重組質(zhì)粒pVAX1-C3d-S 2 S的構建與序列分析及其在真核細胞中的初步表達
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【摘要】 目的 針對我國乙肝病毒流行的血清型，采用美國FDA認可的應用于核酸疫苗的表達載體pVAX1，構建了重組真核表達質(zhì)粒pVAX1-C3d-S 2 S，該質(zhì)粒含有HBV基因組織的pre S 2 S片段及補體C3d的編碼基因;并對其在真核細胞中的表達進行研究。以期預見補體C3d的佐劑作用，加快乙肝核酸疫苗的實用化進程。方法 采用PCR技術分別擴增了小鼠補體C3d基因(897bp)及HBV preS 2 S片段(約900bp)，并將其克隆至真核表達載體pVAX1上，經(jīng)限制性核酸內(nèi)切酶EcoRI的酶切分析及DNA測序分析證實。再將其短暫轉(zhuǎn)染至SP2/0細胞，(1)抽提轉(zhuǎn)染后SP2/0細胞的總RNA，再用RT-PCR法擴增其中的preS 2- S片段;(2)裂解SP2/0細胞，用ELISA方法檢測HBsAg，以檢測真核表達質(zhì)粒pVAX1-C3d-S 2 S的蛋白表達基礎�？蛇M一步用于基因表達和基因治療的研究。結果 DNA測序證實了所擴增片段分別為小鼠補體C3d基因和乙型肝炎病毒adw型preS 2- S基因。連接至真核表達載體pVAX1上后，DNA測序亦證實了pVAX1-C3d-S 2 S中C3d和S 2 S基因序列的準確性。將其短暫轉(zhuǎn)染至SP2/0細胞后，用ELISA法可檢測出S 2 S的表達產(chǎn)物HBˉsAg，PCR擴增法亦檢測出轉(zhuǎn)染細胞中存在preS 2 S基因。結論獲得了新型分子佐劑小鼠補體C3d基因、乙肝病毒preS 2 S基因及其含有新型分子佐劑補體C3d的乙肝核酸疫苗重組質(zhì)粒pVAX1-C3d-S 2 S。試驗提示其能夠在真核細胞中表達目的基因蛋白S。
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關鍵詞 補體C3d preS 2- S基因 pVAX1 乙肝核酸疫苗
【文獻標識碼】 A 【文章編號】 1680-6115(2004)05-0394-04
The construction and the sequence analysing of the eukaryotic
expression plasmid pVAX1-C3d-S2S and the researching of it’s expression in the eukaryotic cells
Sun Meiqin，Jin Xiaolan，Jiang Dachun，et al.
Department of Vascular and Heart Diseases of Chengdu Army General Hospital，Chengdu610083.
, http://www.www.srpcoatings.com
【Abstract】 Objective The commplement C3d has a stronger postive role to control the immunologic system.We have utilized the vector of pVAX1admitted by FDA to construct the recombinant plasmid including the compleˉment C3d and hepatitis B preS2S antigen gene(adw2serum type)，in order to enhance the inmmunologic efficiencies of the HBV nucleotic acid vaccine.And detecting it’s transient expression in the eukaryotic cells.Methods Amplifyˉing the segment of complementC3d gene and the preS2-S gene of HBV by PCR;linking the two segment;and then inserting the linked segment of C3d-preS2-S into pVAX1;detecting the new plasmid pVAX1-C3d-S2S by diˉgesting with Eco RI and DNA sequencing.Finaly，exploring it’s transient expression by amplifying the segment S2S from the transfected eukaryotic cells SP2/0and detecting HBsAg by ELISA.Results The DNA sequencing confirmed the segment of the C3d，preS2-S and the whole pVAX1-C3d-S2S.Then we demonstrated HBsAg by ELISA and amplified preS2S gene from the transfected cells-SP2/0.Conclusion We have successfully cloned the gene of the complement C3d and the preS2S of adw2serum type of HBV;and constructed the recombinant plasmid of pVAX1-C3d-S2S.We also indicate that it can be expressed in the eukaryotic cells.
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Key words complement C3d preS 2 S gene pVAX1 HBV nucleotic vaccine
國內(nèi)外迄今為止的研究結果表明，現(xiàn)有的各種核酸疫苗普遍存在著免疫誘生效力偏低的問題，尚不能達到實用化的目的，這已經(jīng)成為限制核酸疫苗實用化的“瓶頸” [1，2] 。國內(nèi)外學者已采用多種不同的方法來增強核酸疫苗的免疫誘生效力，如使用高效表達載體、增加分子佐劑、改變 接種方式等。而分子佐劑的研究近年來發(fā)展較快，文獻報道，抗原與若干個C3d分子偶聯(lián)成為融合蛋白，可增強該抗原的免疫原性[3，4] 。因此，補體分子C3d作為一種新型佐劑已引起人們的關注。為此，我們構建了含有補體C3d及preS 2- S抗原編碼基因的乙肝核酸疫苗重組質(zhì)粒，驗證補體C3d的佐劑效應，以期建立一種新型且具有較高表達效率并能誘生更強免疫應答的乙肝核酸疫苗，從而加快乙肝核酸疫苗的實用化進程。
, http://www.www.srpcoatings.com 1 材料與方法
1.1 實驗材料
1.1.1 儀器及試劑 BALB/C小鼠均來自四川大學華西醫(yī)院實驗動物中心;PCR儀為Hangzhou Tarotoc Thermal cycter;PCR配套試劑和DNA ligation Kits購自日本TaRaKa公司;Total RNA Kit和pGEM T easy Vector試劑盒購自美國Promega公司;限制性核酸內(nèi)切酶EcoRI、KpnI、NotI和T4連接酶、AMV逆轉(zhuǎn)錄酶及DNA回收試劑盒購自美國Omega公司;Plasmid Mini Prep Kit購自德國Qiagen公司;pVAX1載體由唐紅博士惠贈;JM109由地奧集團惠贈;小鼠骨髓瘤細胞SP2/0由高小平研究員惠贈;HBsAg檢測試劑盒購自華美生物工程公司。
1.1.2 PCR引物 根據(jù)Ross提供的C3d序列及Denbank上HBV基因序列，由筆者自行設計，上�；瞪锛夹g有限公司合成，序列為
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P 1 :5′GCG GGT ACC ATG GCC AAG GAG GCA GAT GTG TCA CTC ACA G3′
P 2 :5′ACC AGA ACC ACC ACC ACC AGA ACC ACC ACC ACC ATC CAC TGC TGG GGA GGT GG3′
P 3 :5′GGT TCT GGT GGT GGT GGT TCT GGT GGT GGT GGTTCT ATG CAG TGG AAC TCC ACA ACA TTC CAC3′
P 4 :5′AGC GGC CGC ATG TAT ACC CAA AGA CAA AAG AA3′黑體部分為添加的限制性核酸內(nèi)切酶KpnI、NotI特異識別的核苷酸序列。
1.2 實驗方法
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1.2.1 目的基因的獲取與連接 (1)擴增上游帶Linker的C3d基因(C3d-約900bp):引物使用P 1 、P 2 ，PCR反應體系:pGEM-C3d質(zhì)粒5μl、10×Buffer5μl、dNTP(2.5mmol/L)4μl、P 1 (10μmol/L)1.25μl、P 2 (10μmol/L)1.25μl、Deep vent polyˉmerase(0.5U/μl)2.5μl、H 2 O31μl，共計50μl。反應結束后，取PCR產(chǎn)物5μl，1%瓊脂糖凝膠電泳，80V，約20min;在900bp附近觀察到一清晰條帶(C3d)，繼續(xù)制備1%瓊脂糖分離膠，電泳后分離900bp的目標條帶，切膠稱重，按Qiagen膠回收試劑盒的說明書操作，分離純化目的片段C3d，最后用50μl純水洗脫備用。(2)擴增下游帶linker的S 2 S基因(-S 2 S約900bp):引物使用P 3 、P 4 ，PCR反應體系:HBV+血清5μl、10×Buffer5μl、dNTP(2.5mmol/l)4μl、P 3 (10μmol/L)1.25μl、P 4 (10μmol/L)1.25μl、pyrobest polymerase(0.5U/μl)2.5μl、H 2 O31μl，共計50μl。短暫離心后置于PCR儀上擴增。反應結束后，取PCR產(chǎn)物5μl，1%瓊脂糖凝膠電泳，80V，約20min;若在900bp附近觀察到一清晰條帶(S2 S)，后再制備1%瓊脂糖分離膠，電泳后分離約900bp的目標條帶，切膠稱重，按Qiagen膠回收試劑盒的說明書操作，分離純化目的片段S 2 S，最后用50μl純水洗脫備用。(3)連接“C3d-”和“-S 2 S”，組成C3d-S 2 S片段(1.8kb):PCR擴增體系中取以上擴增的帶Linker的“C3d-”和“-S 2 S”各5μl，余反應成分同前;引物采用P 1 、P 4 。PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳，并分離回收約1.8kb的目標DNA(C 3d -S 2 S)。
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1.2.2 乙肝核酸疫苗質(zhì)粒的構建 (1)將連接片段C3d-S 2 S與載體pVAX1相連接，構建重組質(zhì)粒pVAX1-C3d-S 2 S:將C3d-S 2 S片段和pVAX1載體應用KpnⅠ/NotⅠ雙 酶切;酶切反應完成后，取2μl酶切產(chǎn)物，以1%瓊脂糖凝膠電泳確定酶切是否完全。膠回收酶切后的載體和DNA插入片段，最后用20μl純水洗脫用于連接反應。連接反應:采用Takara DNA ligation Kits，連接反應體系:Vector(pVAX1)(1:5稀釋)1μl、Inserted DNA(C3d-S 2 S)4μl、SolutionⅠ5μl;混勻，16℃連接1h后備用。重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化感受態(tài)JM109及重組子的篩選按照《分子克隆》 [5] 進行操作。重組質(zhì)粒各取1μl以1%瓊脂糖凝膠電泳，以空載質(zhì)粒為對照，分子量大于空載質(zhì)粒者，再進一步用KpnⅠ和NotⅠ雙酶切;酶切后載體及插入片段分子量大小與預期完全相符，即送上�；倒緶y序。
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1.2.3 重組質(zhì)粒pVAX1-C3d-S 2 S的序列分析 構建完畢的重組質(zhì)粒pVAX1C3d-S 2 S由上�；瞪锛夹g有限公司進行序列分析。序列確定后命名為:pVAX1-C 3d -S 2 S。
1.2.4 重組質(zhì)粒在SP2/0細胞中表達的初步研究 采用經(jīng)典磷酸鈣轉(zhuǎn)染方法將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入真核細胞SP2/0:質(zhì)粒轉(zhuǎn)染2天后，收集細胞:(1)提取轉(zhuǎn)染細胞的總RNA(按照試劑盒說明書進行操作)，RT-PCR擴增S 2 S片段。(2)取經(jīng)RT-PCR確定有目的的基因轉(zhuǎn)錄的轉(zhuǎn)染細胞株，提取蛋白質(zhì)，利用ELISA試劑盒檢測HBsAg。
2 結果
2.1 目的基因C3d-的擴增 采用引物P 1 、P 2 ，以質(zhì)粒pGEM-C3d為模板，擴增出的產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電脈，顯示出一條約900bp的DNA條帶，符合預期大小。見圖1。
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2.2 目的基因-S 2- S的擴增 采用引物P 3 、P 4 ，以乙肝病人的血清為模板，進行PCR擴增。擴增產(chǎn)物以1%瓊脂糖凝膠電泳后顯示出一條約900bp的DNA條帶，符合S 2 S的大小。見圖2。
2.3 目的基因C3d-與S 2- S的連接與擴增 采用引物P 1 、P 3 ，使用PCR技術將C3d-與-S 2- S兩片段連接并擴增，擴增產(chǎn)物以1%瓊脂糖凝膠電脈后顯示出一條約1.8kb的DNA條帶，符合C3d-S 2 S的預期大小。見圖3。
2.4 重組質(zhì)粒的構建與鑒定 在載體pVAX1中插入C3d-S 2 S片段，將獲得和重組質(zhì)粒pVAX1-C3d-S 2 S抽提后電泳，顯示出pVAX1-C3d-S 2 S的分子量大于載體pVAX1。重組質(zhì)粒pVAX1-C3d-S 2 S經(jīng)EcoRI消化，分別切下約1.8kb和900bp的條帶。見圖4。
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圖1 PCR擴增C3d基因M:100bp DNA marker1:PCR product C3d
圖2 PCR擴增S 2- S基因1:-S2S片段(890bp);2:S2S-片段(890bp); N:陰性對照;M:DNA marker DL-2000
圖3C3d與S 2 S的連結M:marker，1:C3d-S 2 S，2:S 2 S，3:C3d
圖4 pVAX1-C3d-S 2 S與pVAX1-S 2 S酶切圖1:pVAX1，2:pVAX1-C3d-S 2 S，3:pVAX1-S 2 S，M:DNA marker
2.5 DNA序列分析 對pVAX1-C3d-S 2 S中C3d-S 2 S全長cDNA約1.8kb進行序列分析，符合理論序列。
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2.6 C3d-S 2 S在真核細胞(SP2/0細胞)中表達的初步研究重組質(zhì)粒pVAX1-C3d-S 2 S轉(zhuǎn)染SP2/0細胞2天后，收 集細胞:(1)PCR擴增細胞裂解液中S 2 S片段:抽提SP2/0細胞的總RNA，逆轉(zhuǎn)錄后進行PCR擴增，得到了S 2 S目的條帶，而空載質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的細胞則為陰性。提示S 2 S已整合至SP2/0細胞基因組中，這為今后的蛋白表達奠定了基礎，見圖5。(2)用ELISA試劑盒檢測細胞裂解液中HBsAg:提取轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒細胞株的總蛋白，ELISA檢測HBsAg的結果提示:重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組為陽性;S 2 S組亦為陽性;而空載質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細胞組則為陰性。圖5 PCR擴增轉(zhuǎn)染細胞SP2/0中的S 2 S基因M:DNA marker;1:S 2 S
3 討論
HBV感染呈全球性分布，我國是高發(fā)區(qū)。目前對慢性乙型肝炎及其繼發(fā)性病變?nèi)绺斡不�、肝癌等尚無理想的治療方法。核酸疫苗的出現(xiàn)與發(fā)展，無疑為慢性乙型肝炎的防治開創(chuàng)了新的思路。目前，包括本研究室在內(nèi)的世界各地的研究者們已構建了多種乙肝核酸疫苗，在動物實驗及Ⅰ期臨床試驗中獲得了令人鼓舞的結果。Roy MJ等 [6～8] 將編碼HBsAg的乙肝核酸疫苗用基因槍皮下接種健康志愿者后，觀察到該疫苗可在人體內(nèi)誘生一定程度的體液和細胞免疫應答。但是，一方面人體試驗結果尚未盡人意，另一方面所用疫苗劑量大(最高達4mg/人)、免疫誘生力低下，因而其安全性令人堪憂。由此，深入研究并探索新型，使用劑量小，安全而高效的乙肝核酸疫苗來預防甚至治療慢性HBV感染，就顯得極為緊迫且意義深遠。既往研究表明，適當?shù)穆?lián)合應用佐劑分子，有可能增強核酸疫苗的免疫效應、減少核酸疫苗的用量，從而提高其安全性，因此佐劑的應用已成為核酸疫苗的研制方向之一。如ChowYH等 [9] 構建的preS 2 S和IL-2的重組質(zhì)粒，可融合表達IL-2與HBV中蛋白，能有效地增強免疫效果，且可克服與MHC相關的、對HBsAg免疫的無反性問題。陳光明等 [10] 先構建了單獨的GM-CSF/IL-2/IFN-γ真核表達質(zhì)粒，使其與S 2 S基因疫苗聯(lián)合免疫，觀察到它能增強基因疫苗的CTL特異性免疫反應，這一形式已取得了國家專利。2000年，Ross TM等 [3] 首次報道了C3d在DNA免疫中對免疫反應的促進作用。他們將3個拷貝串聯(lián)的C3d基因連接到流感病毒的血凝素抗原(HA)的3′末端，再將融合基因克隆到真核表達載體pGA中;重組質(zhì)粒作為DNA疫苗免疫動物后，不但能提高抗體滴度、親和力，還能提高免疫的保護率。另外，這個小組其他的研究表明，C3d分子可增強艾滋病毒膜蛋白gp120的免疫原型。王明雁等 [11] 也構建了pcDNA3.1-hCG-C3d的真核表達質(zhì)粒，以期增強核酸疫苗的免疫效率。C3d作為一種新型的分子佐劑，近年來已得到廣泛的關注。但是，作為佐劑，補體C3d尚未用于乙肝核酸疫苗。因小鼠C3d的基因序列與人的C3d基因具有高度的同源性(約84%) [12] ，因此本實驗結果對于將來的人體應用具有重要的參考價值。本研究根據(jù)Ross TM提供的小鼠C3d基因序列，自行設計引物，從小鼠BALB/c肝組織中獲取了C 3d 基因;并進一步將C 3d 連接到乙肝病毒S 2 S基因的上游，以便于融合表達質(zhì)粒中的C 3d 更好地發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)的佐劑作用。核酸疫苗常用的質(zhì)粒載體有pcDNA3系列、pCI、pVAX1、pRC/CMV、VR1012等。pVAX1載體分子量較小，僅保留了作為真核表達質(zhì)粒所需的最基本組成，且采用Kana抗性基因，因此被美國FDA獲準用于核酸疫苗。本研究根據(jù)HBV抗原基因的作用特點，成功構建了含有新型分子佐劑補體C3d的乙肝核酸疫苗重組質(zhì)粒pVAX1C3d-S 2 S;對此核酸疫苗重組質(zhì)粒的插入序列進行分析后表明，我們自本地區(qū)乙肝攜帶者血清中分離的HBV毒株屬于基因型B/血清亞型adw2或基因型C/血清亞型adrq + ，是中國患者HBV感染的主要型別。
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BALB/c小鼠是核酸疫苗免疫學研究中常用的一種近交系小鼠;SP2/0是由綿羊紅細胞免疫后的BALB/c小鼠脾細胞與P3×63Ag8骨髓瘤細胞(BALB/c來源)融合而成，具有與BALB/c小鼠相同的MHCⅠ類抗原(H-2 d )。通過轉(zhuǎn)染乙肝核酸疫苗質(zhì)粒，SP2/0細胞能夠穩(wěn)定地表達乙肝病毒抗原。本研究將重組質(zhì)粒pVAX1-C3d-S 2 S在真核細胞SP2/0進行了瞬時表達，為乙肝治療性核酸疫苗的進一步研究提供了物質(zhì)基礎。
參考文獻
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12 Nagar B，Jones RG，Diefenbch RJ.X-ray crystal structure of C3d:a C 3 fragment and ligand for complement receptor2.Science，1998，280:1277-1281.
作者單位:610083成都成都軍區(qū)總醫(yī)院心內(nèi)科(內(nèi)分泌科)
四川大學華西醫(yī)院感染病分子生物學重點實驗室
(收稿日期:2003-11-04)
(編輯小 川), 百拇醫(yī)藥
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The construction and the sequence analysing of the eukaryotic
expression plasmid pVAX1-C3d-S2S and the researching of it’s expression in the eukaryotic cells
Sun Meiqin，Jin Xiaolan，Jiang Dachun，et al.
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【Abstract】 Objective The commplement C3d has a stronger postive role to control the immunologic system.We have utilized the vector of pVAX1admitted by FDA to construct the recombinant plasmid including the compleˉment C3d and hepatitis B preS2S antigen gene(adw2serum type)，in order to enhance the inmmunologic efficiencies of the HBV nucleotic acid vaccine.And detecting it’s transient expression in the eukaryotic cells.Methods Amplifyˉing the segment of complementC3d gene and the preS2-S gene of HBV by PCR;linking the two segment;and then inserting the linked segment of C3d-preS2-S into pVAX1;detecting the new plasmid pVAX1-C3d-S2S by diˉgesting with Eco RI and DNA sequencing.Finaly，exploring it’s transient expression by amplifying the segment S2S from the transfected eukaryotic cells SP2/0and detecting HBsAg by ELISA.Results The DNA sequencing confirmed the segment of the C3d，preS2-S and the whole pVAX1-C3d-S2S.Then we demonstrated HBsAg by ELISA and amplified preS2S gene from the transfected cells-SP2/0.Conclusion We have successfully cloned the gene of the complement C3d and the preS2S of adw2serum type of HBV;and constructed the recombinant plasmid of pVAX1-C3d-S2S.We also indicate that it can be expressed in the eukaryotic cells.
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Key words complement C3d preS 2 S gene pVAX1 HBV nucleotic vaccine
國內(nèi)外迄今為止的研究結果表明，現(xiàn)有的各種核酸疫苗普遍存在著免疫誘生效力偏低的問題，尚不能達到實用化的目的，這已經(jīng)成為限制核酸疫苗實用化的“瓶頸” [1，2] 。國內(nèi)外學者已采用多種不同的方法來增強核酸疫苗的免疫誘生效力，如使用高效表達載體、增加分子佐劑、改變 接種方式等。而分子佐劑的研究近年來發(fā)展較快，文獻報道，抗原與若干個C3d分子偶聯(lián)成為融合蛋白，可增強該抗原的免疫原性[3，4] 。因此，補體分子C3d作為一種新型佐劑已引起人們的關注。為此，我們構建了含有補體C3d及preS 2- S抗原編碼基因的乙肝核酸疫苗重組質(zhì)粒，驗證補體C3d的佐劑效應，以期建立一種新型且具有較高表達效率并能誘生更強免疫應答的乙肝核酸疫苗，從而加快乙肝核酸疫苗的實用化進程。
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1.1 實驗材料
1.1.1 儀器及試劑 BALB/C小鼠均來自四川大學華西醫(yī)院實驗動物中心;PCR儀為Hangzhou Tarotoc Thermal cycter;PCR配套試劑和DNA ligation Kits購自日本TaRaKa公司;Total RNA Kit和pGEM T easy Vector試劑盒購自美國Promega公司;限制性核酸內(nèi)切酶EcoRI、KpnI、NotI和T4連接酶、AMV逆轉(zhuǎn)錄酶及DNA回收試劑盒購自美國Omega公司;Plasmid Mini Prep Kit購自德國Qiagen公司;pVAX1載體由唐紅博士惠贈;JM109由地奧集團惠贈;小鼠骨髓瘤細胞SP2/0由高小平研究員惠贈;HBsAg檢測試劑盒購自華美生物工程公司。
1.1.2 PCR引物 根據(jù)Ross提供的C3d序列及Denbank上HBV基因序列，由筆者自行設計，上�；瞪锛夹g有限公司合成，序列為
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P 1 :5′GCG GGT ACC ATG GCC AAG GAG GCA GAT GTG TCA CTC ACA G3′
P 2 :5′ACC AGA ACC ACC ACC ACC AGA ACC ACC ACC ACC ATC CAC TGC TGG GGA GGT GG3′
P 3 :5′GGT TCT GGT GGT GGT GGT TCT GGT GGT GGT GGTTCT ATG CAG TGG AAC TCC ACA ACA TTC CAC3′
P 4 :5′AGC GGC CGC ATG TAT ACC CAA AGA CAA AAG AA3′黑體部分為添加的限制性核酸內(nèi)切酶KpnI、NotI特異識別的核苷酸序列。
1.2 實驗方法
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1.2.1 目的基因的獲取與連接 (1)擴增上游帶Linker的C3d基因(C3d-約900bp):引物使用P 1 、P 2 ，PCR反應體系:pGEM-C3d質(zhì)粒5μl、10×Buffer5μl、dNTP(2.5mmol/L)4μl、P 1 (10μmol/L)1.25μl、P 2 (10μmol/L)1.25μl、Deep vent polyˉmerase(0.5U/μl)2.5μl、H 2 O31μl，共計50μl。反應結束后，取PCR產(chǎn)物5μl，1%瓊脂糖凝膠電泳，80V，約20min;在900bp附近觀察到一清晰條帶(C3d)，繼續(xù)制備1%瓊脂糖分離膠，電泳后分離900bp的目標條帶，切膠稱重，按Qiagen膠回收試劑盒的說明書操作，分離純化目的片段C3d，最后用50μl純水洗脫備用。(2)擴增下游帶linker的S 2 S基因(-S 2 S約900bp):引物使用P 3 、P 4 ，PCR反應體系:HBV+血清5μl、10×Buffer5μl、dNTP(2.5mmol/l)4μl、P 3 (10μmol/L)1.25μl、P 4 (10μmol/L)1.25μl、pyrobest polymerase(0.5U/μl)2.5μl、H 2 O31μl，共計50μl。短暫離心后置于PCR儀上擴增。反應結束后，取PCR產(chǎn)物5μl，1%瓊脂糖凝膠電泳，80V，約20min;若在900bp附近觀察到一清晰條帶(S2 S)，后再制備1%瓊脂糖分離膠，電泳后分離約900bp的目標條帶，切膠稱重，按Qiagen膠回收試劑盒的說明書操作，分離純化目的片段S 2 S，最后用50μl純水洗脫備用。(3)連接“C3d-”和“-S 2 S”，組成C3d-S 2 S片段(1.8kb):PCR擴增體系中取以上擴增的帶Linker的“C3d-”和“-S 2 S”各5μl，余反應成分同前;引物采用P 1 、P 4 。PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳，并分離回收約1.8kb的目標DNA(C 3d -S 2 S)。
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1.2.2 乙肝核酸疫苗質(zhì)粒的構建 (1)將連接片段C3d-S 2 S與載體pVAX1相連接，構建重組質(zhì)粒pVAX1-C3d-S 2 S:將C3d-S 2 S片段和pVAX1載體應用KpnⅠ/NotⅠ雙 酶切;酶切反應完成后，取2μl酶切產(chǎn)物，以1%瓊脂糖凝膠電泳確定酶切是否完全。膠回收酶切后的載體和DNA插入片段，最后用20μl純水洗脫用于連接反應。連接反應:采用Takara DNA ligation Kits，連接反應體系:Vector(pVAX1)(1:5稀釋)1μl、Inserted DNA(C3d-S 2 S)4μl、SolutionⅠ5μl;混勻，16℃連接1h后備用。重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化感受態(tài)JM109及重組子的篩選按照《分子克隆》 [5] 進行操作。重組質(zhì)粒各取1μl以1%瓊脂糖凝膠電泳，以空載質(zhì)粒為對照，分子量大于空載質(zhì)粒者，再進一步用KpnⅠ和NotⅠ雙酶切;酶切后載體及插入片段分子量大小與預期完全相符，即送上�；倒緶y序。
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1.2.3 重組質(zhì)粒pVAX1-C3d-S 2 S的序列分析 構建完畢的重組質(zhì)粒pVAX1C3d-S 2 S由上�；瞪锛夹g有限公司進行序列分析。序列確定后命名為:pVAX1-C 3d -S 2 S。
1.2.4 重組質(zhì)粒在SP2/0細胞中表達的初步研究 采用經(jīng)典磷酸鈣轉(zhuǎn)染方法將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入真核細胞SP2/0:質(zhì)粒轉(zhuǎn)染2天后，收集細胞:(1)提取轉(zhuǎn)染細胞的總RNA(按照試劑盒說明書進行操作)，RT-PCR擴增S 2 S片段。(2)取經(jīng)RT-PCR確定有目的的基因轉(zhuǎn)錄的轉(zhuǎn)染細胞株，提取蛋白質(zhì)，利用ELISA試劑盒檢測HBsAg。
2 結果
2.1 目的基因C3d-的擴增 采用引物P 1 、P 2 ，以質(zhì)粒pGEM-C3d為模板，擴增出的產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電脈，顯示出一條約900bp的DNA條帶，符合預期大小。見圖1。
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2.2 目的基因-S 2- S的擴增 采用引物P 3 、P 4 ，以乙肝病人的血清為模板，進行PCR擴增。擴增產(chǎn)物以1%瓊脂糖凝膠電泳后顯示出一條約900bp的DNA條帶，符合S 2 S的大小。見圖2。
2.3 目的基因C3d-與S 2- S的連接與擴增 采用引物P 1 、P 3 ，使用PCR技術將C3d-與-S 2- S兩片段連接并擴增，擴增產(chǎn)物以1%瓊脂糖凝膠電脈后顯示出一條約1.8kb的DNA條帶，符合C3d-S 2 S的預期大小。見圖3。
2.4 重組質(zhì)粒的構建與鑒定 在載體pVAX1中插入C3d-S 2 S片段，將獲得和重組質(zhì)粒pVAX1-C3d-S 2 S抽提后電泳，顯示出pVAX1-C3d-S 2 S的分子量大于載體pVAX1。重組質(zhì)粒pVAX1-C3d-S 2 S經(jīng)EcoRI消化，分別切下約1.8kb和900bp的條帶。見圖4。
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圖1 PCR擴增C3d基因M:100bp DNA marker1:PCR product C3d
圖2 PCR擴增S 2- S基因1:-S2S片段(890bp);2:S2S-片段(890bp); N:陰性對照;M:DNA marker DL-2000
圖3C3d與S 2 S的連結M:marker，1:C3d-S 2 S，2:S 2 S，3:C3d
圖4 pVAX1-C3d-S 2 S與pVAX1-S 2 S酶切圖1:pVAX1，2:pVAX1-C3d-S 2 S，3:pVAX1-S 2 S，M:DNA marker
2.5 DNA序列分析 對pVAX1-C3d-S 2 S中C3d-S 2 S全長cDNA約1.8kb進行序列分析，符合理論序列。
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2.6 C3d-S 2 S在真核細胞(SP2/0細胞)中表達的初步研究重組質(zhì)粒pVAX1-C3d-S 2 S轉(zhuǎn)染SP2/0細胞2天后，收 集細胞:(1)PCR擴增細胞裂解液中S 2 S片段:抽提SP2/0細胞的總RNA，逆轉(zhuǎn)錄后進行PCR擴增，得到了S 2 S目的條帶，而空載質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的細胞則為陰性。提示S 2 S已整合至SP2/0細胞基因組中，這為今后的蛋白表達奠定了基礎，見圖5。(2)用ELISA試劑盒檢測細胞裂解液中HBsAg:提取轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒細胞株的總蛋白，ELISA檢測HBsAg的結果提示:重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組為陽性;S 2 S組亦為陽性;而空載質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細胞組則為陰性。圖5 PCR擴增轉(zhuǎn)染細胞SP2/0中的S 2 S基因M:DNA marker;1:S 2 S
3 討論
HBV感染呈全球性分布，我國是高發(fā)區(qū)。目前對慢性乙型肝炎及其繼發(fā)性病變?nèi)绺斡不�、肝癌等尚無理想的治療方法。核酸疫苗的出現(xiàn)與發(fā)展，無疑為慢性乙型肝炎的防治開創(chuàng)了新的思路。目前，包括本研究室在內(nèi)的世界各地的研究者們已構建了多種乙肝核酸疫苗，在動物實驗及Ⅰ期臨床試驗中獲得了令人鼓舞的結果。Roy MJ等 [6～8] 將編碼HBsAg的乙肝核酸疫苗用基因槍皮下接種健康志愿者后，觀察到該疫苗可在人體內(nèi)誘生一定程度的體液和細胞免疫應答。但是，一方面人體試驗結果尚未盡人意，另一方面所用疫苗劑量大(最高達4mg/人)、免疫誘生力低下，因而其安全性令人堪憂。由此，深入研究并探索新型，使用劑量小，安全而高效的乙肝核酸疫苗來預防甚至治療慢性HBV感染，就顯得極為緊迫且意義深遠。既往研究表明，適當?shù)穆?lián)合應用佐劑分子，有可能增強核酸疫苗的免疫效應、減少核酸疫苗的用量，從而提高其安全性，因此佐劑的應用已成為核酸疫苗的研制方向之一。如ChowYH等 [9] 構建的preS 2 S和IL-2的重組質(zhì)粒，可融合表達IL-2與HBV中蛋白，能有效地增強免疫效果，且可克服與MHC相關的、對HBsAg免疫的無反性問題。陳光明等 [10] 先構建了單獨的GM-CSF/IL-2/IFN-γ真核表達質(zhì)粒，使其與S 2 S基因疫苗聯(lián)合免疫，觀察到它能增強基因疫苗的CTL特異性免疫反應，這一形式已取得了國家專利。2000年，Ross TM等 [3] 首次報道了C3d在DNA免疫中對免疫反應的促進作用。他們將3個拷貝串聯(lián)的C3d基因連接到流感病毒的血凝素抗原(HA)的3′末端，再將融合基因克隆到真核表達載體pGA中;重組質(zhì)粒作為DNA疫苗免疫動物后，不但能提高抗體滴度、親和力，還能提高免疫的保護率。另外，這個小組其他的研究表明，C3d分子可增強艾滋病毒膜蛋白gp120的免疫原型。王明雁等 [11] 也構建了pcDNA3.1-hCG-C3d的真核表達質(zhì)粒，以期增強核酸疫苗的免疫效率。C3d作為一種新型的分子佐劑，近年來已得到廣泛的關注。但是，作為佐劑，補體C3d尚未用于乙肝核酸疫苗。因小鼠C3d的基因序列與人的C3d基因具有高度的同源性(約84%) [12] ，因此本實驗結果對于將來的人體應用具有重要的參考價值。本研究根據(jù)Ross TM提供的小鼠C3d基因序列，自行設計引物，從小鼠BALB/c肝組織中獲取了C 3d 基因;并進一步將C 3d 連接到乙肝病毒S 2 S基因的上游，以便于融合表達質(zhì)粒中的C 3d 更好地發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)的佐劑作用。核酸疫苗常用的質(zhì)粒載體有pcDNA3系列、pCI、pVAX1、pRC/CMV、VR1012等。pVAX1載體分子量較小，僅保留了作為真核表達質(zhì)粒所需的最基本組成，且采用Kana抗性基因，因此被美國FDA獲準用于核酸疫苗。本研究根據(jù)HBV抗原基因的作用特點，成功構建了含有新型分子佐劑補體C3d的乙肝核酸疫苗重組質(zhì)粒pVAX1C3d-S 2 S;對此核酸疫苗重組質(zhì)粒的插入序列進行分析后表明，我們自本地區(qū)乙肝攜帶者血清中分離的HBV毒株屬于基因型B/血清亞型adw2或基因型C/血清亞型adrq + ，是中國患者HBV感染的主要型別。
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BALB/c小鼠是核酸疫苗免疫學研究中常用的一種近交系小鼠;SP2/0是由綿羊紅細胞免疫后的BALB/c小鼠脾細胞與P3×63Ag8骨髓瘤細胞(BALB/c來源)融合而成，具有與BALB/c小鼠相同的MHCⅠ類抗原(H-2 d )。通過轉(zhuǎn)染乙肝核酸疫苗質(zhì)粒，SP2/0細胞能夠穩(wěn)定地表達乙肝病毒抗原。本研究將重組質(zhì)粒pVAX1-C3d-S 2 S在真核細胞SP2/0進行了瞬時表達，為乙肝治療性核酸疫苗的進一步研究提供了物質(zhì)基礎。
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作者單位:610083成都成都軍區(qū)總醫(yī)院心內(nèi)科(內(nèi)分泌科)
四川大學華西醫(yī)院感染病分子生物學重點實驗室
(收稿日期:2003-11-04)
(編輯小 川), 百拇醫(yī)藥
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