腺病毒載體疫苗免疫途徑的研究(基金項目)
http://www.www.srpcoatings.com
基金項目:山東省科技發(fā)展計劃項目(編號:013130104)
【摘要】 目的 研究腺病毒(Adenovirus,Ad)載體乙型肝炎病毒(Hapatitis B virus,HBV)疫苗免疫途徑與小鼠產(chǎn)生抗體水平的關(guān)系。方法 將BALB/C小鼠(SPF)分為5組,每組10只,分別于鼻腔、皮下接種Ad HBV重組疫苗,用ELISA方法在免疫動物后35d、72d檢測動脈血清抗體,與注射常規(guī)鋁佐劑肽苗組和陰性對照組比較,探討重組苗免疫途徑與小鼠產(chǎn)生抗體水平的關(guān)系。結(jié)果 皮下注射Ad HBV組在35d、72d均不能測到抗體;鼻腔接種Ad HBV苗組在35d不能測到抗體,72d后在動物血清中測到抗體(終末效價為1/7040),與注射鋁佐劑苗(1/8420)相當。結(jié)論 鼻腔接種Ad HBV重組苗比注射有效。
關(guān)鍵詞 腺病毒 載體 乙型肝炎/疫苗 動物/小鼠
【文獻標識碼】 A 【文章編號】 1680-6115(2004)05-0392-02
, http://www.www.srpcoatings.com
The research on inoculative approach
with adenovirus vector vaccines in mice
Li Yan,Yue Yingying,Zhang Fengli,et al.
Department of Microbiology,Institute of Basic
Medicine,Shandong Academy ofMedical Science,Jinan250062.
【Abstract】 Objective To investigate the relationship of inoculative approach and the level of specific antiˉbody induced by adenovirus(Ad)vector HBV vaccines in mice.Methods The mice were divided into5groups,each group had10mice.The Ad HBV vaccines were inoculated by nasal,subcutaneous tissue in every group respectively.The specific antibody was tested by ELISA in35d,72d and compared with the group injected with aluminium-adjuˉvanted vaccines,and discussed the relationship of inoculative approach and the level ofspecific antibody induced by Ad vector HBV vaccines.Results After35d,the specific antibody could not be detected in those mice inocultated Ad HBV vaccines.Butafter72d,the same titer of antibody can be detected in mice inoculated by nasal with the Ad HBV vaccines and inoculated with aluminium-adjuvanted vaccines.Conclusion Inoculating Ad HBV vaccines by nasal is more effective than by subcutaneous tissue.
, 百拇醫(yī)藥
Key words adenovirus vector HBV vaccine mice
Ad載體疫苗是近年來研究的熱點,但怎樣才能獲得水平高、持續(xù)時間長的抗體是制約其進入臨床應(yīng)用的重要因素之一。本研究將Ad HBV重組苗接種于BALB/C小鼠,研究了不同途徑的免疫效果,探討了刺激機體產(chǎn)生抗體與接種途徑的關(guān)系。
1 材料與方法
1.1 動物 BALB/C小鼠(SPF)50只,雌性,18~20g。引自上海動物中心,動物合格證號:2002-0010。無菌環(huán)境空運,SPF飼養(yǎng)環(huán)境飼養(yǎng)。
1.2 動物分組 將上述動物隨機分為5組,每組10只,分別為Ad HBV重組疫苗(本室參照說明書用clontech公司試劑盒構(gòu)建,含HBV pres2-s片段)、試驗組(包括鼻腔、皮下途徑組)、陽性對照組(皮下注射常規(guī)鋁佐劑疫苗,購自山東省免疫控制中心,深圳康泰公司產(chǎn)品,批號:20021052-2)、陰性對照組(生理鹽水鼻腔接種對照、生理鹽水皮下注射對照)。
, 百拇醫(yī)藥
1.3 動物免疫劑量和時間 Ad HBV重組苗鼻腔接種劑量為7.5×10 -7 (PFU);注射劑量為成人用量的5倍。在0d、14d、28d、65d時接種動物,在35d、72d眼動脈叢取血,10000r/min離心分離血清用于測定小鼠抗體。
1.4 動物抗體檢測(ELISA法) 將小鼠血清做1∶50、1∶ 100、1∶200、1∶400、1∶800、1∶1600、1∶3200、1∶6400、1∶12800、1∶25600系列稀釋,依次加入(100μl)包被有HBV S抗原(基因工程產(chǎn)品,購自中國預(yù)防醫(yī)學(xué)科學(xué)院病毒所肝炎研究室,10ng/孔)、山羊血清封閉的聚乙烯多孔板中,37℃1h,然后加HRP-羊抗鼠IgG(sigma試劑,工作稀釋度為10 -4 )。37℃孵育1h后用磷酸鹽緩沖液洗板,加OPD顯色系統(tǒng)顯色,在492nm酶標儀測定OD值。
2 結(jié)果
見表1,圖1。Ad HBV重組苗鼻腔接種動物35d未能測到抗體,重復(fù)免疫后在72d測到抗體,效價高達1/7040,與商業(yè)疫苗組比較P>0.05,差異無顯著性;皮下注射重組疫苗組和陰性對照組動物35d、72d所取血清在1/200均未測到抗體。 圖1 與皮下注射途徑比較, HBV重組疫苗鼻腔接種效果顯著
, 百拇醫(yī)藥
表1 重組疫苗鼻腔、皮下接種小鼠72d抗體水平
注: ˇ 重組疫苗組與商業(yè)疫苗組比較P>0.05
3 討論
腺病毒載體重組疫苗是近年研究熱點之一,如何獲得水平高、持續(xù)時間長的抗體則是其能否走向臨床的關(guān)鍵,比如,He [1] 等將B7-1共刺激分子與表面抗原一起表達,Lindley [2] 將IL-2、6等與目的蛋白共表達;Chengalvala [3] 等克隆增加了T細胞反應(yīng)表位,力圖提高重組苗的免疫效果。國內(nèi)周智等 [4] 將B7與S基因片段共表達在免疫后10d檢測了動物血清抗體,后與常規(guī)鋁佐劑疫苗聯(lián)合應(yīng)用提高了免疫效果。本文將Ad HBV重組疫苗以不同免疫途徑接種小鼠,在不同時間檢測了動物血清抗體,結(jié)果發(fā)現(xiàn)皮下注射途徑者在35d、72d均未能測到血清(1:200稀釋)抗體,而鼻腔接種者抗體終末效價高達1/7040,與注射商業(yè)鋁佐劑疫苗終末效價(1/8420)比較,差異無顯著性(P>0.05),表明Ad HBV重組疫苗適合鼻腔接種,延長免疫周期可彌補鼻腔接種重組疫苗的免疫效果。有關(guān)腺病毒載體重組疫苗口服和其他接種途徑的免疫效果已經(jīng)有人做了比較研究,Natuk等 [5] 通過狗和大猩猩比 較研究,得出了口服免疫效果不如鼻腔粘膜接種效果好的實驗結(jié)論;何金生、王建偉 [6] 等報道RV Ad G1VP7重組疫苗鼻腔接種誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生抗體的終末效價高達10 -5 ,明顯高于腸道接種途徑的結(jié)果,與本實驗結(jié)論相符?梢,Ad重組疫苗的鼻腔免疫效果是確切可信的。
, 百拇醫(yī)藥
總之,本文通過比較Ad HBV重組疫苗鼻腔與皮下兩種免疫途徑的結(jié)果,得到了鼻腔接種可以誘導(dǎo)高效免疫效果的結(jié)論,為該疫苗的推廣應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。
參考文獻
1 He X S,Chen H S,Chu K,et al.Costimulatory protein B7-1enhances the cytotoxic T cell response and antibody response to hepatitis B surface antigen.ProcNatl Acad Sci USA,1996,93(14):7274-7278.
2 Lindley T,Virk KP.Ronchetti Blume M,et al.Construction and characˉterization of adenovirus co-expressing hepatitis B virus surface antigen and interleukin-6.Gene,1994,138(1-2):165-170.
, 百拇醫(yī)藥
3 Chengalvala MV,Bhat R A,Bhat B M,et al.Enhanced immunogenicity of hepatitis B surface antigen by insertion of a helper T cell epitope from tetanus toxoid.Vaccine,1999,17(9-10):1035-1041.
4 Zhou Z,Zhang D,Ren H.Construction of the recombinant retrovirus vector of HBV-S gene and it’s expression in eukaryotic cells.Zhonghua Gan Zang Bing Za Zhi,2000,8(5):296-298.
5 Natuk RJ,Davis AR,Chanda PK,et al.Adenovirus vectored vaccines.Dev BiolStand,1994,82:71-77.
6 何金生,王健偉,姜秀麗,等.復(fù)制缺陷型重組腺病毒rv Ad G1VP7免疫學(xué)效果的研究.安徽醫(yī)科大學(xué)學(xué)報,2002,37(2):86-88.
作者單位:250062山東濟南山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所
(收稿日期:2004-01-03)
(編輯劉 靜), 百拇醫(yī)藥
【摘要】 目的 研究腺病毒(Adenovirus,Ad)載體乙型肝炎病毒(Hapatitis B virus,HBV)疫苗免疫途徑與小鼠產(chǎn)生抗體水平的關(guān)系。方法 將BALB/C小鼠(SPF)分為5組,每組10只,分別于鼻腔、皮下接種Ad HBV重組疫苗,用ELISA方法在免疫動物后35d、72d檢測動脈血清抗體,與注射常規(guī)鋁佐劑肽苗組和陰性對照組比較,探討重組苗免疫途徑與小鼠產(chǎn)生抗體水平的關(guān)系。結(jié)果 皮下注射Ad HBV組在35d、72d均不能測到抗體;鼻腔接種Ad HBV苗組在35d不能測到抗體,72d后在動物血清中測到抗體(終末效價為1/7040),與注射鋁佐劑苗(1/8420)相當。結(jié)論 鼻腔接種Ad HBV重組苗比注射有效。
關(guān)鍵詞 腺病毒 載體 乙型肝炎/疫苗 動物/小鼠
【文獻標識碼】 A 【文章編號】 1680-6115(2004)05-0392-02
, http://www.www.srpcoatings.com
The research on inoculative approach
with adenovirus vector vaccines in mice
Li Yan,Yue Yingying,Zhang Fengli,et al.
Department of Microbiology,Institute of Basic
Medicine,Shandong Academy ofMedical Science,Jinan250062.
【Abstract】 Objective To investigate the relationship of inoculative approach and the level of specific antiˉbody induced by adenovirus(Ad)vector HBV vaccines in mice.Methods The mice were divided into5groups,each group had10mice.The Ad HBV vaccines were inoculated by nasal,subcutaneous tissue in every group respectively.The specific antibody was tested by ELISA in35d,72d and compared with the group injected with aluminium-adjuˉvanted vaccines,and discussed the relationship of inoculative approach and the level ofspecific antibody induced by Ad vector HBV vaccines.Results After35d,the specific antibody could not be detected in those mice inocultated Ad HBV vaccines.Butafter72d,the same titer of antibody can be detected in mice inoculated by nasal with the Ad HBV vaccines and inoculated with aluminium-adjuvanted vaccines.Conclusion Inoculating Ad HBV vaccines by nasal is more effective than by subcutaneous tissue.
, 百拇醫(yī)藥
Key words adenovirus vector HBV vaccine mice
Ad載體疫苗是近年來研究的熱點,但怎樣才能獲得水平高、持續(xù)時間長的抗體是制約其進入臨床應(yīng)用的重要因素之一。本研究將Ad HBV重組苗接種于BALB/C小鼠,研究了不同途徑的免疫效果,探討了刺激機體產(chǎn)生抗體與接種途徑的關(guān)系。
1 材料與方法
1.1 動物 BALB/C小鼠(SPF)50只,雌性,18~20g。引自上海動物中心,動物合格證號:2002-0010。無菌環(huán)境空運,SPF飼養(yǎng)環(huán)境飼養(yǎng)。
1.2 動物分組 將上述動物隨機分為5組,每組10只,分別為Ad HBV重組疫苗(本室參照說明書用clontech公司試劑盒構(gòu)建,含HBV pres2-s片段)、試驗組(包括鼻腔、皮下途徑組)、陽性對照組(皮下注射常規(guī)鋁佐劑疫苗,購自山東省免疫控制中心,深圳康泰公司產(chǎn)品,批號:20021052-2)、陰性對照組(生理鹽水鼻腔接種對照、生理鹽水皮下注射對照)。
, 百拇醫(yī)藥
1.3 動物免疫劑量和時間 Ad HBV重組苗鼻腔接種劑量為7.5×10 -7 (PFU);注射劑量為成人用量的5倍。在0d、14d、28d、65d時接種動物,在35d、72d眼動脈叢取血,10000r/min離心分離血清用于測定小鼠抗體。
1.4 動物抗體檢測(ELISA法) 將小鼠血清做1∶50、1∶ 100、1∶200、1∶400、1∶800、1∶1600、1∶3200、1∶6400、1∶12800、1∶25600系列稀釋,依次加入(100μl)包被有HBV S抗原(基因工程產(chǎn)品,購自中國預(yù)防醫(yī)學(xué)科學(xué)院病毒所肝炎研究室,10ng/孔)、山羊血清封閉的聚乙烯多孔板中,37℃1h,然后加HRP-羊抗鼠IgG(sigma試劑,工作稀釋度為10 -4 )。37℃孵育1h后用磷酸鹽緩沖液洗板,加OPD顯色系統(tǒng)顯色,在492nm酶標儀測定OD值。
2 結(jié)果
見表1,圖1。Ad HBV重組苗鼻腔接種動物35d未能測到抗體,重復(fù)免疫后在72d測到抗體,效價高達1/7040,與商業(yè)疫苗組比較P>0.05,差異無顯著性;皮下注射重組疫苗組和陰性對照組動物35d、72d所取血清在1/200均未測到抗體。 圖1 與皮下注射途徑比較, HBV重組疫苗鼻腔接種效果顯著
, 百拇醫(yī)藥
表1 重組疫苗鼻腔、皮下接種小鼠72d抗體水平
注: ˇ 重組疫苗組與商業(yè)疫苗組比較P>0.05
3 討論
腺病毒載體重組疫苗是近年研究熱點之一,如何獲得水平高、持續(xù)時間長的抗體則是其能否走向臨床的關(guān)鍵,比如,He [1] 等將B7-1共刺激分子與表面抗原一起表達,Lindley [2] 將IL-2、6等與目的蛋白共表達;Chengalvala [3] 等克隆增加了T細胞反應(yīng)表位,力圖提高重組苗的免疫效果。國內(nèi)周智等 [4] 將B7與S基因片段共表達在免疫后10d檢測了動物血清抗體,后與常規(guī)鋁佐劑疫苗聯(lián)合應(yīng)用提高了免疫效果。本文將Ad HBV重組疫苗以不同免疫途徑接種小鼠,在不同時間檢測了動物血清抗體,結(jié)果發(fā)現(xiàn)皮下注射途徑者在35d、72d均未能測到血清(1:200稀釋)抗體,而鼻腔接種者抗體終末效價高達1/7040,與注射商業(yè)鋁佐劑疫苗終末效價(1/8420)比較,差異無顯著性(P>0.05),表明Ad HBV重組疫苗適合鼻腔接種,延長免疫周期可彌補鼻腔接種重組疫苗的免疫效果。有關(guān)腺病毒載體重組疫苗口服和其他接種途徑的免疫效果已經(jīng)有人做了比較研究,Natuk等 [5] 通過狗和大猩猩比 較研究,得出了口服免疫效果不如鼻腔粘膜接種效果好的實驗結(jié)論;何金生、王建偉 [6] 等報道RV Ad G1VP7重組疫苗鼻腔接種誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生抗體的終末效價高達10 -5 ,明顯高于腸道接種途徑的結(jié)果,與本實驗結(jié)論相符?梢,Ad重組疫苗的鼻腔免疫效果是確切可信的。
, 百拇醫(yī)藥
總之,本文通過比較Ad HBV重組疫苗鼻腔與皮下兩種免疫途徑的結(jié)果,得到了鼻腔接種可以誘導(dǎo)高效免疫效果的結(jié)論,為該疫苗的推廣應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。
參考文獻
1 He X S,Chen H S,Chu K,et al.Costimulatory protein B7-1enhances the cytotoxic T cell response and antibody response to hepatitis B surface antigen.ProcNatl Acad Sci USA,1996,93(14):7274-7278.
2 Lindley T,Virk KP.Ronchetti Blume M,et al.Construction and characˉterization of adenovirus co-expressing hepatitis B virus surface antigen and interleukin-6.Gene,1994,138(1-2):165-170.
, 百拇醫(yī)藥
3 Chengalvala MV,Bhat R A,Bhat B M,et al.Enhanced immunogenicity of hepatitis B surface antigen by insertion of a helper T cell epitope from tetanus toxoid.Vaccine,1999,17(9-10):1035-1041.
4 Zhou Z,Zhang D,Ren H.Construction of the recombinant retrovirus vector of HBV-S gene and it’s expression in eukaryotic cells.Zhonghua Gan Zang Bing Za Zhi,2000,8(5):296-298.
5 Natuk RJ,Davis AR,Chanda PK,et al.Adenovirus vectored vaccines.Dev BiolStand,1994,82:71-77.
6 何金生,王健偉,姜秀麗,等.復(fù)制缺陷型重組腺病毒rv Ad G1VP7免疫學(xué)效果的研究.安徽醫(yī)科大學(xué)學(xué)報,2002,37(2):86-88.
作者單位:250062山東濟南山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所
(收稿日期:2004-01-03)
(編輯劉 靜), 百拇醫(yī)藥
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