病毒性肝炎臨床診治的基礎(chǔ)與應(yīng)用研究
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2005年7月21日
作者:姚集魯摘 要 病毒性肝炎是我國最重要的傳染病之一，可導(dǎo)致嚴(yán)重慢性肝病，并且與肝細(xì)胞癌密切相關(guān)。近5年來，我們改進(jìn)肝炎病毒核酸診斷技術(shù)，建立熱變性HCV RNA直接擴增技術(shù)、RT-PCR夾心斑點雜交技術(shù)、HBV前C區(qū)點突變檢測技術(shù)，以及克隆HCV、HGV基因序列。此外，對廣東甲型肝炎流行病學(xué)調(diào)查與輸血傳播HCV、HGV及TTV人群感染的情況、慢性HBV感染者病情反復(fù)發(fā)作的因素、HCV與肝癌關(guān)系、干擾素、Lamivudine的臨床治療觀察、基因治療的應(yīng)用基礎(chǔ)研究，以及中西醫(yī)結(jié)合治療病毒性肝炎等作了一系列研究。這些技術(shù)的改進(jìn)與研究成果，迅速應(yīng)用到臨床防治工作中，對當(dāng)前病毒性肝炎診治工作起到積極的推動作用。
目前我國病毒性肝炎感染情況仍然很嚴(yán)重。甲型肝炎總流行率為80.9%，乙型肝炎表面抗原攜帶率為9.75%估計實際人數(shù)超過1.2億，乙型肝炎病毒(HBV)感染總流行率為57.63%。丙型肝炎標(biāo)化流行率為3.2%，戊型肝炎為17.2%。目前又發(fā)現(xiàn)一些新的肝炎病毒，如庚型肝炎病毒(HGV)、TT病毒(TTV)等。感染肝炎病毒后所致慢性肝炎、肝硬化及肝細(xì)胞癌是造成眾多病人病情不愈、加重及死亡的主要原因。因而，病毒性肝炎的防治研究成為我國疾病控制的重大問題。本室過去5年來，在不斷追蹤國內(nèi)外最新研究技術(shù)與方法的基礎(chǔ)上，創(chuàng)建敏感的診斷技術(shù)，積極開展抗病毒治療，免疫病理研究等，對病毒性肝炎有關(guān)的臨床熱點問題進(jìn)行了一系列研究觀察，現(xiàn)分述如下。
1 診斷技術(shù)
1.1 改進(jìn)分子檢測技術(shù)
1.1.1 熱變性HCV RNA模板直接擴增法技術(shù) 徹底提純樣本或充分除去樣本中的抑制因子是巢式逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)檢測HCV RNA成功的關(guān)鍵。同時，在處理過程中，如何抑制RNase活性和避免污染也是至關(guān)重要的。我科采用直接裂解制備樣本進(jìn)行PCR擴增，加ρ=0.5%硫基乙醇進(jìn)行熱裂解來制備樣本，先用300 mg/L的蛋白酶K于55 ℃將血漿消化30 min再進(jìn)行熱變性，離心后，取上清液進(jìn)行RT-PCR擴增[1～3]。
本方法與目前常用的酸胍酚一步法比較，其敏感性與特異性一樣，檢出率相符，本法檢測僅需4 h，而酸胍酚法約需36 h，明顯縮短了時間。該法操作簡便，不易出現(xiàn)污染，由于操作簡化，有利推廣。
1.1.2 RT-PCR夾心斑點雜交技術(shù) 建立相應(yīng)的重組體。載體選用P t 7 t 3，將質(zhì)粒pUN中的HCV 5′端非編碼區(qū)300 bp的cDNA片段亞克隆到選用載體中。經(jīng)轉(zhuǎn)化、增殖，M13K07超感染，可從培養(yǎng)上清中制備純化重組的單鏈DNA ......
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