樹突狀細胞的制備及其輔佐功能的實驗研究
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中華醫(yī)學(xué)研究雜志 2003年2月 第3卷 第2期
【摘要】 目的 探討應(yīng)用外周血體外擴增樹突狀細胞(DC)的方法及DC的輔佐功能。方法 分離人外周血單核細胞,應(yīng)用GM-CSF,IL-4及TNF-α培養(yǎng)觀察,并應(yīng)用MTT法檢測DCs在同種混合淋巴細胞反應(yīng)(MLR)中激發(fā)同種T淋巴細胞增殖的能力。結(jié)果 經(jīng)體外誘導(dǎo)擴增,可將外周血單核細胞定向誘導(dǎo)大量的具有典型DC形態(tài)的樹突狀細胞;旌狭馨图毎磻(yīng)結(jié)果提示,只需少量DC,即可強烈激發(fā)同種T淋巴細胞增殖。結(jié)論 (1)用GM-CSF、IL-4及TNF-α能從人外周血誘導(dǎo)、擴增出DC;(2)DC具有高效的刺激靜止T淋巴細胞活化增殖的能力。
關(guān)鍵詞 樹突狀細胞 混合淋巴細胞反應(yīng) 粒細胞-巨細胞集落刺激因子 白細胞介素-4 腫瘤壞死因子α
【文獻標(biāo)識碼】 A 【文章編號】 1680-6115(2003)02-0099-02
Study on the preparation of dendritic cells(DC)and its assisted function of stimulating T lymphocyte
, 百拇醫(yī)藥
Xu Fu,Sun Jingli,Wang Xiliang,et al.
202th Hospital of PLA,Shenyang110003.
【Abstract】 Objective To investigate the method of preparation of dendritc cells(DCs)from peripheral blood mononuclear cells and the assisted function of DCs in mixed lymphocyte reaction(MLR).Methods Mononuclear cells were isolated from peripheral blood and were used to culture with cytokines including GM-CSF,IL-4and TNF-α.Harvested cells were detected for observation analysis by microscope.The proliferation ability of allogeneic T cells stimulated by DCs were observed by MTT method.Results Differentiation DCs from peripheral blood mononuclear cells have a typical morphology.In the MLR only a little number of dendritic cells can stimulate the proliferation of alˉlogeneic T cells efficiently.ConclutionDCs can be preparated from peripherad blood mononulcear cells by GM-CSF,IL-4and TNF-α,the DCs are potent stimulating function in MLR.
, 百拇醫(yī)藥
Key words dendritic cell mixed lymphocyte reaction monocyte granulocyte-macrophage colony stimulating factor interleukin-4 tumor necrosis factor-α
樹突狀細胞(DC)是體內(nèi)最強的抗原遞呈細胞,研究發(fā)現(xiàn),DC在腫瘤免疫、抗感染免疫、移植免疫及自身免疫性疾病中發(fā)揮重要作用,正常人外周血中DC數(shù)量極少,這給DC的研究和應(yīng)用帶來極大困難。本實驗探討了應(yīng)用人外周血單核細胞體外培養(yǎng)誘導(dǎo)擴增DC的方法及DC對淋巴細胞的刺激增殖作用。
1 材料和方法
1.1 材料 rhGM-CSF,北京醫(yī)科大學(xué)免疫室;rhIL-4和TNF-α,PeproTech EC Ltd;MTT,Sigma公司;RPMI1640GIBˉCO公司;淋巴細胞分離液為Pharmacia產(chǎn)品;絲裂霉素日本產(chǎn);胎牛血清(杭州四季青生物工程材料研究所);LC400型酶聯(lián)免疫檢測儀(法國產(chǎn))。
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1.2 方法
1.2.1 DC的體外培養(yǎng) 采用朱學(xué)軍等 [1] 報道的方法加以改進。常規(guī)分離健康志愿者外周血單核細胞,取抗凝外周血,緩慢加入淋巴細胞分離液上層,離心2000r/min,25min,取中間層用Hanks液洗3遍,細胞計數(shù),用含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液調(diào)至細胞濃度為1×10 6 /ml,加入24孔板,每孔1ml,5%CO 2 、37℃孵箱培養(yǎng)3h,吸棄上清及懸浮細胞,貼壁的單核細胞,加入細胞培養(yǎng)液,同時加入rhIL-4(400U/ml),rhGM-CSF,設(shè)不同濃度組:100ng/ml、200ng/ml、 400ng/ml,培養(yǎng)1周時半量換液,同時補充上述細胞因子,定期觀察細胞生長情況,培養(yǎng)至10天加入TNF-α,繼續(xù)培養(yǎng),觀察第21天時細胞數(shù)量達到最多,培養(yǎng)至28天,收獲不同時期細胞14天、21天及28天,分別觀察細胞形態(tài),同時進行混合淋巴細胞反應(yīng)。
1.2.2 同種混合淋巴細胞反應(yīng)(MLR) 分離其他正常人外周血單個核細胞,同上方法培養(yǎng)3h,取上清及懸浮細胞,調(diào)至細胞數(shù)為10 6 /ml,以每孔1×10 5 細胞種于圓底96孔板中,DC先用絲裂霉素25μl/ml處理45min,Hanks洗4遍,用RPMI1640調(diào)至細胞濃度10 5 /ml,分成不同組,2×10 3 /孔、5×10 3 /孔、1×10 4 /孔加入效應(yīng)細胞孔中,效靶比(DC:淋巴細胞)分別為10:1、20:1、50:1,陰性孔不加DC,每組設(shè)3個復(fù)孔,培養(yǎng)96h,加入MTT20μl(5mg/ml),培養(yǎng)4h,吸去上清加入150μl二甲亞砜(DMSO),振蕩5min,使結(jié)晶充分溶解,用酶聯(lián)免疫檢測儀于570nm處,測OD值并記錄結(jié)果,結(jié)果用3孔均值表示。
, 百拇醫(yī)藥
2 結(jié)果
2.1 DC生長觀察 分離外周血單核細胞經(jīng)GM-CSF和IL-4培養(yǎng)擴增,培養(yǎng)3天開始分裂增殖,開始出現(xiàn)少量體積大的細胞,細胞膜不規(guī)則,隨著培養(yǎng)時間延長,數(shù)量越來越多,體積逐漸增大,形態(tài)不規(guī)則,并開始脫壁生長,第10天加入TNF-α后細胞進入對數(shù)增殖期,形成大量細胞集落,胞核呈不規(guī)則形態(tài),表面有突起,集落中細胞體積逐漸增大,細胞體積可達淋巴細胞的數(shù)倍,培養(yǎng)到14天時大部分細胞脫壁,細胞形態(tài)與成熟DC基本相同(圖1、圖2,見封三)。21天以后細胞增殖迅速減慢,絕大部分為懸浮細胞,并開始出現(xiàn)細胞壞死溶解,所設(shè)不同組之間,細胞形態(tài)及數(shù)量差別不大,即GM-CSF在100、200、400ng/ml不同濃度之間形成DC的數(shù)量無明顯差別。
2.2 同種混合淋巴細胞反應(yīng) 混合淋巴細胞反應(yīng)所測OD值結(jié)果見表1。表1 不同濃度DC在MLR中的刺激作用的比較注:經(jīng)t檢驗, ˇ P<0.05; ˇˇ P<0.01結(jié)果提示:少量DC即可強烈激發(fā)T淋巴細胞的增殖,DC組與對照組比較,OD值均有顯著差異,并隨著DC濃度增加而刺激作用逐漸增強,即DC濃度與其刺激淋巴細胞增殖功能成正比。
, 百拇醫(yī)藥
3 討論
DC是目前已知功能最強的專職抗原提呈細胞,并能在體內(nèi)激活靜止T淋巴細胞,從而激發(fā)初次免疫反應(yīng)。有研究證明,在腫瘤患者體內(nèi)存在腫瘤細胞逃避DC抗原提呈的機制。
近幾年研究認為DC在腫瘤的發(fā)生及發(fā)展過程中起著重要的作用,腫瘤病人外周血DC功能減退[2] ,腫瘤病灶局部的DC數(shù)量及功能與腫瘤的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移有關(guān) [3] 。DC在體外擴增成功,為下一步DC在臨床的應(yīng)用打下良好的基礎(chǔ),其體外獲得DC的方法有很多,實驗表明,可通過骨 髓、脾、外周血及臍帶血等分離培養(yǎng)獲取DC。但應(yīng)用于臨床治療要求簡便易行,對病人損傷小,病人又容易接受的方法,通過外周血體外培養(yǎng)獲取DC的方法具有上述特點,并且可在體外擴增達到臨床所需要的數(shù)量級,因此,這種方法對于DC臨床應(yīng)用具有非常重要的意義。本實驗結(jié)果提示,IL-4和GM-CSF用量在達到一定量后,增加濃度并不能使DC數(shù)量進一步增加。在DC培養(yǎng)過程中,一般在14~21天時數(shù)量迅速增加,分化成熟,具有典型的DC形態(tài)。因此我們認為在此期間收獲的DC數(shù)量及功能為最佳。DC具有刺激淋巴細胞增殖的特性,少量DC即可刺激淋巴細胞增殖,表1提示加入DC組的OD值均明顯高于對照組,提示DC具有明確的刺激淋巴細胞增殖的功能,并隨著DC濃度增加而其刺激作用逐漸增大。
, http://www.www.srpcoatings.com
DC在腫瘤治療中的作用現(xiàn)已逐漸引起人們的重視,應(yīng)用DC相關(guān)的腫瘤疫苗,在動物實驗中已被證實有效,有些方案已用于臨床,取得了一定的療效 [4] ,但還存在DC疫苗特異性不高,持久性差等問題有待于進一步深入研究。
參考文獻
1 朱學(xué)軍,曹雪濤,于益芝,等.人外周血樹突狀細胞的體外擴增及鑒定.中國腫瘤生物治療雜志,1997,4(4):302-306.
2 Gabrilovich DI,Corak J,Ciernik IF,et al.Decreased antigen presentaˉtion by dendritic cells in patients with breast cancer.Clin Cancer Res,1997,13(3),483-490.
3 Maehara Y,Tomisaki S,Oda S,et al.Lymph node metastasis and relaˉtion to tumor growth potential and local immune response in advanced gastric cancer.Int J Cancer,1997,74(2):224-228.
4 Lodge PA,Jones LA,Bader RA,et al.Dendritic cell-based imˉmunotherapy of prostate cancer:immune monitoring of aphaseⅡcliniˉcal trial.Cancer Res,2000,60(4):829-833.
(收稿日期:2002-10-13)
作者單位:110003沈陽解放軍第202醫(yī)院
(編輯何 蓓), http://www.www.srpcoatings.com(徐)
關(guān)鍵詞 樹突狀細胞 混合淋巴細胞反應(yīng) 粒細胞-巨細胞集落刺激因子 白細胞介素-4 腫瘤壞死因子α
【文獻標(biāo)識碼】 A 【文章編號】 1680-6115(2003)02-0099-02
Study on the preparation of dendritic cells(DC)and its assisted function of stimulating T lymphocyte
, 百拇醫(yī)藥
Xu Fu,Sun Jingli,Wang Xiliang,et al.
202th Hospital of PLA,Shenyang110003.
【Abstract】 Objective To investigate the method of preparation of dendritc cells(DCs)from peripheral blood mononuclear cells and the assisted function of DCs in mixed lymphocyte reaction(MLR).Methods Mononuclear cells were isolated from peripheral blood and were used to culture with cytokines including GM-CSF,IL-4and TNF-α.Harvested cells were detected for observation analysis by microscope.The proliferation ability of allogeneic T cells stimulated by DCs were observed by MTT method.Results Differentiation DCs from peripheral blood mononuclear cells have a typical morphology.In the MLR only a little number of dendritic cells can stimulate the proliferation of alˉlogeneic T cells efficiently.ConclutionDCs can be preparated from peripherad blood mononulcear cells by GM-CSF,IL-4and TNF-α,the DCs are potent stimulating function in MLR.
, 百拇醫(yī)藥
Key words dendritic cell mixed lymphocyte reaction monocyte granulocyte-macrophage colony stimulating factor interleukin-4 tumor necrosis factor-α
樹突狀細胞(DC)是體內(nèi)最強的抗原遞呈細胞,研究發(fā)現(xiàn),DC在腫瘤免疫、抗感染免疫、移植免疫及自身免疫性疾病中發(fā)揮重要作用,正常人外周血中DC數(shù)量極少,這給DC的研究和應(yīng)用帶來極大困難。本實驗探討了應(yīng)用人外周血單核細胞體外培養(yǎng)誘導(dǎo)擴增DC的方法及DC對淋巴細胞的刺激增殖作用。
1 材料和方法
1.1 材料 rhGM-CSF,北京醫(yī)科大學(xué)免疫室;rhIL-4和TNF-α,PeproTech EC Ltd;MTT,Sigma公司;RPMI1640GIBˉCO公司;淋巴細胞分離液為Pharmacia產(chǎn)品;絲裂霉素日本產(chǎn);胎牛血清(杭州四季青生物工程材料研究所);LC400型酶聯(lián)免疫檢測儀(法國產(chǎn))。
, http://www.www.srpcoatings.com
1.2 方法
1.2.1 DC的體外培養(yǎng) 采用朱學(xué)軍等 [1] 報道的方法加以改進。常規(guī)分離健康志愿者外周血單核細胞,取抗凝外周血,緩慢加入淋巴細胞分離液上層,離心2000r/min,25min,取中間層用Hanks液洗3遍,細胞計數(shù),用含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液調(diào)至細胞濃度為1×10 6 /ml,加入24孔板,每孔1ml,5%CO 2 、37℃孵箱培養(yǎng)3h,吸棄上清及懸浮細胞,貼壁的單核細胞,加入細胞培養(yǎng)液,同時加入rhIL-4(400U/ml),rhGM-CSF,設(shè)不同濃度組:100ng/ml、200ng/ml、 400ng/ml,培養(yǎng)1周時半量換液,同時補充上述細胞因子,定期觀察細胞生長情況,培養(yǎng)至10天加入TNF-α,繼續(xù)培養(yǎng),觀察第21天時細胞數(shù)量達到最多,培養(yǎng)至28天,收獲不同時期細胞14天、21天及28天,分別觀察細胞形態(tài),同時進行混合淋巴細胞反應(yīng)。
1.2.2 同種混合淋巴細胞反應(yīng)(MLR) 分離其他正常人外周血單個核細胞,同上方法培養(yǎng)3h,取上清及懸浮細胞,調(diào)至細胞數(shù)為10 6 /ml,以每孔1×10 5 細胞種于圓底96孔板中,DC先用絲裂霉素25μl/ml處理45min,Hanks洗4遍,用RPMI1640調(diào)至細胞濃度10 5 /ml,分成不同組,2×10 3 /孔、5×10 3 /孔、1×10 4 /孔加入效應(yīng)細胞孔中,效靶比(DC:淋巴細胞)分別為10:1、20:1、50:1,陰性孔不加DC,每組設(shè)3個復(fù)孔,培養(yǎng)96h,加入MTT20μl(5mg/ml),培養(yǎng)4h,吸去上清加入150μl二甲亞砜(DMSO),振蕩5min,使結(jié)晶充分溶解,用酶聯(lián)免疫檢測儀于570nm處,測OD值并記錄結(jié)果,結(jié)果用3孔均值表示。
, 百拇醫(yī)藥
2 結(jié)果
2.1 DC生長觀察 分離外周血單核細胞經(jīng)GM-CSF和IL-4培養(yǎng)擴增,培養(yǎng)3天開始分裂增殖,開始出現(xiàn)少量體積大的細胞,細胞膜不規(guī)則,隨著培養(yǎng)時間延長,數(shù)量越來越多,體積逐漸增大,形態(tài)不規(guī)則,并開始脫壁生長,第10天加入TNF-α后細胞進入對數(shù)增殖期,形成大量細胞集落,胞核呈不規(guī)則形態(tài),表面有突起,集落中細胞體積逐漸增大,細胞體積可達淋巴細胞的數(shù)倍,培養(yǎng)到14天時大部分細胞脫壁,細胞形態(tài)與成熟DC基本相同(圖1、圖2,見封三)。21天以后細胞增殖迅速減慢,絕大部分為懸浮細胞,并開始出現(xiàn)細胞壞死溶解,所設(shè)不同組之間,細胞形態(tài)及數(shù)量差別不大,即GM-CSF在100、200、400ng/ml不同濃度之間形成DC的數(shù)量無明顯差別。
2.2 同種混合淋巴細胞反應(yīng) 混合淋巴細胞反應(yīng)所測OD值結(jié)果見表1。表1 不同濃度DC在MLR中的刺激作用的比較注:經(jīng)t檢驗, ˇ P<0.05; ˇˇ P<0.01結(jié)果提示:少量DC即可強烈激發(fā)T淋巴細胞的增殖,DC組與對照組比較,OD值均有顯著差異,并隨著DC濃度增加而刺激作用逐漸增強,即DC濃度與其刺激淋巴細胞增殖功能成正比。
, 百拇醫(yī)藥
3 討論
DC是目前已知功能最強的專職抗原提呈細胞,并能在體內(nèi)激活靜止T淋巴細胞,從而激發(fā)初次免疫反應(yīng)。有研究證明,在腫瘤患者體內(nèi)存在腫瘤細胞逃避DC抗原提呈的機制。
近幾年研究認為DC在腫瘤的發(fā)生及發(fā)展過程中起著重要的作用,腫瘤病人外周血DC功能減退[2] ,腫瘤病灶局部的DC數(shù)量及功能與腫瘤的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移有關(guān) [3] 。DC在體外擴增成功,為下一步DC在臨床的應(yīng)用打下良好的基礎(chǔ),其體外獲得DC的方法有很多,實驗表明,可通過骨 髓、脾、外周血及臍帶血等分離培養(yǎng)獲取DC。但應(yīng)用于臨床治療要求簡便易行,對病人損傷小,病人又容易接受的方法,通過外周血體外培養(yǎng)獲取DC的方法具有上述特點,并且可在體外擴增達到臨床所需要的數(shù)量級,因此,這種方法對于DC臨床應(yīng)用具有非常重要的意義。本實驗結(jié)果提示,IL-4和GM-CSF用量在達到一定量后,增加濃度并不能使DC數(shù)量進一步增加。在DC培養(yǎng)過程中,一般在14~21天時數(shù)量迅速增加,分化成熟,具有典型的DC形態(tài)。因此我們認為在此期間收獲的DC數(shù)量及功能為最佳。DC具有刺激淋巴細胞增殖的特性,少量DC即可刺激淋巴細胞增殖,表1提示加入DC組的OD值均明顯高于對照組,提示DC具有明確的刺激淋巴細胞增殖的功能,并隨著DC濃度增加而其刺激作用逐漸增大。
, http://www.www.srpcoatings.com
DC在腫瘤治療中的作用現(xiàn)已逐漸引起人們的重視,應(yīng)用DC相關(guān)的腫瘤疫苗,在動物實驗中已被證實有效,有些方案已用于臨床,取得了一定的療效 [4] ,但還存在DC疫苗特異性不高,持久性差等問題有待于進一步深入研究。
參考文獻
1 朱學(xué)軍,曹雪濤,于益芝,等.人外周血樹突狀細胞的體外擴增及鑒定.中國腫瘤生物治療雜志,1997,4(4):302-306.
2 Gabrilovich DI,Corak J,Ciernik IF,et al.Decreased antigen presentaˉtion by dendritic cells in patients with breast cancer.Clin Cancer Res,1997,13(3),483-490.
3 Maehara Y,Tomisaki S,Oda S,et al.Lymph node metastasis and relaˉtion to tumor growth potential and local immune response in advanced gastric cancer.Int J Cancer,1997,74(2):224-228.
4 Lodge PA,Jones LA,Bader RA,et al.Dendritic cell-based imˉmunotherapy of prostate cancer:immune monitoring of aphaseⅡcliniˉcal trial.Cancer Res,2000,60(4):829-833.
(收稿日期:2002-10-13)
作者單位:110003沈陽解放軍第202醫(yī)院
(編輯何 蓓), http://www.www.srpcoatings.com(徐)
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