大柴胡湯對實驗性動脈粥樣硬化形成及原癌基因表達的影響
【文獻標(biāo)識碼】 A 【文章編號】 1606-8106(2003)04-0489-02
Effect of Da Chai Hu decoction(DCHD)on atherogenesis and on c-myc gene expression
Wang Fengrong，Liu Tong，Yang Guanlin
Affiliated Hospital of Liaoning TCM，Shenyang110032.
【Abstract】 Objective To observe the effect of DCHD on the AS forming and expression of c-myc mRNA in aortic wall of the rabbits model with AS.Methods Atherosclerotic rabbit model fed by high cholesterol was established.The effects of DCHD on expression of c-myc mRNA in aortic wall was observed in situ hybridization.Results It was showed that in DCHD treated group the thickness of plaques was reduced significantly and expression of c-myc mRNA was markedly suppressed.Conclusion It suggest that DCHD exert strong antiatherosclerotic effect on exˉperimental rabbit hypolidemic and inhibit gene expression related to AS lesions maycontribute to the mechanisms.
, http://www.www.srpcoatings.com
Key words DaChaiHu decoction atherosclerosis c-mycgene hyperlipemia
大柴胡湯為《傷寒論》名方，具有和解少陽、暢通氣機、內(nèi)瀉熱結(jié)之功，現(xiàn)代藥理研究其具有抗炎、降脂作用，本研究進一步探討其抗動脈粥樣硬化作用及其機制。
1 資料與方法
1.1 藥物及試劑 大柴胡湯由遼寧中醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院制劑室提供，藥物濃度為0.5g/ml，膽固醇購自遼寧化學(xué)試劑公司(荷蘭進口分裝)，辛伐他汀為美國默沙東大藥廠生產(chǎn)。
1.2 主要儀器 OLYMPUS光學(xué)顯微鏡、HZS-H水浴振蕩器(哈爾濱東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)公司生產(chǎn))、AO石蠟切片機(Scientific Instruments生產(chǎn))、貝克曼700型全自動生化分析儀(美國制造)。
, 百拇醫(yī)藥
1.3 動物模型建立 雄性健康大耳白兔32只，體重2.0～2.5kg，購自遼寧中醫(yī)學(xué)院實驗動物中心。將實驗兔隨機分為四組，每組8只。正常對照組(C)喂飼基礎(chǔ)飼料，AS模型組(CAS)給予每日1%膽固醇飼料100g，中藥組(DCH)在AS模型組基礎(chǔ)上另加大柴胡湯20ml(生藥量8.8g)，日一次灌胃，西藥組在AS模型組基礎(chǔ)上另加每日10mg辛伐他汀。動物均為單籠飼養(yǎng)，每日進食量限制為100g，飲水不限。實驗中每日觀察動物進食和行為變化，定期稱體重、抽血，實驗共10周。
1.4 觀察指標(biāo) (1)血液生化指標(biāo):實驗后第5、10周末由兔耳緣靜脈抽血測血清總膽固醇(CHOL)，甘油三酯(TG)，指標(biāo)測定由遼寧中醫(yī)學(xué)院檢驗科全自動生化分析儀完成，實驗后第10周末由兔耳緣靜脈抽血測超氧化物歧化酶(SOD)、磷脂氫谷胱甘肽過氧化物酶(PHGPX)，測定由中國醫(yī)科大學(xué)檢驗科完成。(2)AS面積和斑塊病理觀察:實驗第10周末，空氣栓塞處死家兔，立即取出主動脈，剪取主動脈弓近左頸總動脈分叉處全層動脈組織0.5cm×0.5cm，標(biāo)本用4%多聚甲醛固定，留做石蠟切片原位雜交。另將主動脈縱行剪開，選擇主動脈弓近左頸總動脈分叉AS斑塊處取材經(jīng)石蠟包埋，HE染色，光鏡下測量最大AS斑塊內(nèi)膜厚及中膜厚度。(3)原位雜交:將各組石蠟標(biāo)本切片脫蠟至水，按非放射性地高辛標(biāo)記與檢測試劑盒操作規(guī)程，進行各組病理切片的cDNA-mRNA原位分子雜交。陰性對照為已知本實驗陽性切片，雜交時以預(yù)雜交液切片顯色陰性。原位雜交結(jié)果判斷:陽性信號顯色為棕黃色。
, 百拇醫(yī)藥
1.5 統(tǒng)計學(xué)處理 數(shù)據(jù)以ˉx±s表示，自身前后及兩組間均數(shù)差異均采用t檢驗。
2 結(jié)果
2.1 生化檢測 實驗前各組的血漿總膽固醇無差異，均值為(1.48±0.18)mmol/L。實驗第10周末，對照組的血漿CHOL(1.45±0.20)mmol/L，與實驗前比較差異無顯著性(P>0.05);AS模型組和大柴胡湯(DCH)用藥組的血漿CHOL分別為(31.7±4.81)mmol/L和(15.43±2.20)mmol/L，與實驗前比較顯著增高，DCH用藥組與AS模型組比較，差異有非常顯著性(P<0.01)。AS模型組PHGPX及銅鋅超氧化物歧化酶(Cu-Zn-SOD)分別為(4.96±0.76)U/mgHb和(1.66±0.11)μmol/L NADPH/min·mgHb，DHC組分別為(7.15±0.49)U/mgHb和(1.95±0.07)μmol/L NADPH/min·mgHb，大柴胡湯組與AS組比較差異有非常顯著性(P<0.01)。
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2.2 大體標(biāo)本檢測和病理檢測結(jié)果 正常對照組主動脈內(nèi)膜光滑，未見粥樣硬化斑塊。AS模型組的主動脈內(nèi)膜均有嚴(yán)重的粥樣硬化病變，肉眼呈點、斑、條狀，邊緣清楚，表面無明顯破潰，較嚴(yán)重者斑塊融合成片，密布內(nèi)膜面。大柴胡湯組及辛伐他汀組的主動脈內(nèi)膜散在粥樣斑塊，多集中在主動脈起始部和腸系膜動脈、腎動脈分叉處，光鏡下見正常組血管內(nèi)膜形態(tài)大致正常。高脂模型組血管內(nèi)膜明顯增厚，內(nèi)膜下大量平滑肌細(xì)胞(SMC)增生，內(nèi)有脂質(zhì)沉積，形成泡沫細(xì)胞，內(nèi)膜中有大量巨噬細(xì)胞浸潤。AS組最大內(nèi)膜厚度(0.38±0.04)mm，正常組(0.02±0.01)mm，大柴胡湯組(0.12±0.03)mm，辛伐他汀組(0.08±0.02)mm，大柴胡湯組與AS組比較P<0.01，差異有非常顯著性。見圖1，2(圖略)。
2.3 c-myc原位雜交結(jié)果 AS模型組動物的硬化斑塊中，c-myc m-RNA的陽性表達信號呈棕黃色顆粒，多見于增殖的平滑肌細(xì)胞內(nèi)。大柴胡湯組及辛伐他汀組的主動脈內(nèi)膜斑塊亦可見c-myc mRNA的陽性表達，但強度明顯弱于AS模型組，正常對照組的主動脈組織內(nèi)未見c-myc mRNA陽性表達。見圖3，4，5(圖略)。
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3 討論
3.1 大柴胡湯的抗AS作用 本實驗結(jié)果表明，大柴胡湯具有顯著的抗家兔實驗性AS的作用。主要表現(xiàn)為減少主動脈內(nèi)膜脂質(zhì)斑塊面積及斑塊厚度，其途徑可能為降低血脂及抗脂質(zhì)過氧化。在長期高脂血癥的情況下，增高的脂蛋白中主要是氧化低密度脂蛋白(OX-LDL)和膽固醇對動脈內(nèi)膜產(chǎn)生功能性損傷，主要是通過氧化損傷機制產(chǎn)生的，動脈壁的脂質(zhì)過氧化損傷可導(dǎo)致內(nèi)皮功能失調(diào)，脂質(zhì) 過氧化損傷的內(nèi)皮細(xì)胞可以促進平滑肌細(xì)胞增殖，逐步發(fā)展成動脈硬化。本實驗提示大柴胡湯具有明顯減低血脂作用，其降脂作用比辛伐他汀組略低，但兩組經(jīng)統(tǒng)計學(xué)處理差異無顯著性。具有明顯升高血漿PHGPX和SOD活性，抑制氧自由基，加速氧自由基的清除，及抗氧化作用。
3.2 c-myc基因表達與動脈硬化 癌基因c-myc參與細(xì)胞增殖調(diào)控，是細(xì)胞生長過程中的重要調(diào)節(jié)基因。c-myc的產(chǎn)物是核內(nèi)蛋白質(zhì)，與細(xì)胞從G 0 →G 1 期有關(guān)，參與DNA復(fù)制內(nèi)膜損傷高脂血癥等多種因素可引起血管壁PDGF基因的異常表達，而誘導(dǎo)c-myc等癌基因異常表達，LDL亦可直接促進c-myc基因表達，c-myc基因表達核內(nèi)蛋白質(zhì)，與DNA結(jié)合，調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)其它基因表達，產(chǎn)生和分泌多種生長因子，再通過內(nèi)分泌和旁分泌作用，使細(xì)胞增生更明顯。增生的SMC巨噬細(xì)胞，脂肪攝入量增加后脂質(zhì)代謝障礙，最終形成“泡沫細(xì)胞”。另外，增生的細(xì)胞產(chǎn)生大量細(xì)胞間質(zhì)，最終形成AS斑塊。本試驗結(jié)果也證明，高脂組家兔血管壁c-myc基因表達量增高，而大柴胡湯組c-myc mRNA表達水平與高脂組比較明顯降低。
, 百拇醫(yī)藥
參考文獻
1 Keaney JF，Jr Vita JA.Atherosclerosis，oxidative stress，and antioxidant protection.Progr Cardiovasc Diseas，1995，38:129-148.
2 高巖.內(nèi)皮細(xì)胞脂質(zhì)過氧化損傷對平滑肌細(xì)胞增殖的影響.中華病理學(xué)雜志，1997，26(1):42.
3 湯鍵，周愛儒.原癌基因與心血管病.北京:北京醫(yī)科大學(xué)、中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)聯(lián)合出版社，1990，165.
4 Fantl WJ.Distinct phosphotyrosines on a growth factor receptor bind to specific molecules that mediate different signaling pathways.Cell，1992，69:413.
5 Ross R.The pathogenesis of antherosclerosis:a perspective for1990’s.Nature，1993，362:801.
(編輯 小川), http://www.www.srpcoatings.com(王鳳榮)
Effect of Da Chai Hu decoction(DCHD)on atherogenesis and on c-myc gene expression
Wang Fengrong，Liu Tong，Yang Guanlin
Affiliated Hospital of Liaoning TCM，Shenyang110032.
【Abstract】 Objective To observe the effect of DCHD on the AS forming and expression of c-myc mRNA in aortic wall of the rabbits model with AS.Methods Atherosclerotic rabbit model fed by high cholesterol was established.The effects of DCHD on expression of c-myc mRNA in aortic wall was observed in situ hybridization.Results It was showed that in DCHD treated group the thickness of plaques was reduced significantly and expression of c-myc mRNA was markedly suppressed.Conclusion It suggest that DCHD exert strong antiatherosclerotic effect on exˉperimental rabbit hypolidemic and inhibit gene expression related to AS lesions maycontribute to the mechanisms.
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Key words DaChaiHu decoction atherosclerosis c-mycgene hyperlipemia
大柴胡湯為《傷寒論》名方，具有和解少陽、暢通氣機、內(nèi)瀉熱結(jié)之功，現(xiàn)代藥理研究其具有抗炎、降脂作用，本研究進一步探討其抗動脈粥樣硬化作用及其機制。
1 資料與方法
1.1 藥物及試劑 大柴胡湯由遼寧中醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院制劑室提供，藥物濃度為0.5g/ml，膽固醇購自遼寧化學(xué)試劑公司(荷蘭進口分裝)，辛伐他汀為美國默沙東大藥廠生產(chǎn)。
1.2 主要儀器 OLYMPUS光學(xué)顯微鏡、HZS-H水浴振蕩器(哈爾濱東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)公司生產(chǎn))、AO石蠟切片機(Scientific Instruments生產(chǎn))、貝克曼700型全自動生化分析儀(美國制造)。
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1.3 動物模型建立 雄性健康大耳白兔32只，體重2.0～2.5kg，購自遼寧中醫(yī)學(xué)院實驗動物中心。將實驗兔隨機分為四組，每組8只。正常對照組(C)喂飼基礎(chǔ)飼料，AS模型組(CAS)給予每日1%膽固醇飼料100g，中藥組(DCH)在AS模型組基礎(chǔ)上另加大柴胡湯20ml(生藥量8.8g)，日一次灌胃，西藥組在AS模型組基礎(chǔ)上另加每日10mg辛伐他汀。動物均為單籠飼養(yǎng)，每日進食量限制為100g，飲水不限。實驗中每日觀察動物進食和行為變化，定期稱體重、抽血，實驗共10周。
1.4 觀察指標(biāo) (1)血液生化指標(biāo):實驗后第5、10周末由兔耳緣靜脈抽血測血清總膽固醇(CHOL)，甘油三酯(TG)，指標(biāo)測定由遼寧中醫(yī)學(xué)院檢驗科全自動生化分析儀完成，實驗后第10周末由兔耳緣靜脈抽血測超氧化物歧化酶(SOD)、磷脂氫谷胱甘肽過氧化物酶(PHGPX)，測定由中國醫(yī)科大學(xué)檢驗科完成。(2)AS面積和斑塊病理觀察:實驗第10周末，空氣栓塞處死家兔，立即取出主動脈，剪取主動脈弓近左頸總動脈分叉處全層動脈組織0.5cm×0.5cm，標(biāo)本用4%多聚甲醛固定，留做石蠟切片原位雜交。另將主動脈縱行剪開，選擇主動脈弓近左頸總動脈分叉AS斑塊處取材經(jīng)石蠟包埋，HE染色，光鏡下測量最大AS斑塊內(nèi)膜厚及中膜厚度。(3)原位雜交:將各組石蠟標(biāo)本切片脫蠟至水，按非放射性地高辛標(biāo)記與檢測試劑盒操作規(guī)程，進行各組病理切片的cDNA-mRNA原位分子雜交。陰性對照為已知本實驗陽性切片，雜交時以預(yù)雜交液切片顯色陰性。原位雜交結(jié)果判斷:陽性信號顯色為棕黃色。
, 百拇醫(yī)藥
1.5 統(tǒng)計學(xué)處理 數(shù)據(jù)以ˉx±s表示，自身前后及兩組間均數(shù)差異均采用t檢驗。
2 結(jié)果
2.1 生化檢測 實驗前各組的血漿總膽固醇無差異，均值為(1.48±0.18)mmol/L。實驗第10周末，對照組的血漿CHOL(1.45±0.20)mmol/L，與實驗前比較差異無顯著性(P>0.05);AS模型組和大柴胡湯(DCH)用藥組的血漿CHOL分別為(31.7±4.81)mmol/L和(15.43±2.20)mmol/L，與實驗前比較顯著增高，DCH用藥組與AS模型組比較，差異有非常顯著性(P<0.01)。AS模型組PHGPX及銅鋅超氧化物歧化酶(Cu-Zn-SOD)分別為(4.96±0.76)U/mgHb和(1.66±0.11)μmol/L NADPH/min·mgHb，DHC組分別為(7.15±0.49)U/mgHb和(1.95±0.07)μmol/L NADPH/min·mgHb，大柴胡湯組與AS組比較差異有非常顯著性(P<0.01)。
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2.2 大體標(biāo)本檢測和病理檢測結(jié)果 正常對照組主動脈內(nèi)膜光滑，未見粥樣硬化斑塊。AS模型組的主動脈內(nèi)膜均有嚴(yán)重的粥樣硬化病變，肉眼呈點、斑、條狀，邊緣清楚，表面無明顯破潰，較嚴(yán)重者斑塊融合成片，密布內(nèi)膜面。大柴胡湯組及辛伐他汀組的主動脈內(nèi)膜散在粥樣斑塊，多集中在主動脈起始部和腸系膜動脈、腎動脈分叉處，光鏡下見正常組血管內(nèi)膜形態(tài)大致正常。高脂模型組血管內(nèi)膜明顯增厚，內(nèi)膜下大量平滑肌細(xì)胞(SMC)增生，內(nèi)有脂質(zhì)沉積，形成泡沫細(xì)胞，內(nèi)膜中有大量巨噬細(xì)胞浸潤。AS組最大內(nèi)膜厚度(0.38±0.04)mm，正常組(0.02±0.01)mm，大柴胡湯組(0.12±0.03)mm，辛伐他汀組(0.08±0.02)mm，大柴胡湯組與AS組比較P<0.01，差異有非常顯著性。見圖1，2(圖略)。
2.3 c-myc原位雜交結(jié)果 AS模型組動物的硬化斑塊中，c-myc m-RNA的陽性表達信號呈棕黃色顆粒，多見于增殖的平滑肌細(xì)胞內(nèi)。大柴胡湯組及辛伐他汀組的主動脈內(nèi)膜斑塊亦可見c-myc mRNA的陽性表達，但強度明顯弱于AS模型組，正常對照組的主動脈組織內(nèi)未見c-myc mRNA陽性表達。見圖3，4，5(圖略)。
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3 討論
3.1 大柴胡湯的抗AS作用 本實驗結(jié)果表明，大柴胡湯具有顯著的抗家兔實驗性AS的作用。主要表現(xiàn)為減少主動脈內(nèi)膜脂質(zhì)斑塊面積及斑塊厚度，其途徑可能為降低血脂及抗脂質(zhì)過氧化。在長期高脂血癥的情況下，增高的脂蛋白中主要是氧化低密度脂蛋白(OX-LDL)和膽固醇對動脈內(nèi)膜產(chǎn)生功能性損傷，主要是通過氧化損傷機制產(chǎn)生的，動脈壁的脂質(zhì)過氧化損傷可導(dǎo)致內(nèi)皮功能失調(diào)，脂質(zhì) 過氧化損傷的內(nèi)皮細(xì)胞可以促進平滑肌細(xì)胞增殖，逐步發(fā)展成動脈硬化。本實驗提示大柴胡湯具有明顯減低血脂作用，其降脂作用比辛伐他汀組略低，但兩組經(jīng)統(tǒng)計學(xué)處理差異無顯著性。具有明顯升高血漿PHGPX和SOD活性，抑制氧自由基，加速氧自由基的清除，及抗氧化作用。
3.2 c-myc基因表達與動脈硬化 癌基因c-myc參與細(xì)胞增殖調(diào)控，是細(xì)胞生長過程中的重要調(diào)節(jié)基因。c-myc的產(chǎn)物是核內(nèi)蛋白質(zhì)，與細(xì)胞從G 0 →G 1 期有關(guān)，參與DNA復(fù)制內(nèi)膜損傷高脂血癥等多種因素可引起血管壁PDGF基因的異常表達，而誘導(dǎo)c-myc等癌基因異常表達，LDL亦可直接促進c-myc基因表達，c-myc基因表達核內(nèi)蛋白質(zhì)，與DNA結(jié)合，調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)其它基因表達，產(chǎn)生和分泌多種生長因子，再通過內(nèi)分泌和旁分泌作用，使細(xì)胞增生更明顯。增生的SMC巨噬細(xì)胞，脂肪攝入量增加后脂質(zhì)代謝障礙，最終形成“泡沫細(xì)胞”。另外，增生的細(xì)胞產(chǎn)生大量細(xì)胞間質(zhì)，最終形成AS斑塊。本試驗結(jié)果也證明，高脂組家兔血管壁c-myc基因表達量增高，而大柴胡湯組c-myc mRNA表達水平與高脂組比較明顯降低。
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參考文獻
1 Keaney JF，Jr Vita JA.Atherosclerosis，oxidative stress，and antioxidant protection.Progr Cardiovasc Diseas，1995，38:129-148.
2 高巖.內(nèi)皮細(xì)胞脂質(zhì)過氧化損傷對平滑肌細(xì)胞增殖的影響.中華病理學(xué)雜志，1997，26(1):42.
3 湯鍵，周愛儒.原癌基因與心血管病.北京:北京醫(yī)科大學(xué)、中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)聯(lián)合出版社，1990，165.
4 Fantl WJ.Distinct phosphotyrosines on a growth factor receptor bind to specific molecules that mediate different signaling pathways.Cell，1992，69:413.
5 Ross R.The pathogenesis of antherosclerosis:a perspective for1990’s.Nature，1993，362:801.
(編輯 小川), http://www.www.srpcoatings.com(王鳳榮)
百拇醫(yī)藥網(wǎng) http://www.www.srpcoatings.com/html/Dir/2004/05/10/39/64/09.htm