B細(xì)胞淋巴瘤中錯配修復(fù)基因GTBP、hMLH1蛋白表達(dá)的研究( 基金項(xiàng)目)
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基金項(xiàng)目:國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(編號:30160030)
【摘要】 目的 探討GTBP、hMLH1基因蛋白在B細(xì)胞淋巴瘤發(fā)生學(xué)上的意義。方法 對23例B細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞進(jìn)行免疫組織化學(xué)EnVinsion法檢測GTBP、hMLH1的表達(dá)情況。結(jié)果 DLBCL細(xì)胞GTBP蛋白表達(dá)陽性7例(7/11)，hMLH1蛋白表達(dá)陽性3例(3/6)。FL中GTBP蛋白表達(dá)有3例(3/5)，hMLH1蛋白表達(dá)陽性4例(4/4)。DLBCL中GTBP、hMLH1蛋白表達(dá)與FL中GTBP、hMLH1蛋白表達(dá)差異無顯著性(P>0.05)。原發(fā)生于淋巴結(jié)有7例GTBP蛋白表達(dá)陽性(7/8)，有4例hMLH1蛋白表達(dá)陽性(4/6)，原發(fā)生于淋巴結(jié)外有8例GTBP蛋白表達(dá)陽性(8/13)，有8例hMLH1蛋白表達(dá)陽性(8/9)，原發(fā)生于淋巴結(jié)內(nèi)與淋巴結(jié)外的GTBP、hMLH1蛋白表達(dá)差異無顯著性(P>0.05)。高度惡性有8例GTBP蛋白表達(dá)(8/12)，有4例hMLH1蛋白表達(dá)陽性(4/6);低度惡性有7例GTBP蛋白表達(dá)陽性(7/9)，有8例hMLH1蛋白表達(dá)陽性(8/9)，GTBP蛋白在高度惡性與低度惡性表達(dá)之間差異無顯著性(P>0.05);而hMLH1蛋白表達(dá)在低度惡性較高度惡性高，差異有顯著性(P<0.05)。結(jié)論 hMLH1和GTBP錯配修復(fù)基因蛋白表達(dá)與B細(xì)胞淋巴瘤組織學(xué)類型、腫瘤的發(fā)生部位可能無關(guān)系。hMLH1基因蛋白在B細(xì)胞淋巴瘤的發(fā)生中可能起一定的作用。
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關(guān)鍵詞 B細(xì)胞淋巴瘤 錯配修復(fù)基因 GTBP hMLH1 免疫組化
【文獻(xiàn)標(biāo)識碼】 A 【文章編號】 1680-6115(2004)06-0481-04
The study of mismatch repair gene GTBP and
hMLH1proteins in B-cell lymphoma
Wei Zhonghua，Xie Yuping
The Affiliated Hospiatl of Zunyi Medical College，Guizhou563003.
【Abstract】 Objective To evaluate GTBP、hMLH1protein in the pathagenesis of the B-cell lymphoma.Methods Twenty-three cases with B-cell lymphoma were observed about the expression of GTBP and hMLH1proˉteins by the method of immunohistochemistry En Vinsion.Results In DLBCL，the positive cells for GTBP was found in7cases(7/11)，the positive signal for hMLH1was detected in3cases(3/6);the FLrevealed GTBP positive signal in3cases(3/5)and the hMLH1positive signal in4cases(4/4).Between the DLBCL and FL，no any significant difˉference was found in the GTBP and hMLH1expression(P>0.05).In the nodal cases，there were7cases showing GTBP positive tumor cells(7/8)and4cases expressing hMLH1positive cells(4/6).In the extra-nodal site，there were8cases for GTBP positive(8/13)and8cases for hMLH1positive(8/9).So，between the nodal and extra-nodal sites，there were also no any significant difference detected in the GTBP and hMLH1expression(P>0.05).In high grade group，we have found8cases were positive for GTBP(8/12)and4cases positive for hMLH1(4/6).In the low grade group，the GTPB positive cells could be seen in7cases(7/9)and hMLH1positive cells also be found in8cases(8/9).hMLH1has more expression frequence in the low grade group than that in thehigh grade group(P<0.05)，but GTBP was not.Conclusion There are no any relationshipes between the B-cell lymphoma histological catˉegories、the location of tumor and the GTBP/hMLH1expression in the tumor cells.So we consider that hMLH1plays an important role in the pathogenesis of B-cell lymphoma.
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Key words B cell lymphoma mismatch repair gene GTBP hMLH1 immunohistochemistry
錯配修復(fù)(mismatch repair，MMR)是指細(xì)胞對復(fù)制錯誤進(jìn)行的修復(fù)，是生物體維持自身遺傳物質(zhì)穩(wěn)定性的重要機(jī)制。已被克隆的人類MMR基因共有6個，包括hMSH2、hMLH1、hPMS1、hPMS2、hMSH6(GTBP)、hMSH3。這些基因的缺陷可致復(fù)制后錯配修復(fù)功能喪失，引起細(xì)胞的高自發(fā)突變率，最終導(dǎo)致整個基因組的不穩(wěn)定性，產(chǎn)生突變體。其中最常見的突變體表型(mutatorphenotype)為微衛(wèi)星不穩(wěn)定性(Microsatellite Instability，MSI)。Boyer等報(bào)道證實(shí)錯配修復(fù)基因缺陷和微衛(wèi)星不穩(wěn)定性改變，兩者之間有著十分密切的關(guān)系。GTBP、hMLH1是已被克隆的人類MMR基因中的2個。GTBP蛋白染色定位在2p16，其功能是與hMSH2形成復(fù)合物，對應(yīng)的同源物為MutS;hMLH1蛋白染色體定位在3p21.3-23，其功能是與錯配點(diǎn)結(jié)合并修復(fù)，對應(yīng)的同源物為MutL [1] 。由于DNA錯配修復(fù)基因發(fā)生突變，對錯配的修復(fù)功能降低，導(dǎo)致微衛(wèi)星不穩(wěn)定性，在惡性腫瘤發(fā)生過程中的作用受到關(guān)注，因此，直接檢測腫瘤組織中MMR基因蛋白表達(dá)情況能更直觀地反映基因的功能狀況。目前國內(nèi)有關(guān)MMR和MSI在各型淋巴瘤中的研究較為少見，MMR和MSI在淋巴瘤發(fā)病學(xué)中的意義和作用仍有待進(jìn)一步探討。本研究的目的在于通過免疫組化方法檢測錯配修復(fù)基因GTBP、hMLH1蛋白在B細(xì)胞淋巴瘤組織中的表達(dá)情況，以期為結(jié)合MSI進(jìn)行綜合分析，提供理論參考依據(jù)。
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1 資料與方法
1.1 一般資料 標(biāo)本來自1998年1月～2003年11月遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院病理科的B細(xì)胞淋巴瘤檔案資料23例。男16例，女7例;年齡最大者69歲，最小8歲。平均年齡46.8歲。男∶女為2.3∶1。所有病例均根據(jù)2001年最新WHO分類，均經(jīng)病理組織學(xué)及免疫組織化學(xué)檢查確診。其中DLBCL12例，MALT3例，F(xiàn)L5例，BCLL/SLL1例，B-LBL/ALL1例，B-PLL1例。23例B細(xì)胞淋巴瘤中發(fā)生于淋巴結(jié)9例，其中頸部淋巴結(jié)有6例。其次分別發(fā)生于腹股溝及腸系膜和大網(wǎng)膜淋巴結(jié)。原發(fā)于淋巴結(jié)外的分布較廣，有14例，包括胃腸道、陰莖、右上肺葉腫塊、脾、胰尾等。所有患者術(shù)前均未經(jīng)過放射治療或化學(xué)治療。所有標(biāo)本均經(jīng)過10%的中性甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋。根據(jù)WHO分類 [1] ，高度惡性組13例(DLBCL12例，B-LBL/ALL1例)。低度惡性組10例(FL5例，BELL/SLL1例，MALT3例，B-PLL1例)。
, 百拇醫(yī)藥 1.2 方法
1.2.1 試劑來源 一抗GTBP、hMLH1均購自美國Santa Cruz Biotechnology公司。En Vinsion復(fù)合物和DAB顯色劑購于基因公司。
1.2.2 玻片處理 載玻片于10%重氯酸鉀液中浸泡12h，蓋玻片浸泡6h，自來水沖洗干凈后蒸餾水浸泡，70℃烤箱中烘干，每張玻片上涂抹一層多聚賴氨酸防脫片劑，室溫涼干備用。
1.2.3 化學(xué)處理 免疫組織化學(xué)進(jìn)行En Vinsion法染色。
1.3 染色結(jié)果的判定 細(xì)胞核出現(xiàn)彌漫性棕黃色或棕褐色細(xì)顆粒狀染色為陽性細(xì)胞，反之為陰性。陽性細(xì)胞≤25%標(biāo)記為(+);陽性細(xì)胞25%～50%標(biāo)記為(++)。陽性細(xì)胞>50%標(biāo)記為(+++)。
1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)嚴(yán)格按照統(tǒng)計(jì)學(xué)要求進(jìn)行收集、整理，建立數(shù)據(jù)庫。采用樣本率的四格表Fisher確切概率法檢驗(yàn)，P<0.05為對比組間的差異有顯著性。
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2 結(jié)果
2.1 23例B細(xì)胞淋巴瘤組織中GTBP、hMLH1表達(dá)結(jié)果 見表1。
表1 B細(xì)胞淋巴瘤組織中GTBP、hMLH1表達(dá)結(jié)果
圖1 DLBCL瘤細(xì)胞hMLH1 核陽性(ABC×200)
2.2 不同組織學(xué)類型B細(xì)胞淋巴瘤組織中GTBP、hMLH1蛋白的表達(dá) 見表2。
表2 不同組織類型GTBP、hMLH1表達(dá)
2.3 不同部位B細(xì)胞淋巴瘤組織中GTBP、hMLH1表達(dá)結(jié)果 見表3。
表3 不同部位GTBP、hMLH1表達(dá)
2.4 不同惡性程度B細(xì)胞淋巴瘤組織中GTBP、hMLH1表達(dá)結(jié)果 見表4。
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表4 不同惡性程度GTBP、hMLH1表達(dá)
注: ˇ 與低度惡性組比較P<0.05 高度惡性組13例，有8例GTBP蛋白表達(dá)(8/12)，4例hMLH1蛋白表達(dá)陽性(4/7)。低度惡性組10例，有7例GTBP蛋白表達(dá)陽性(7/9)，8例hMLH1蛋白表達(dá)陽性達(dá)(8/8)。GTBP蛋白表達(dá)在低度惡性組與高度惡性組中相比較差異無顯著性，P>0.05，hMLH1蛋白表達(dá)在低度惡性組與高度惡性組中相比較差異有顯著性，P<0.05。
3 討論
正常情況下，DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)是靠A-T，G-C之間的氫鍵互補(bǔ)配對而維持的，當(dāng)各種因素使DNA之間的堿基互補(bǔ)配對發(fā)生了錯誤，即形成了DNA的錯配。為保證DNA復(fù)制的忠實(shí)性，維持基因組的穩(wěn)定性，降低細(xì)胞的自發(fā)突變，需要對錯配的堿基進(jìn)行修復(fù)，即錯配修復(fù)。發(fā)揮這種作用的基因即錯配修復(fù)基因。當(dāng)錯配修復(fù)基因由于突變而不能發(fā)揮錯配修復(fù)功能時，將會出現(xiàn)微衛(wèi)星的不穩(wěn)定性。到目前為止，已發(fā)現(xiàn)至少有6種錯配修復(fù)基因與人類腫瘤的發(fā)生有關(guān)，即hMSH2、hMSH6(GTBP)、hMSH3、hMLH1、hPMS1、hPMS2。前3個與大腸桿菌MutS同源，后3個與MutL同源 [2] 。由于DNA復(fù)制、修復(fù)過程的復(fù)雜性，除了錯配修復(fù)功能缺陷外，導(dǎo)致MSI還可能存在其它機(jī)制，特別是對于大多數(shù)非結(jié)直腸癌的腫瘤，其MSI的產(chǎn)生可能與錯配修復(fù)功能無關(guān)。現(xiàn)有學(xué)者提出，廣泛、重度的DNA損傷超過了DNA的修復(fù)功能時，也可能出現(xiàn)MSI，這就是所謂的過飽和機(jī)制，在這種機(jī)制下DNA的錯配修復(fù)功能是完整的 [3] 。
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基因的突變將產(chǎn)生有缺陷的蛋白，從而不能發(fā)揮錯配修復(fù)功能，導(dǎo)致微衛(wèi)星DNA的不穩(wěn)定性，增加整個基因組的不穩(wěn)定性，從而引起包括癌基因及抑癌基因等一系列改變，當(dāng)突變積累到一定程度，就會導(dǎo)致細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化，發(fā)生多種腫瘤。hMLH1、GTBP是MMR基因中的2個。hMLH1基因是研究較多的一種，1994年由Bronner等在研究遺傳性非息肉形成性結(jié)、直腸癌的過程中發(fā)現(xiàn)，它定位于染色體的3p21.3-23，基因組DNA全長約58kb(不包括啟動子)，含19個外顯子，cDNA全長2484bp，編碼長度為2268bp的開放閱讀框架。hMLH1蛋白由756個氨基酸殘基組成，與酵母的MLH1蛋白有41%的同源性。研究表明，hMLH1在多種組織中均有表達(dá)。約30%的遺傳性非息肉性結(jié)直腸癌的發(fā)生與hMLH1基因的突變或缺失有關(guān)。其突變主要集中在15和16外顯子，約占hMLH1突變的50%，分別為點(diǎn)突變和移碼突變，70%的突變因形成終止密碼導(dǎo)致翻譯過早終止而產(chǎn)生不全的hMLH1蛋白。GTBP基因定位在2p16，其編碼蛋白GTBP分子量為162kD。GTBP的功能結(jié)合到DNA鏈上含有G/T錯配的部位，但是該功能的進(jìn)行需要與hMSH2形成復(fù)合物才能完成。
, 百拇醫(yī)藥
本研究發(fā)現(xiàn)，DLBCL中GTBP蛋白表達(dá)(7/11)和hMLH1蛋白表達(dá)(3/6)，與FL GTBP蛋白表達(dá)(3/5)，hMLH1蛋白表達(dá)(4/4)，相比較進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，未發(fā)現(xiàn)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。由此推測，hMLH1和GTBP錯配修復(fù)基因蛋白表達(dá)與B細(xì)胞淋巴瘤組織學(xué)類型可能無關(guān)。其余MALT、BCLL/SLL、B-LBL/ALL以及B-PLL因例數(shù)太少，無法統(tǒng)計(jì)這幾種組織學(xué)類型中GTBP和hMLH1表達(dá)的差異，在此不作討論，有待增加病例數(shù)。B細(xì)胞淋巴瘤GTBP和hMLH1蛋白表達(dá)在結(jié)內(nèi)和結(jié)外之間沒有發(fā)現(xiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，也由此推斷MMR基因的表達(dá)與B細(xì)胞淋巴瘤發(fā)生的部位無關(guān)。有報(bào)道人群中hMLH1基因突變率平均為1:3139。也有研究結(jié)果顯示，hMLH1蛋白在肺癌組織中表達(dá)陽性率為58.3%，推測hMLH1表達(dá)低者多處于臨床晚期，預(yù)后較差 [4] 。另有研究表明，在卵巢上皮癌中，hMLH1的表達(dá)率為69.6%，有hMLH1基因表達(dá)的病例，腫瘤的惡性程度較低，預(yù)后較好 [5] 。還有研究顯示，hMLH1在肝細(xì)胞癌中陽性表達(dá)高達(dá)80%～88%，認(rèn)為hMLH1在肝細(xì)胞癌中的缺失是一種并非常見的分子現(xiàn)象 [6] 。有肝胎細(xì)胞中hMLH1表達(dá)較強(qiáng) [7] 。本研究中hMLH1蛋白表達(dá)在低度惡性B細(xì)胞淋巴瘤中高于高度惡性B細(xì)胞淋巴瘤，和大部分研究結(jié)果一致，說明hMLH1蛋白表達(dá)低的淋巴瘤類型浸潤性較強(qiáng)，預(yù)后較差。其原因可能是hMLH1蛋白不但參與了DNA的錯配修復(fù)，同時可能參與了腫瘤的分化過程。
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GTBP蛋白表達(dá)在B細(xì)胞淋巴瘤中高度惡性與低度惡性相比較，無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。結(jié)合GTBP的功能作用，推測GTBP在淋巴瘤的發(fā)生學(xué)上有重要作用，但沒有參與腫瘤細(xì)胞的分化過程。以上結(jié)果非常有趣，可以作為蛋白表達(dá)水平的研究資料提供給MSI分析者和同一課題組中癌基因和抑癌基因的研究者，以從分子水平更深入地探討惡性淋巴瘤的發(fā)生學(xué)機(jī)制。
國內(nèi)已在多種疾病方面展開關(guān)于MSI的研究 [8，9] ，但關(guān)于惡性淋巴瘤MSI的資料不多。MSI的研究主要集中在人的FAP及HNPCC。國外雖然在某些惡性淋巴瘤類型中作過MSI的研究 [10～12] ，但惡性淋巴瘤的分類復(fù)雜，特別是在中國，其發(fā)病情況和歐美等國家有較大差異，有關(guān)各種類型淋巴瘤染色體異常，分子遺傳學(xué)等方面的資料較少。通過對B細(xì)胞淋巴瘤MSI中的2個基因即GTBP、hMLH1蛋白進(jìn)行檢測，相信可以為全面認(rèn)識B細(xì)胞淋巴瘤的MSI提供一定的線索。
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作者單位:563003貴州遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院病理科
(收稿日期:2004-03-12)
(編輯元 紅), 百拇醫(yī)藥
【摘要】 目的 探討GTBP、hMLH1基因蛋白在B細(xì)胞淋巴瘤發(fā)生學(xué)上的意義。方法 對23例B細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞進(jìn)行免疫組織化學(xué)EnVinsion法檢測GTBP、hMLH1的表達(dá)情況。結(jié)果 DLBCL細(xì)胞GTBP蛋白表達(dá)陽性7例(7/11)，hMLH1蛋白表達(dá)陽性3例(3/6)。FL中GTBP蛋白表達(dá)有3例(3/5)，hMLH1蛋白表達(dá)陽性4例(4/4)。DLBCL中GTBP、hMLH1蛋白表達(dá)與FL中GTBP、hMLH1蛋白表達(dá)差異無顯著性(P>0.05)。原發(fā)生于淋巴結(jié)有7例GTBP蛋白表達(dá)陽性(7/8)，有4例hMLH1蛋白表達(dá)陽性(4/6)，原發(fā)生于淋巴結(jié)外有8例GTBP蛋白表達(dá)陽性(8/13)，有8例hMLH1蛋白表達(dá)陽性(8/9)，原發(fā)生于淋巴結(jié)內(nèi)與淋巴結(jié)外的GTBP、hMLH1蛋白表達(dá)差異無顯著性(P>0.05)。高度惡性有8例GTBP蛋白表達(dá)(8/12)，有4例hMLH1蛋白表達(dá)陽性(4/6);低度惡性有7例GTBP蛋白表達(dá)陽性(7/9)，有8例hMLH1蛋白表達(dá)陽性(8/9)，GTBP蛋白在高度惡性與低度惡性表達(dá)之間差異無顯著性(P>0.05);而hMLH1蛋白表達(dá)在低度惡性較高度惡性高，差異有顯著性(P<0.05)。結(jié)論 hMLH1和GTBP錯配修復(fù)基因蛋白表達(dá)與B細(xì)胞淋巴瘤組織學(xué)類型、腫瘤的發(fā)生部位可能無關(guān)系。hMLH1基因蛋白在B細(xì)胞淋巴瘤的發(fā)生中可能起一定的作用。
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關(guān)鍵詞 B細(xì)胞淋巴瘤 錯配修復(fù)基因 GTBP hMLH1 免疫組化
【文獻(xiàn)標(biāo)識碼】 A 【文章編號】 1680-6115(2004)06-0481-04
The study of mismatch repair gene GTBP and
hMLH1proteins in B-cell lymphoma
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【Abstract】 Objective To evaluate GTBP、hMLH1protein in the pathagenesis of the B-cell lymphoma.Methods Twenty-three cases with B-cell lymphoma were observed about the expression of GTBP and hMLH1proˉteins by the method of immunohistochemistry En Vinsion.Results In DLBCL，the positive cells for GTBP was found in7cases(7/11)，the positive signal for hMLH1was detected in3cases(3/6);the FLrevealed GTBP positive signal in3cases(3/5)and the hMLH1positive signal in4cases(4/4).Between the DLBCL and FL，no any significant difˉference was found in the GTBP and hMLH1expression(P>0.05).In the nodal cases，there were7cases showing GTBP positive tumor cells(7/8)and4cases expressing hMLH1positive cells(4/6).In the extra-nodal site，there were8cases for GTBP positive(8/13)and8cases for hMLH1positive(8/9).So，between the nodal and extra-nodal sites，there were also no any significant difference detected in the GTBP and hMLH1expression(P>0.05).In high grade group，we have found8cases were positive for GTBP(8/12)and4cases positive for hMLH1(4/6).In the low grade group，the GTPB positive cells could be seen in7cases(7/9)and hMLH1positive cells also be found in8cases(8/9).hMLH1has more expression frequence in the low grade group than that in thehigh grade group(P<0.05)，but GTBP was not.Conclusion There are no any relationshipes between the B-cell lymphoma histological catˉegories、the location of tumor and the GTBP/hMLH1expression in the tumor cells.So we consider that hMLH1plays an important role in the pathogenesis of B-cell lymphoma.
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Key words B cell lymphoma mismatch repair gene GTBP hMLH1 immunohistochemistry
錯配修復(fù)(mismatch repair，MMR)是指細(xì)胞對復(fù)制錯誤進(jìn)行的修復(fù)，是生物體維持自身遺傳物質(zhì)穩(wěn)定性的重要機(jī)制。已被克隆的人類MMR基因共有6個，包括hMSH2、hMLH1、hPMS1、hPMS2、hMSH6(GTBP)、hMSH3。這些基因的缺陷可致復(fù)制后錯配修復(fù)功能喪失，引起細(xì)胞的高自發(fā)突變率，最終導(dǎo)致整個基因組的不穩(wěn)定性，產(chǎn)生突變體。其中最常見的突變體表型(mutatorphenotype)為微衛(wèi)星不穩(wěn)定性(Microsatellite Instability，MSI)。Boyer等報(bào)道證實(shí)錯配修復(fù)基因缺陷和微衛(wèi)星不穩(wěn)定性改變，兩者之間有著十分密切的關(guān)系。GTBP、hMLH1是已被克隆的人類MMR基因中的2個。GTBP蛋白染色定位在2p16，其功能是與hMSH2形成復(fù)合物，對應(yīng)的同源物為MutS;hMLH1蛋白染色體定位在3p21.3-23，其功能是與錯配點(diǎn)結(jié)合并修復(fù)，對應(yīng)的同源物為MutL [1] 。由于DNA錯配修復(fù)基因發(fā)生突變，對錯配的修復(fù)功能降低，導(dǎo)致微衛(wèi)星不穩(wěn)定性，在惡性腫瘤發(fā)生過程中的作用受到關(guān)注，因此，直接檢測腫瘤組織中MMR基因蛋白表達(dá)情況能更直觀地反映基因的功能狀況。目前國內(nèi)有關(guān)MMR和MSI在各型淋巴瘤中的研究較為少見，MMR和MSI在淋巴瘤發(fā)病學(xué)中的意義和作用仍有待進(jìn)一步探討。本研究的目的在于通過免疫組化方法檢測錯配修復(fù)基因GTBP、hMLH1蛋白在B細(xì)胞淋巴瘤組織中的表達(dá)情況，以期為結(jié)合MSI進(jìn)行綜合分析，提供理論參考依據(jù)。
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1 資料與方法
1.1 一般資料 標(biāo)本來自1998年1月～2003年11月遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院病理科的B細(xì)胞淋巴瘤檔案資料23例。男16例，女7例;年齡最大者69歲，最小8歲。平均年齡46.8歲。男∶女為2.3∶1。所有病例均根據(jù)2001年最新WHO分類，均經(jīng)病理組織學(xué)及免疫組織化學(xué)檢查確診。其中DLBCL12例，MALT3例，F(xiàn)L5例，BCLL/SLL1例，B-LBL/ALL1例，B-PLL1例。23例B細(xì)胞淋巴瘤中發(fā)生于淋巴結(jié)9例，其中頸部淋巴結(jié)有6例。其次分別發(fā)生于腹股溝及腸系膜和大網(wǎng)膜淋巴結(jié)。原發(fā)于淋巴結(jié)外的分布較廣，有14例，包括胃腸道、陰莖、右上肺葉腫塊、脾、胰尾等。所有患者術(shù)前均未經(jīng)過放射治療或化學(xué)治療。所有標(biāo)本均經(jīng)過10%的中性甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋。根據(jù)WHO分類 [1] ，高度惡性組13例(DLBCL12例，B-LBL/ALL1例)。低度惡性組10例(FL5例，BELL/SLL1例，MALT3例，B-PLL1例)。
, 百拇醫(yī)藥 1.2 方法
1.2.1 試劑來源 一抗GTBP、hMLH1均購自美國Santa Cruz Biotechnology公司。En Vinsion復(fù)合物和DAB顯色劑購于基因公司。
1.2.2 玻片處理 載玻片于10%重氯酸鉀液中浸泡12h，蓋玻片浸泡6h，自來水沖洗干凈后蒸餾水浸泡，70℃烤箱中烘干，每張玻片上涂抹一層多聚賴氨酸防脫片劑，室溫涼干備用。
1.2.3 化學(xué)處理 免疫組織化學(xué)進(jìn)行En Vinsion法染色。
1.3 染色結(jié)果的判定 細(xì)胞核出現(xiàn)彌漫性棕黃色或棕褐色細(xì)顆粒狀染色為陽性細(xì)胞，反之為陰性。陽性細(xì)胞≤25%標(biāo)記為(+);陽性細(xì)胞25%～50%標(biāo)記為(++)。陽性細(xì)胞>50%標(biāo)記為(+++)。
1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)嚴(yán)格按照統(tǒng)計(jì)學(xué)要求進(jìn)行收集、整理，建立數(shù)據(jù)庫。采用樣本率的四格表Fisher確切概率法檢驗(yàn)，P<0.05為對比組間的差異有顯著性。
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2 結(jié)果
2.1 23例B細(xì)胞淋巴瘤組織中GTBP、hMLH1表達(dá)結(jié)果 見表1。
表1 B細(xì)胞淋巴瘤組織中GTBP、hMLH1表達(dá)結(jié)果
圖1 DLBCL瘤細(xì)胞hMLH1 核陽性(ABC×200)
2.2 不同組織學(xué)類型B細(xì)胞淋巴瘤組織中GTBP、hMLH1蛋白的表達(dá) 見表2。
表2 不同組織類型GTBP、hMLH1表達(dá)
2.3 不同部位B細(xì)胞淋巴瘤組織中GTBP、hMLH1表達(dá)結(jié)果 見表3。
表3 不同部位GTBP、hMLH1表達(dá)
2.4 不同惡性程度B細(xì)胞淋巴瘤組織中GTBP、hMLH1表達(dá)結(jié)果 見表4。
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表4 不同惡性程度GTBP、hMLH1表達(dá)
注: ˇ 與低度惡性組比較P<0.05 高度惡性組13例，有8例GTBP蛋白表達(dá)(8/12)，4例hMLH1蛋白表達(dá)陽性(4/7)。低度惡性組10例，有7例GTBP蛋白表達(dá)陽性(7/9)，8例hMLH1蛋白表達(dá)陽性達(dá)(8/8)。GTBP蛋白表達(dá)在低度惡性組與高度惡性組中相比較差異無顯著性，P>0.05，hMLH1蛋白表達(dá)在低度惡性組與高度惡性組中相比較差異有顯著性，P<0.05。
3 討論
正常情況下，DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)是靠A-T，G-C之間的氫鍵互補(bǔ)配對而維持的，當(dāng)各種因素使DNA之間的堿基互補(bǔ)配對發(fā)生了錯誤，即形成了DNA的錯配。為保證DNA復(fù)制的忠實(shí)性，維持基因組的穩(wěn)定性，降低細(xì)胞的自發(fā)突變，需要對錯配的堿基進(jìn)行修復(fù)，即錯配修復(fù)。發(fā)揮這種作用的基因即錯配修復(fù)基因。當(dāng)錯配修復(fù)基因由于突變而不能發(fā)揮錯配修復(fù)功能時，將會出現(xiàn)微衛(wèi)星的不穩(wěn)定性。到目前為止，已發(fā)現(xiàn)至少有6種錯配修復(fù)基因與人類腫瘤的發(fā)生有關(guān)，即hMSH2、hMSH6(GTBP)、hMSH3、hMLH1、hPMS1、hPMS2。前3個與大腸桿菌MutS同源，后3個與MutL同源 [2] 。由于DNA復(fù)制、修復(fù)過程的復(fù)雜性，除了錯配修復(fù)功能缺陷外，導(dǎo)致MSI還可能存在其它機(jī)制，特別是對于大多數(shù)非結(jié)直腸癌的腫瘤，其MSI的產(chǎn)生可能與錯配修復(fù)功能無關(guān)。現(xiàn)有學(xué)者提出，廣泛、重度的DNA損傷超過了DNA的修復(fù)功能時，也可能出現(xiàn)MSI，這就是所謂的過飽和機(jī)制，在這種機(jī)制下DNA的錯配修復(fù)功能是完整的 [3] 。
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基因的突變將產(chǎn)生有缺陷的蛋白，從而不能發(fā)揮錯配修復(fù)功能，導(dǎo)致微衛(wèi)星DNA的不穩(wěn)定性，增加整個基因組的不穩(wěn)定性，從而引起包括癌基因及抑癌基因等一系列改變，當(dāng)突變積累到一定程度，就會導(dǎo)致細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化，發(fā)生多種腫瘤。hMLH1、GTBP是MMR基因中的2個。hMLH1基因是研究較多的一種，1994年由Bronner等在研究遺傳性非息肉形成性結(jié)、直腸癌的過程中發(fā)現(xiàn)，它定位于染色體的3p21.3-23，基因組DNA全長約58kb(不包括啟動子)，含19個外顯子，cDNA全長2484bp，編碼長度為2268bp的開放閱讀框架。hMLH1蛋白由756個氨基酸殘基組成，與酵母的MLH1蛋白有41%的同源性。研究表明，hMLH1在多種組織中均有表達(dá)。約30%的遺傳性非息肉性結(jié)直腸癌的發(fā)生與hMLH1基因的突變或缺失有關(guān)。其突變主要集中在15和16外顯子，約占hMLH1突變的50%，分別為點(diǎn)突變和移碼突變，70%的突變因形成終止密碼導(dǎo)致翻譯過早終止而產(chǎn)生不全的hMLH1蛋白。GTBP基因定位在2p16，其編碼蛋白GTBP分子量為162kD。GTBP的功能結(jié)合到DNA鏈上含有G/T錯配的部位，但是該功能的進(jìn)行需要與hMSH2形成復(fù)合物才能完成。
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本研究發(fā)現(xiàn)，DLBCL中GTBP蛋白表達(dá)(7/11)和hMLH1蛋白表達(dá)(3/6)，與FL GTBP蛋白表達(dá)(3/5)，hMLH1蛋白表達(dá)(4/4)，相比較進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，未發(fā)現(xiàn)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。由此推測，hMLH1和GTBP錯配修復(fù)基因蛋白表達(dá)與B細(xì)胞淋巴瘤組織學(xué)類型可能無關(guān)。其余MALT、BCLL/SLL、B-LBL/ALL以及B-PLL因例數(shù)太少，無法統(tǒng)計(jì)這幾種組織學(xué)類型中GTBP和hMLH1表達(dá)的差異，在此不作討論，有待增加病例數(shù)。B細(xì)胞淋巴瘤GTBP和hMLH1蛋白表達(dá)在結(jié)內(nèi)和結(jié)外之間沒有發(fā)現(xiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，也由此推斷MMR基因的表達(dá)與B細(xì)胞淋巴瘤發(fā)生的部位無關(guān)。有報(bào)道人群中hMLH1基因突變率平均為1:3139。也有研究結(jié)果顯示，hMLH1蛋白在肺癌組織中表達(dá)陽性率為58.3%，推測hMLH1表達(dá)低者多處于臨床晚期，預(yù)后較差 [4] 。另有研究表明，在卵巢上皮癌中，hMLH1的表達(dá)率為69.6%，有hMLH1基因表達(dá)的病例，腫瘤的惡性程度較低，預(yù)后較好 [5] 。還有研究顯示，hMLH1在肝細(xì)胞癌中陽性表達(dá)高達(dá)80%～88%，認(rèn)為hMLH1在肝細(xì)胞癌中的缺失是一種并非常見的分子現(xiàn)象 [6] 。有肝胎細(xì)胞中hMLH1表達(dá)較強(qiáng) [7] 。本研究中hMLH1蛋白表達(dá)在低度惡性B細(xì)胞淋巴瘤中高于高度惡性B細(xì)胞淋巴瘤，和大部分研究結(jié)果一致，說明hMLH1蛋白表達(dá)低的淋巴瘤類型浸潤性較強(qiáng)，預(yù)后較差。其原因可能是hMLH1蛋白不但參與了DNA的錯配修復(fù)，同時可能參與了腫瘤的分化過程。
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GTBP蛋白表達(dá)在B細(xì)胞淋巴瘤中高度惡性與低度惡性相比較，無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。結(jié)合GTBP的功能作用，推測GTBP在淋巴瘤的發(fā)生學(xué)上有重要作用，但沒有參與腫瘤細(xì)胞的分化過程。以上結(jié)果非常有趣，可以作為蛋白表達(dá)水平的研究資料提供給MSI分析者和同一課題組中癌基因和抑癌基因的研究者，以從分子水平更深入地探討惡性淋巴瘤的發(fā)生學(xué)機(jī)制。
國內(nèi)已在多種疾病方面展開關(guān)于MSI的研究 [8，9] ，但關(guān)于惡性淋巴瘤MSI的資料不多。MSI的研究主要集中在人的FAP及HNPCC。國外雖然在某些惡性淋巴瘤類型中作過MSI的研究 [10～12] ，但惡性淋巴瘤的分類復(fù)雜，特別是在中國，其發(fā)病情況和歐美等國家有較大差異，有關(guān)各種類型淋巴瘤染色體異常，分子遺傳學(xué)等方面的資料較少。通過對B細(xì)胞淋巴瘤MSI中的2個基因即GTBP、hMLH1蛋白進(jìn)行檢測，相信可以為全面認(rèn)識B細(xì)胞淋巴瘤的MSI提供一定的線索。
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作者單位:563003貴州遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院病理科
(收稿日期:2004-03-12)
(編輯元 紅), 百拇醫(yī)藥
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