利用臍帶血穿刺標(biāo)本產(chǎn)前診斷杜氏肌營(yíng)養(yǎng)不良癥1例
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利用臍帶血穿刺標(biāo)本產(chǎn)前診斷杜氏肌營(yíng)養(yǎng)不良癥1例
北京大學(xué)人民醫(yī)院 劉國(guó)莉* 趙耘 劉春雨 黃振宇 張麗江
孕婦34歲，妊1產(chǎn)0，籍貫上海，家族中其舅舅、弟弟均患杜氏肌營(yíng)養(yǎng)不良癥(Duchenne muscular dystrophy，DMD)，皆于少年期死亡。本人非近親結(jié)婚，孕18周，要求產(chǎn)前診斷，轉(zhuǎn)入我院。孕期無特殊，B超提示胎兒與孕周相符、未見異常。入院后行B超引導(dǎo)下羊膜腔穿刺，診斷胎兒為男性后行胎兒臍帶血穿刺，抽取胎兒血化驗(yàn)肌酸磷酸肌酶，并按常規(guī)方法提取DNA。同時(shí)取孕婦外周血做DNA檢測(cè)。按照Beggs[1]和Chamberlain[2]方法設(shè)計(jì)了16對(duì)引物，包含肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白(dystrophin)基因啟動(dòng)子(Pm)、外顯子3、6、8、13、17、19、43-52(46、51除外)及60易發(fā)生基因缺失熱點(diǎn)區(qū)(引物由北京三博遠(yuǎn)志生物技術(shù)有限公司提供)。DNA PCR擴(kuò)增均分兩次在2個(gè)反應(yīng)管中進(jìn)行，分別用9對(duì)引物[1]和7對(duì)引物[2],前者方法同文獻(xiàn)1，后者方法與文獻(xiàn)2大體相同，只是將退火溫度改為54℃。取反應(yīng)液10μl和DNA 大小標(biāo)記物同時(shí)點(diǎn)樣于1.4%瓊脂糖凝膠中，80V電壓電泳1小時(shí)。結(jié)果：孕婦外周血和胎兒血結(jié)果見表1，顯示臍血CPK 523U/L，CK-MB 32U/L，LDH 403 U/L均顯著升高，AST輕度異常，孕婦相應(yīng)酶學(xué)亦有輕度改變。PCR擴(kuò)增結(jié)果如圖1示：胎兒外顯子47、50、52、45、48、49有基因缺失，孕婦為攜帶者，相應(yīng)條帶較正常陽(yáng)性對(duì)照的條帶有減弱。向家屬交代病情后，要求其終止妊娠，于孕23周行藥物引產(chǎn)，娩一男死胎，外觀未見明顯異常。
1. DNA Marker 2. 陽(yáng)性對(duì)照 3. 孕婦 1. DNA Marker 2. 陽(yáng)性對(duì)照 3. 孕婦
4. 胎兒 5. 陰性對(duì)照 4. 胎兒 5. 陰性對(duì)照
圖1 多重PCR擴(kuò)增電泳結(jié)果
表1：孕婦及胎兒相關(guān)肌酶指標(biāo)測(cè)定結(jié)果
受檢對(duì)象ALT(U/L)AST(U/L)CPK(U/L)LDH(U/L)α-羥丁酸脫氫酶(U/L)CPK-MB(U/L)孕 婦
胎 兒20
223
45719
523224
403150
24911
32各指標(biāo)
正常值0~400~4024~200114~24095~2700~5討論：
DMD是一種嚴(yán)重致死性X連鎖隱性遺傳病，發(fā)病率為1/3500活男嬰，臨床表現(xiàn)以肌肉進(jìn)行性萎縮和無力為特征，患者一般在20歲前死亡。由于本病目前尚無有效的治療方法，只能進(jìn)行產(chǎn)前基因診斷以杜絕患兒的出生。DMD基因位于Xp21區(qū)，長(zhǎng)2200kb，cDNA全長(zhǎng)14kb，含79個(gè)外顯子。已報(bào)道65%的基因突變?yōu)榇笃稳笔В?～10%為復(fù)制，25～30%為點(diǎn)突變、小缺失或小插入，基因突變的大熱點(diǎn)區(qū)為外顯子44～53、小熱點(diǎn)區(qū)位于基因5'端[3]。目前的基因檢測(cè)方法有多重PCR、定量多重PCR、Southern雜交、 RT-PCR、FISH等。國(guó)內(nèi)、外關(guān)于DMD產(chǎn)前基因診斷已有報(bào)道[4-6]：王敏等[4]應(yīng)用熒光標(biāo)記聚合酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增9個(gè)微衛(wèi)星片段，進(jìn)行基因型分析，成功診斷了1例DMD患病胎兒；曾溢滔等[5]在取得中國(guó)人Xp21區(qū)限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性基礎(chǔ)上，應(yīng)用連鎖分析對(duì)2例DMD高危妊娠進(jìn)行了產(chǎn)前診斷。鑒于60%的患者的基因異常為缺失，故建立1種簡(jiǎn)便而有效的缺失檢出方法具有重要意義。Beggs和Chamberlain設(shè)計(jì)了18對(duì)引物[1, 2]，可使缺失病例的檢出率達(dá)到90%以上。本文中未包含該基因的外顯子4、12、51，增添了外顯子50來進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果顯示缺失的分布主要集中在外顯子47、50、52、45、48、49，與國(guó)外的基因缺失熱點(diǎn)區(qū)分布相似，結(jié)合臍血肌酶結(jié)果，考慮該胎兒為DMD患兒，予以終止妊娠。Emery等[7]對(duì)高危DMD的胎兒血的CPK數(shù)值及肌肉活檢結(jié)果進(jìn)行了研究，結(jié)果提示單純根據(jù)胎兒血肌酶結(jié)果診斷DMD存在假陰性，應(yīng)結(jié)合病理檢查或分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果來綜合判斷。據(jù)我們所知，本實(shí)驗(yàn)是國(guó)內(nèi)第一例應(yīng)用臍帶血穿刺標(biāo)本，同時(shí)進(jìn)行胎兒肌酶化驗(yàn)及基因檢測(cè)來診斷DMD患病胎兒。實(shí)驗(yàn)中應(yīng)用的多重PCR方法，在數(shù)小時(shí)內(nèi)可檢出DMD基因的缺失，且操作簡(jiǎn)便，勿需特別儀器，擴(kuò)增后對(duì)結(jié)果的判定也比較直觀和容易，因此多重PCR是一種簡(jiǎn)便、快速、適于推廣的檢測(cè)DMD基因缺失的方法。但該方法不能解決非缺失病例的診斷，可進(jìn)一步通過擴(kuò)增微衛(wèi)星片段或在限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性基礎(chǔ)上應(yīng)用連鎖分析進(jìn)行DMD的產(chǎn)前診斷。
由于孕婦為攜帶者，出院后需在指導(dǎo)下進(jìn)行下次妊娠：(1)人工受精，進(jìn)行精子性別選擇，去除"Y"精子，使其孕女嬰，可靠性約80%；同時(shí)對(duì)女嬰進(jìn)行產(chǎn)前診斷，檢出致病基因攜帶者的幾率為50%。(2)如受孕仍為男性，再次發(fā)生同樣疾病的可能性為50%，故必須經(jīng)產(chǎn)前診斷，如可排除致病基因缺陷，證實(shí)該男胎正常，其后代可不再受此病困擾。
參考文獻(xiàn)：
1. Beggs AH, Koenig M, Boyce FM, et al. Detection of 98% of DMD/BMD gene deletions by polymerase chain reaction. Hum Genet, 1990, 86: 45-48.
2. Chamberlain JS, Gibbs RA, Ranier JE, et al. Deletion screening of the Duchenne muscular dystrophy locus via multiplex DNA amplification. Nucleic Acids Res, 1988, 23: 11141-11156 ......
利用臍帶血穿刺標(biāo)本產(chǎn)前診斷杜氏肌營(yíng)養(yǎng)不良癥1例
北京大學(xué)人民醫(yī)院 劉國(guó)莉* 趙耘 劉春雨 黃振宇 張麗江
孕婦34歲，妊1產(chǎn)0，籍貫上海，家族中其舅舅、弟弟均患杜氏肌營(yíng)養(yǎng)不良癥(Duchenne muscular dystrophy，DMD)，皆于少年期死亡。本人非近親結(jié)婚，孕18周，要求產(chǎn)前診斷，轉(zhuǎn)入我院。孕期無特殊，B超提示胎兒與孕周相符、未見異常。入院后行B超引導(dǎo)下羊膜腔穿刺，診斷胎兒為男性后行胎兒臍帶血穿刺，抽取胎兒血化驗(yàn)肌酸磷酸肌酶，并按常規(guī)方法提取DNA。同時(shí)取孕婦外周血做DNA檢測(cè)。按照Beggs[1]和Chamberlain[2]方法設(shè)計(jì)了16對(duì)引物，包含肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白(dystrophin)基因啟動(dòng)子(Pm)、外顯子3、6、8、13、17、19、43-52(46、51除外)及60易發(fā)生基因缺失熱點(diǎn)區(qū)(引物由北京三博遠(yuǎn)志生物技術(shù)有限公司提供)。DNA PCR擴(kuò)增均分兩次在2個(gè)反應(yīng)管中進(jìn)行，分別用9對(duì)引物[1]和7對(duì)引物[2],前者方法同文獻(xiàn)1，后者方法與文獻(xiàn)2大體相同，只是將退火溫度改為54℃。取反應(yīng)液10μl和DNA 大小標(biāo)記物同時(shí)點(diǎn)樣于1.4%瓊脂糖凝膠中，80V電壓電泳1小時(shí)。結(jié)果：孕婦外周血和胎兒血結(jié)果見表1，顯示臍血CPK 523U/L，CK-MB 32U/L，LDH 403 U/L均顯著升高，AST輕度異常，孕婦相應(yīng)酶學(xué)亦有輕度改變。PCR擴(kuò)增結(jié)果如圖1示：胎兒外顯子47、50、52、45、48、49有基因缺失，孕婦為攜帶者，相應(yīng)條帶較正常陽(yáng)性對(duì)照的條帶有減弱。向家屬交代病情后，要求其終止妊娠，于孕23周行藥物引產(chǎn)，娩一男死胎，外觀未見明顯異常。
1. DNA Marker 2. 陽(yáng)性對(duì)照 3. 孕婦 1. DNA Marker 2. 陽(yáng)性對(duì)照 3. 孕婦
4. 胎兒 5. 陰性對(duì)照 4. 胎兒 5. 陰性對(duì)照
圖1 多重PCR擴(kuò)增電泳結(jié)果
表1：孕婦及胎兒相關(guān)肌酶指標(biāo)測(cè)定結(jié)果
受檢對(duì)象ALT(U/L)AST(U/L)CPK(U/L)LDH(U/L)α-羥丁酸脫氫酶(U/L)CPK-MB(U/L)孕 婦
胎 兒20
223
45719
523224
403150
24911
32各指標(biāo)
正常值0~400~4024~200114~24095~2700~5討論：
DMD是一種嚴(yán)重致死性X連鎖隱性遺傳病，發(fā)病率為1/3500活男嬰，臨床表現(xiàn)以肌肉進(jìn)行性萎縮和無力為特征，患者一般在20歲前死亡。由于本病目前尚無有效的治療方法，只能進(jìn)行產(chǎn)前基因診斷以杜絕患兒的出生。DMD基因位于Xp21區(qū)，長(zhǎng)2200kb，cDNA全長(zhǎng)14kb，含79個(gè)外顯子。已報(bào)道65%的基因突變?yōu)榇笃稳笔В?～10%為復(fù)制，25～30%為點(diǎn)突變、小缺失或小插入，基因突變的大熱點(diǎn)區(qū)為外顯子44～53、小熱點(diǎn)區(qū)位于基因5'端[3]。目前的基因檢測(cè)方法有多重PCR、定量多重PCR、Southern雜交、 RT-PCR、FISH等。國(guó)內(nèi)、外關(guān)于DMD產(chǎn)前基因診斷已有報(bào)道[4-6]：王敏等[4]應(yīng)用熒光標(biāo)記聚合酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增9個(gè)微衛(wèi)星片段，進(jìn)行基因型分析，成功診斷了1例DMD患病胎兒；曾溢滔等[5]在取得中國(guó)人Xp21區(qū)限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性基礎(chǔ)上，應(yīng)用連鎖分析對(duì)2例DMD高危妊娠進(jìn)行了產(chǎn)前診斷。鑒于60%的患者的基因異常為缺失，故建立1種簡(jiǎn)便而有效的缺失檢出方法具有重要意義。Beggs和Chamberlain設(shè)計(jì)了18對(duì)引物[1, 2]，可使缺失病例的檢出率達(dá)到90%以上。本文中未包含該基因的外顯子4、12、51，增添了外顯子50來進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果顯示缺失的分布主要集中在外顯子47、50、52、45、48、49，與國(guó)外的基因缺失熱點(diǎn)區(qū)分布相似，結(jié)合臍血肌酶結(jié)果，考慮該胎兒為DMD患兒，予以終止妊娠。Emery等[7]對(duì)高危DMD的胎兒血的CPK數(shù)值及肌肉活檢結(jié)果進(jìn)行了研究，結(jié)果提示單純根據(jù)胎兒血肌酶結(jié)果診斷DMD存在假陰性，應(yīng)結(jié)合病理檢查或分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果來綜合判斷。據(jù)我們所知，本實(shí)驗(yàn)是國(guó)內(nèi)第一例應(yīng)用臍帶血穿刺標(biāo)本，同時(shí)進(jìn)行胎兒肌酶化驗(yàn)及基因檢測(cè)來診斷DMD患病胎兒。實(shí)驗(yàn)中應(yīng)用的多重PCR方法，在數(shù)小時(shí)內(nèi)可檢出DMD基因的缺失，且操作簡(jiǎn)便，勿需特別儀器，擴(kuò)增后對(duì)結(jié)果的判定也比較直觀和容易，因此多重PCR是一種簡(jiǎn)便、快速、適于推廣的檢測(cè)DMD基因缺失的方法。但該方法不能解決非缺失病例的診斷，可進(jìn)一步通過擴(kuò)增微衛(wèi)星片段或在限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性基礎(chǔ)上應(yīng)用連鎖分析進(jìn)行DMD的產(chǎn)前診斷。
由于孕婦為攜帶者，出院后需在指導(dǎo)下進(jìn)行下次妊娠：(1)人工受精，進(jìn)行精子性別選擇，去除"Y"精子，使其孕女嬰，可靠性約80%；同時(shí)對(duì)女嬰進(jìn)行產(chǎn)前診斷，檢出致病基因攜帶者的幾率為50%。(2)如受孕仍為男性，再次發(fā)生同樣疾病的可能性為50%，故必須經(jīng)產(chǎn)前診斷，如可排除致病基因缺陷，證實(shí)該男胎正常，其后代可不再受此病困擾。
參考文獻(xiàn)：
1. Beggs AH, Koenig M, Boyce FM, et al. Detection of 98% of DMD/BMD gene deletions by polymerase chain reaction. Hum Genet, 1990, 86: 45-48.
2. Chamberlain JS, Gibbs RA, Ranier JE, et al. Deletion screening of the Duchenne muscular dystrophy locus via multiplex DNA amplification. Nucleic Acids Res, 1988, 23: 11141-11156 ......
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