞分化狀態(tài)的信息。
, 百拇醫(yī)藥
1.4 多種方法結合應用 目前檢測MRD的方法各有優(yōu)缺點，至今尚未有一種能代替上述各種方法優(yōu)點的檢測手段，許多學者就聯(lián)合兩種或多種檢測方法來研究MRD，取得了較好的效果。Rasmussen T [8] 等基于5’nuclease Taqman技術建立real-time PCR，結合等位基因特異性核苷酸探針技術用以研究和監(jiān)測多發(fā)性骨髓瘤治療后的腫瘤負荷情況。發(fā)現(xiàn)多發(fā)性骨髓瘤患者行外周血干細胞移植術后，可達到完全緩解，但定量監(jiān)測其MRD還殘留有惡性細胞，同時闡明MM骨髓中內(nèi)容物潛在問題是骨髓的不均一浸潤。
2 監(jiān)測指標及臨床意義
2.1 免疫學指標———人白細胞分化抗原 白細胞分化抗原是白細胞(還包括血小板，血管內(nèi)皮細胞)在正常分化成熟不同譜系和不同階段以及活化過程中，出現(xiàn)或消失的細胞表面標記。白血病是造血細胞惡性克隆增殖，白血病細胞往往發(fā)育停滯在某一分化階段，經(jīng)常出現(xiàn)混亂或不常見的表型，如抗原過度表達、抗原表達不同步及系列失真。通 �？捎糜贛RD檢測的白血病細胞抗原表達的特點有:(1)粒系和淋系相關抗原共表達;(2)某些抗原的過度表達或出現(xiàn)異常抗原表型;(3)正�？乖磉_的缺損或減少。Andy C，Rawstron等 [9] 用流式細胞儀檢測CD19/CD5/CD20/CD79b在慢性淋巴細胞性白血病的表達時發(fā)現(xiàn)，MRD - (<0.01×10 9/L)患者的總生存率和無病生存質(zhì)量與MRD+的患者有著明顯的差異。
, http://www.www.srpcoatings.com
2.2 WT1基因 WT1基因是最早發(fā)現(xiàn)的與Wilm腫瘤發(fā)生有關的基因，位于11p13，編碼一個分子量5.2～5.4萬的4個鋅指結構的結合蛋白，具有轉錄調(diào)控功能。目前被認為是血液系統(tǒng)各種疾病的共有標志，正常人難以檢測到WT1的表達，而幾乎在所有的白血病中都能檢測到，其轉錄動力學與疾病進程和預后密切相關 [3] 。尤其要指出的是，Ogawa H [10] 等在Kazushi Inoue [3] 的基礎上，進一步在骨髓移植的患者通過檢測WT1基因的表達來監(jiān)測MRD，陽性者即通過供者淋巴細胞輸注治療，效果良好，結果無GVHD和再生不良的發(fā)生。這表明監(jiān)測MRD不僅可以預測病情，還可以指導治療，有著重大的臨床價值。
2.3 P15基因甲基化 P15基因是一個重要的抑癌基因，定位于9P21，該基因操縱區(qū)內(nèi)5’-CpG島高度甲基化導致其功能的失活，為惡性腫瘤細胞所特有，故有些學者利用其作為一項監(jiān)測MRD指標。Chim CS [11] 等用甲基化特異性PCR監(jiān)測15例急性早幼粒細胞性白血病患者病情;發(fā)現(xiàn)其中4例患者P15基因甲基化陰性保持持續(xù)緩解，有11例患者P15基因甲基化陽性，持續(xù)陽性者復發(fā)，兩組的5年生存率有統(tǒng)計學意義。
, 百拇醫(yī)藥
2.4 白血病遺傳學指標 白血病常有細胞染色體及融合基因的異常，見表1。
表1 白血病常有細胞染色體及融合基因的異常(略)
其中部分染色體及其對應的融合基因具有獨立的預后價值和診斷價值。伴隨染色體易位的基因改變或異常基因轉錄物是目前MRD檢測的主要分子標記，現(xiàn)將常用的基因簡述如下。
2.4.1 TCR/IgH基因重排 T細胞受體(TCR)和免疫球蛋白(Ig)基因包括V、D、J、C等多組不連續(xù)基因片段。重排后，各基因片段之間的距離明顯縮短，與C基因相比較，V、D、J基因片段數(shù)量較多，又有較高的可變性，故特異性較高，這樣，可根據(jù)診斷時所確定的TCR/IgH基因重排序列來 監(jiān)測MRD的存在。Gruhn B [12] 等通過定量檢測克隆特異的IgH重排基因的表達來對26例B-ALL進行微量殘留病(MRD)動態(tài)定量檢測和化療效應差異的定量評價。結果表明所有陰性患者(19例)目前都持續(xù)緩解(平均63個月)，而7例陽性患者中有4例復發(fā)，(復發(fā)時間平均21個月)，而3例IgH重排基因低水平表達的患者(<2×10 -5 )未見復發(fā)。
, http://www.www.srpcoatings.com
2.4.2 PML-RARα融合基因 為急性早幼粒細胞性白血病特異性融合基因，常被用于監(jiān)測APL病情變化。Galˉlagher RE等 [13] 引進PML-RARα標準系數(shù)(normdalize quoˉtient;NQ)就是PML-RARα的mRNA拷貝數(shù)被分割轉換成看家基因3-磷酸甘油醛脫氫酶mRNA的拷貝數(shù)，采用實時定量逆轉錄PCR方法監(jiān)測123名患者，發(fā)現(xiàn)最開始由全反式維甲酸誘導達完全緩解的患者的NQ比由化療達完全緩解的患者的NQ低:鞏固化療后NQ超過10 -5 易復發(fā)。為臨床提供了治療和預后的判斷依據(jù)。
2.4.3 TEL/AML1融合基因 TEL基因位于12q13，是ETS基因家族的成員，與其他基因共同組成融合基因?qū)е掳籽〉陌l(fā)生。兒童急淋中常見t(12;21)易位，產(chǎn)生的TEL/AML1融合基因常被學者作為檢測MRD的標記。Madzo J等 [14] 用實時定量PCR方法，在57例診斷的TEL/AML1陽性急性淋巴細胞白血病兒童新患者中，分析其治療后33天殘留病存在的情況，13%的患者陽性(10 -2 ～10 -4 )，13%的患者為弱陽性(≤10 -4 )，其他為陰性。結果證實了TEL/AML1陽性兒童急淋療效比陰性患者好。此外，還有BCR-ABL [15～16] 和AML1-ETO [17] 等常被用來定量監(jiān)測MRD。
, 百拇醫(yī)藥
3 結語
急性白血病微小殘留病是白血病復發(fā)的根源，因此，檢測MRD不僅僅是用來作為判斷白血病患者預后的標記，還可以指在化療方案的選擇，新藥品 [16] 、新療法 [4，10] 療效的判斷起重要作用。通過監(jiān)測到MRD的存在，有人 [4，10] 輸注供者淋巴細胞而提高生存期和生存質(zhì)量，有人 [18] 則加用特異抗體來提高整個治療的療效。這表明監(jiān)測MRD不僅可以預測病情，還可以指導治療，有著明確的臨床價值。目前我國尚未普遍開展MRD的檢測及實驗室方法和標記物的標準化，相信隨著檢測方法的改進和推廣，MRD的監(jiān)測會在臨床上廣泛應用而造福于廣大白血病患者。
參考文獻
1 Ouspenskaia MV，Johnston DA，Roberts WM，et al.Accurate quantitaˉtion of residual B-precursor acute lymphoblastic leukemia by limiting dilution and a PCR-based detection system:a description of the method and the principles involved.Leukemia，1995，9(2):321-328.
, 百拇醫(yī)藥
2 Guo JQ，Lin H，Kantarjian H，Talpaz M，et al.Comparison of competiˉtive-nested PCR and real-time PCR in detecting BCR-ABL fusion transcripts in chronic myeloid leukemia patients.Leukemia，2002，16(12):2447-2453.
3 K Inoue，H Ogawa，TYamagami，et al.Long-term follow-up of minˉimal residual disease in leukemia patients by monitoring WT1(Wilms tumor gene)expression levels.Blood，(88):6(September15)，1996，2267-2278.
4 SugimotoT，Das H，Imoto S，et al.Quantitation of minimal residual disˉease in t(8;21)-positive acute myelogenous leukemia patients using real-time quantitative RT-PCR.Am J Heamatol，2000，64(2):101-106.
, 百拇醫(yī)藥
5 Marcucci G，Caligiuri MA，Dohner H，et al.Quantification of CBFbeta/MYH11fusion transcript by real time RT-PCR in patients with INV(16)acute myeloid leukemia.Leukemia，2001，15(7):1072-1080.
6 Bjorklund E，Mazur J，Soderhall S，et al.Flow cytometric follow-up of minimal residual disease in bone marrow gives prognostic information in childrenwith acute lymphoblastic leukemia.Leukemia，2003，17(1);138-148.
7 Varella-Garcia M，Hogan CJ，Odom LF，et al.Minimal residual disease(MRD)in remission t(8;21)AML and in vivo differentiation detected by FISH and CD34+cell sorting.Leukemia，2001，15(9):1408-1414.
, http://www.www.srpcoatings.com
8 Rasmussen T，Poulsen TS，Honore L，et al.Quantitation of minimal residual disease in multiple myeloma using an allele-specific real-time PCR assay.Exp-Hematol，2000，28(9):1039-1045.
9 Andy C，Rawstron，Ben Kennedy，et al.uantitation of minimal disease levelsin chronic lymphocytic leukemia using a sensitive flow cytometric assay improves the prediction of outcome and can be used to optimize therapy.Blood，2001，98，29-35.
10 Ogawa H，Tsubo A，Oji Y，et al.Successful donor leukocyte transfusion at molecular relapse for a patient with acute myeloid leukemia who was treated with allogenic bone marrow transplantation:importance of the monitoring of minimal residual disease by WT1assay.Bone Marrow Transplant，1998，21(5):525-527.
, 百拇醫(yī)藥
11 Chim CS，Liang R，tam CY，et al.Methylation of p15and p16genes in acute promyelocytic leukemia:potential diagnostic and prognostic sigˉnificance.J Chin Oncol，2001，19(7):2033-2040.
12 Gruhn B，Hongeng S，Yi H，et al.Minimal residual disease after intenˉsive induction therapy in childhood acute lymphoblastic leukemia preˉdicts outcome.Leukemia，1998，(5):12;675.
13 Robert E，Gallagher，BeowY，et al.Quantitative real-time RT-PCR analysis of PML-RAR mRNA in acutepromyelocytic leukemia:asˉsessment of prognostic significance in adult patients from intergroup protocol0129.Blood，2003，101(7):2521-2528.
, 百拇醫(yī)藥
14 Madzo J，Zuna J，Muzikova M，et al.Slower molecular response to treatˉment predicts poor outcome in patients with TEL/AML1positive acute lymphoblastic leukemia:prospective real-time quantitative reverse transcriptase-polymerase chain reaction study.Cancer，2003，(1):105-113.
15 Guo JQ，Lin H，Kantarjian H，et al.Cmparison of competitive-nested PCR and real-time PCR in detecting BCR-ABL fusion transcripts in chronic myeloid leukemia patients.Leukemia，2002，16(12):2447-2453.
, 百拇醫(yī)藥
16 Kantarjian HM，Cortes JE，O’Brien S，et al.Imatinib mesylate therapy in newly diagnosed patients with Philadelphia chromosome-positive chronic myelogenous leukemia:high incidence of early complete and major cytogenetic responses.Blood，2003，1;101(1):97-100.
17 Barragan E，Bolufer P，Moreno I.Quantitative detection of AML1-ETO rearrangement by real-time RT-PCR using fluorescently laˉbeled probes.Leuk Lymphoma，2001，42(4):747-756.
18 Jurcic JG.Antibody therapy for residual disease in acute myelogenous leukemia.Crit Rev Oncol Hematol，2001，38(1):37-45.
作者單位:330006江西醫(yī)學院(江醫(yī)一附院血液科)
(收稿日期:2001-07-03)
(編輯 一坤), 百拇醫(yī)藥(潘勝美(綜述))
臨床上多數(shù)急性白血病患者診斷時體內(nèi)約有10 10 ～10 12 個白血病細胞，經(jīng)化療后，可以降到10 8 以下，臨床和血液細胞學達到完全緩解，此時用傳統(tǒng)形態(tài)學方法難以檢測到。微小殘留病(minimal residual disease，MRD)即指此種白血病患者經(jīng)過治療后體內(nèi)仍殘留白血病細胞的一種狀態(tài)�，F(xiàn)在許多學者認識到白血病復發(fā)的原因是殘留的白血病細胞克隆增殖的結果。因此，定量檢測MRD對療效評價，化療方案的確定，預后判斷，復發(fā)監(jiān)測和移植物凈化都有著重要的意義，也是近期研究的熱點。本文就此領域的研究進展作一簡要綜述。
MRD的檢測始于20世紀70年代末，到目前還未十分完善。國內(nèi)外學者提出過多種方法以便檢測出白血病患者緩解后體內(nèi)殘存的白血病細胞。早期方法的精確度、敏感度、特異性較差，如骨髓形態(tài)學檢查，細胞培養(yǎng)，染色體檢測，代謝酶測定等，只能粗略定性而已;80年代末90年代初，隨著分子生物學和流式細胞儀等檢測方法提出，檢測技術的精確度、敏感度、特異性不斷提高，并逐步由定性檢測發(fā)展到定量檢測。
, http://www.www.srpcoatings.com
1 MRD檢測方法
檢測方法主要有分子生物學和分子免疫學方法。
1.1 聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction，PCR) 目前PCR技術已成為分子生物學中最強有力和最普通的檢測方法。PCR技術以其快速、靈敏、簡便等優(yōu)點被學者廣泛應用于MRD研究，而PCR方法本身又在使用中不斷地得到發(fā)展，形成了一系列適用于不同目的的特殊方法。目前常用于定量監(jiān)測MRD的PCR技術類型有:(1)極限稀釋法;(2)競爭性定量PCR;(3)定量逆轉錄PCR;(4)熒光定量PCR和實時定量PCR等。
1.1.1 極限稀釋法(limiting dilution quantitative PCR) 即做一系列依倍稀釋管(常見以10倍數(shù)稀釋)，由其PCR擴增陰性管的稀釋度即可確定極限稀釋的倍數(shù)計算出此稀釋度時PCR反應液中的目的基因含量。此法操作簡單，可有效擴增不同目的基因，且得到的信號強而清晰。1996年Ouspenˉskaia MV [1] 等利用基因定量檢測MRD水平就是此法應用。但本法定量不準確，只能半定量，且操作時易被污染，近兩年來國外使用的學者漸少。
, 百拇醫(yī)藥
1.1.2 競爭性定量PCR(quantitative competitive PCR) 即在反應體系中靶基因的擴增與已知量的內(nèi)參照模板進行競爭，通過所擴增的內(nèi)參照模板的量做一線性圖，來對目標基因定量。由于待測模板與內(nèi)參照模板序列相同或相近，易形成異源雙鏈，影響了精確定量，目前在定量檢測中已經(jīng)較少單獨使用，常與其他方法聯(lián)合形成新的方法，如競爭性巢式PCR等。Guo JQ [2] 等比較競爭性巢式PCR與實時定量PCR在BCR-ABL融合基因上的差異，選取285位經(jīng)STI-571、干擾素或骨髓移植治療患者的435份外周血或骨髓樣本，采用競爭性巢式PCR、實時定量PCR、FISH和Western blotting等方法檢測Bcr-Abl，結果表明實時定量PCR敏感度稍遜于手工競爭性巢式PCR。但手工操作對操作人員的要求較高，且不能同時大樣本進行，只見于科學研究中，臨床上難以大規(guī)模應用。
1.1.3 定量逆轉錄PCR(quantitative reverse transcriptase PCR) 即先將靶mRNA逆轉錄成靶cDNA，然后靶cDNA的擴增與在反應體系中事先加入的已知量的片斷進行競爭，通過所擴增的競爭性片斷的量做一線性圖，來對目標片段定量。本法實際是逆轉錄PCR和競爭性定量PCR的聯(lián)合。優(yōu)點是擴增RNA分子的序列非常靈敏，能夠在復雜的來源中檢測和分離cDNA序列，比常規(guī)文庫為基礎的cDNA克隆方法有很多優(yōu)越性;速度快，材料少，能以細胞總RNA為材料不受大量污染tRNA和rRNA的影響;近年來被許多學者用于MRD的檢測，取得了較多的成果。早在1996年，Kazushi Inoue [3] 等應用RT-PCR檢測WT1在白血病患者治療后的表達，31人常規(guī)化療，23人骨髓移植，發(fā)現(xiàn)WT1基因表達的水平與預后有著明顯關聯(lián):WT1表達水平愈低，其完全緩解率更高，無病生存期和總生存期更長;慢性粒細胞白血病患者慢性期WT1非常低，隨至進展期和急變期逐漸增高，與病情有一定的關聯(lián)。
, http://www.www.srpcoatings.com
1.1.4實時定量PCR(real-time quantitative PCR，RQ-PCR)和熒光定量PCR(fluorescence quantitive PCR，F(xiàn)Q-PCR) 都是基于熒光能量傳遞技術(fluorescence resonance energy transfer，F(xiàn)RET)，通過檢測PCR過程的熒光訊號而得知靶基因的初始濃度。目前常用的復合探針法是綜合了Roche和MB兩種技術的優(yōu)點而改進的定量PCR方法。RQ-PCR和FQ-PCR的應用簡化了檢測過程，其反應速度快，靈敏度高，特異性強，可重復性好，是目前國外學者研究MRD首選的檢測手段。Nakagawa T [4] 等利用RQ-PCR監(jiān)測7位AML患者的MRD，其染色體異常為t(8;21)，其中4人行化療加異基因骨髓移植治療，另3人治療僅為化療。結果顯示;Allo-BMT中有2人經(jīng)歷復發(fā)，其AML1-MTG8mRNA被顯示有數(shù)量上的增長，在反復化療和供體淋巴輸注后完全緩解，AML1-MTG8表達水平下降。同樣地Marcucci [5] 等用PQ-PCR擴增CBFβ/MYH11融合轉錄本已用于MRD監(jiān)測和評估具有inv(16)(p13q22)的AML患者的危險性。
, 百拇醫(yī)藥
1.2 流式細胞術(flow cytometry，F(xiàn)CM) 是通過測量射門參數(shù)在單細胞水平辨認細胞形態(tài)、大小和熒光特征。其優(yōu)點是速度快，每秒可檢測5000～10000個細胞;自動化，可以用計算機記錄處理并對各個細胞進行多參數(shù)分析;敏感性高，可達10～4，僅次于PCR�，F(xiàn)有部分研究者利用單克隆抗體結合多色熒光標記，極大地提高了FCM在MRD檢測的特異性和敏感性，促進了FCM在臨床上的推廣應用。Bjorkˉlund E [6] 等利用流式細胞術和活/射門分析技術隨訪70位兒童急淋患者，中位數(shù)53個月，發(fā)現(xiàn)預后與白血病殘留水平密切相關，認為該技術對進一步的研究和提高療效有較高價值。
1.3 熒光原位雜交(fluorescence in situ hybridization，F(xiàn)ISH) 是通過特定分子的標記探針與染色體原位雜交和熒光顯色，測定中期染色體和間期細胞核中特定的DNA序列的一種基因分析技術�，F(xiàn)隨著外熒光濾色片制備技術的提高，應用不同的外熒光濾色征組合，使之改進為多色熒光原位雜交技術(multicolor FISH，M-FISH)。Varella-Garcia M [7] 等將CD34+細胞分選結合應用FISH對t(8;21)陽性的AML進行MRD檢測，彌補了FISH的假陽性，同時間接提供了殘留t(8;21)細胞分化狀態(tài)的信息。
, 百拇醫(yī)藥
1.4 多種方法結合應用 目前檢測MRD的方法各有優(yōu)缺點，至今尚未有一種能代替上述各種方法優(yōu)點的檢測手段，許多學者就聯(lián)合兩種或多種檢測方法來研究MRD，取得了較好的效果。Rasmussen T [8] 等基于5’nuclease Taqman技術建立real-time PCR，結合等位基因特異性核苷酸探針技術用以研究和監(jiān)測多發(fā)性骨髓瘤治療后的腫瘤負荷情況。發(fā)現(xiàn)多發(fā)性骨髓瘤患者行外周血干細胞移植術后，可達到完全緩解，但定量監(jiān)測其MRD還殘留有惡性細胞，同時闡明MM骨髓中內(nèi)容物潛在問題是骨髓的不均一浸潤。
2 監(jiān)測指標及臨床意義
2.1 免疫學指標———人白細胞分化抗原 白細胞分化抗原是白細胞(還包括血小板，血管內(nèi)皮細胞)在正常分化成熟不同譜系和不同階段以及活化過程中，出現(xiàn)或消失的細胞表面標記。白血病是造血細胞惡性克隆增殖，白血病細胞往往發(fā)育停滯在某一分化階段，經(jīng)常出現(xiàn)混亂或不常見的表型，如抗原過度表達、抗原表達不同步及系列失真。通 �？捎糜贛RD檢測的白血病細胞抗原表達的特點有:(1)粒系和淋系相關抗原共表達;(2)某些抗原的過度表達或出現(xiàn)異常抗原表型;(3)正�？乖磉_的缺損或減少。Andy C，Rawstron等 [9] 用流式細胞儀檢測CD19/CD5/CD20/CD79b在慢性淋巴細胞性白血病的表達時發(fā)現(xiàn)，MRD - (<0.01×10 9/L)患者的總生存率和無病生存質(zhì)量與MRD+的患者有著明顯的差異。
, http://www.www.srpcoatings.com
2.2 WT1基因 WT1基因是最早發(fā)現(xiàn)的與Wilm腫瘤發(fā)生有關的基因，位于11p13，編碼一個分子量5.2～5.4萬的4個鋅指結構的結合蛋白，具有轉錄調(diào)控功能。目前被認為是血液系統(tǒng)各種疾病的共有標志，正常人難以檢測到WT1的表達，而幾乎在所有的白血病中都能檢測到，其轉錄動力學與疾病進程和預后密切相關 [3] 。尤其要指出的是，Ogawa H [10] 等在Kazushi Inoue [3] 的基礎上，進一步在骨髓移植的患者通過檢測WT1基因的表達來監(jiān)測MRD，陽性者即通過供者淋巴細胞輸注治療，效果良好，結果無GVHD和再生不良的發(fā)生。這表明監(jiān)測MRD不僅可以預測病情，還可以指導治療，有著重大的臨床價值。
2.3 P15基因甲基化 P15基因是一個重要的抑癌基因，定位于9P21，該基因操縱區(qū)內(nèi)5’-CpG島高度甲基化導致其功能的失活，為惡性腫瘤細胞所特有，故有些學者利用其作為一項監(jiān)測MRD指標。Chim CS [11] 等用甲基化特異性PCR監(jiān)測15例急性早幼粒細胞性白血病患者病情;發(fā)現(xiàn)其中4例患者P15基因甲基化陰性保持持續(xù)緩解，有11例患者P15基因甲基化陽性，持續(xù)陽性者復發(fā)，兩組的5年生存率有統(tǒng)計學意義。
, 百拇醫(yī)藥
2.4 白血病遺傳學指標 白血病常有細胞染色體及融合基因的異常，見表1。
表1 白血病常有細胞染色體及融合基因的異常(略)
其中部分染色體及其對應的融合基因具有獨立的預后價值和診斷價值。伴隨染色體易位的基因改變或異常基因轉錄物是目前MRD檢測的主要分子標記，現(xiàn)將常用的基因簡述如下。
2.4.1 TCR/IgH基因重排 T細胞受體(TCR)和免疫球蛋白(Ig)基因包括V、D、J、C等多組不連續(xù)基因片段。重排后，各基因片段之間的距離明顯縮短，與C基因相比較，V、D、J基因片段數(shù)量較多，又有較高的可變性，故特異性較高，這樣，可根據(jù)診斷時所確定的TCR/IgH基因重排序列來 監(jiān)測MRD的存在。Gruhn B [12] 等通過定量檢測克隆特異的IgH重排基因的表達來對26例B-ALL進行微量殘留病(MRD)動態(tài)定量檢測和化療效應差異的定量評價。結果表明所有陰性患者(19例)目前都持續(xù)緩解(平均63個月)，而7例陽性患者中有4例復發(fā)，(復發(fā)時間平均21個月)，而3例IgH重排基因低水平表達的患者(<2×10 -5 )未見復發(fā)。
, http://www.www.srpcoatings.com
2.4.2 PML-RARα融合基因 為急性早幼粒細胞性白血病特異性融合基因，常被用于監(jiān)測APL病情變化。Galˉlagher RE等 [13] 引進PML-RARα標準系數(shù)(normdalize quoˉtient;NQ)就是PML-RARα的mRNA拷貝數(shù)被分割轉換成看家基因3-磷酸甘油醛脫氫酶mRNA的拷貝數(shù)，采用實時定量逆轉錄PCR方法監(jiān)測123名患者，發(fā)現(xiàn)最開始由全反式維甲酸誘導達完全緩解的患者的NQ比由化療達完全緩解的患者的NQ低:鞏固化療后NQ超過10 -5 易復發(fā)。為臨床提供了治療和預后的判斷依據(jù)。
2.4.3 TEL/AML1融合基因 TEL基因位于12q13，是ETS基因家族的成員，與其他基因共同組成融合基因?qū)е掳籽〉陌l(fā)生。兒童急淋中常見t(12;21)易位，產(chǎn)生的TEL/AML1融合基因常被學者作為檢測MRD的標記。Madzo J等 [14] 用實時定量PCR方法，在57例診斷的TEL/AML1陽性急性淋巴細胞白血病兒童新患者中，分析其治療后33天殘留病存在的情況，13%的患者陽性(10 -2 ～10 -4 )，13%的患者為弱陽性(≤10 -4 )，其他為陰性。結果證實了TEL/AML1陽性兒童急淋療效比陰性患者好。此外，還有BCR-ABL [15～16] 和AML1-ETO [17] 等常被用來定量監(jiān)測MRD。
, 百拇醫(yī)藥
3 結語
急性白血病微小殘留病是白血病復發(fā)的根源，因此，檢測MRD不僅僅是用來作為判斷白血病患者預后的標記，還可以指在化療方案的選擇，新藥品 [16] 、新療法 [4，10] 療效的判斷起重要作用。通過監(jiān)測到MRD的存在，有人 [4，10] 輸注供者淋巴細胞而提高生存期和生存質(zhì)量，有人 [18] 則加用特異抗體來提高整個治療的療效。這表明監(jiān)測MRD不僅可以預測病情，還可以指導治療，有著明確的臨床價值。目前我國尚未普遍開展MRD的檢測及實驗室方法和標記物的標準化，相信隨著檢測方法的改進和推廣，MRD的監(jiān)測會在臨床上廣泛應用而造福于廣大白血病患者。
參考文獻
1 Ouspenskaia MV，Johnston DA，Roberts WM，et al.Accurate quantitaˉtion of residual B-precursor acute lymphoblastic leukemia by limiting dilution and a PCR-based detection system:a description of the method and the principles involved.Leukemia，1995，9(2):321-328.
, 百拇醫(yī)藥
2 Guo JQ，Lin H，Kantarjian H，Talpaz M，et al.Comparison of competiˉtive-nested PCR and real-time PCR in detecting BCR-ABL fusion transcripts in chronic myeloid leukemia patients.Leukemia，2002，16(12):2447-2453.
3 K Inoue，H Ogawa，TYamagami，et al.Long-term follow-up of minˉimal residual disease in leukemia patients by monitoring WT1(Wilms tumor gene)expression levels.Blood，(88):6(September15)，1996，2267-2278.
4 SugimotoT，Das H，Imoto S，et al.Quantitation of minimal residual disˉease in t(8;21)-positive acute myelogenous leukemia patients using real-time quantitative RT-PCR.Am J Heamatol，2000，64(2):101-106.
, 百拇醫(yī)藥
5 Marcucci G，Caligiuri MA，Dohner H，et al.Quantification of CBFbeta/MYH11fusion transcript by real time RT-PCR in patients with INV(16)acute myeloid leukemia.Leukemia，2001，15(7):1072-1080.
6 Bjorklund E，Mazur J，Soderhall S，et al.Flow cytometric follow-up of minimal residual disease in bone marrow gives prognostic information in childrenwith acute lymphoblastic leukemia.Leukemia，2003，17(1);138-148.
7 Varella-Garcia M，Hogan CJ，Odom LF，et al.Minimal residual disease(MRD)in remission t(8;21)AML and in vivo differentiation detected by FISH and CD34+cell sorting.Leukemia，2001，15(9):1408-1414.
, http://www.www.srpcoatings.com
8 Rasmussen T，Poulsen TS，Honore L，et al.Quantitation of minimal residual disease in multiple myeloma using an allele-specific real-time PCR assay.Exp-Hematol，2000，28(9):1039-1045.
9 Andy C，Rawstron，Ben Kennedy，et al.uantitation of minimal disease levelsin chronic lymphocytic leukemia using a sensitive flow cytometric assay improves the prediction of outcome and can be used to optimize therapy.Blood，2001，98，29-35.
10 Ogawa H，Tsubo A，Oji Y，et al.Successful donor leukocyte transfusion at molecular relapse for a patient with acute myeloid leukemia who was treated with allogenic bone marrow transplantation:importance of the monitoring of minimal residual disease by WT1assay.Bone Marrow Transplant，1998，21(5):525-527.
, 百拇醫(yī)藥
11 Chim CS，Liang R，tam CY，et al.Methylation of p15and p16genes in acute promyelocytic leukemia:potential diagnostic and prognostic sigˉnificance.J Chin Oncol，2001，19(7):2033-2040.
12 Gruhn B，Hongeng S，Yi H，et al.Minimal residual disease after intenˉsive induction therapy in childhood acute lymphoblastic leukemia preˉdicts outcome.Leukemia，1998，(5):12;675.
13 Robert E，Gallagher，BeowY，et al.Quantitative real-time RT-PCR analysis of PML-RAR mRNA in acutepromyelocytic leukemia:asˉsessment of prognostic significance in adult patients from intergroup protocol0129.Blood，2003，101(7):2521-2528.
, 百拇醫(yī)藥
14 Madzo J，Zuna J，Muzikova M，et al.Slower molecular response to treatˉment predicts poor outcome in patients with TEL/AML1positive acute lymphoblastic leukemia:prospective real-time quantitative reverse transcriptase-polymerase chain reaction study.Cancer，2003，(1):105-113.
15 Guo JQ，Lin H，Kantarjian H，et al.Cmparison of competitive-nested PCR and real-time PCR in detecting BCR-ABL fusion transcripts in chronic myeloid leukemia patients.Leukemia，2002，16(12):2447-2453.
, 百拇醫(yī)藥
16 Kantarjian HM，Cortes JE，O’Brien S，et al.Imatinib mesylate therapy in newly diagnosed patients with Philadelphia chromosome-positive chronic myelogenous leukemia:high incidence of early complete and major cytogenetic responses.Blood，2003，1;101(1):97-100.
17 Barragan E，Bolufer P，Moreno I.Quantitative detection of AML1-ETO rearrangement by real-time RT-PCR using fluorescently laˉbeled probes.Leuk Lymphoma，2001，42(4):747-756.
18 Jurcic JG.Antibody therapy for residual disease in acute myelogenous leukemia.Crit Rev Oncol Hematol，2001，38(1):37-45.
作者單位:330006江西醫(yī)學院(江醫(yī)一附院血液科)
(收稿日期:2001-07-03)
(編輯 一坤), 百拇醫(yī)藥(潘勝美(綜述))
百拇醫(yī)藥網(wǎng) http://www.www.srpcoatings.com/html/Dir/2004/05/10/39/63/05.htm