短小芽孢桿菌作試驗菌測定四環(huán)素類抗生素效價
作者:傅燕芳 張正潔 張玉良 李曉珍
單位:張正潔張玉良(西安制藥廠);傅燕芳 李曉珍(西安市藥品檢驗所 西安 710054)
關鍵詞:四環(huán)素類抗生素;短小芽孢桿菌;藤黃微球菌;微生物檢定法;
摘要 采用管碟法 摘要 采用管碟法,測定短小芽孢桿菌對四環(huán)素類抗生素的敏感度,并與藤黃微球菌進行比較。結果概率分析表明,兩種試驗菌測定的效價無顯著差異,表明短小芽孢桿菌法優(yōu)于中國藥典1995年版方法。
四環(huán)素類抗生素(土霉素、金霉素、四環(huán)素等)微生物檢定法采用的試驗菌種,各國藥典規(guī)定不一。英國藥典〔1〕采用短小芽孢桿菌(Bacillus pumilus),美國藥典〔2〕采用金黃葡萄球菌(Staphylococcus aureus),日本標準〔3〕與中國藥典〔4〕均采用藤黃微球菌(Micrococcus lutea)。鑒于以藤黃微球菌作試驗菌存在諸多缺點(菌種容易變異、培養(yǎng)時間長、抑菌圈邊緣欠清晰、測定結果誤差大),而英美兩國藥典所收載的色譜法〔1,2〕在我國目前又難于普及,本文試用短小芽孢桿菌作為四環(huán)素類抗生素效價測定的試驗菌種,并獲較滿意結果。
, 百拇醫(yī)藥
1 材料
1.1 藥品 四環(huán)素類抗生素(西安藥廠、光華藥廠及福州抗生素廠等,包括原料藥、片劑、軟膏);四環(huán)素類抗生素標準品(中國藥品生物制品檢定所)。
1.2 實驗菌株 短小芽孢桿菌〔CMCC(B)63202〕(按中國藥典1995版二部附錄72頁方法制成透光率為25%的菌液);藤黃微球菌〔CMCC(B)28001〕(制成透光率為20%的菌液)。
1.3 培養(yǎng)基 Ⅰ號培養(yǎng)基pH 7.8~8.0,Ⅱ號培養(yǎng)基pH 6.6(中國藥品生物制品檢定所)。
1.4 磷酸鹽緩沖液 pH6.0緩沖液(KH2PO4 8 g,K2HPO4 2 g,加水至1L;pH8.0緩沖液(KH2PO4 0.523 g,K2HPO4 16.73 g,加水至1L);pH 4.5緩沖液(KH2PO4 13.6 g,加水至1L)。
, 百拇醫(yī)藥
2 方法
采用短小芽孢桿菌:一劑量法〔5〕測定四環(huán)素與土霉素效價的標準曲線劑間比例為1∶0.8,中心濃度為8 u/ml,濃度范圍為4~20 u/ml。二劑量法〔4〕高低劑量分別為8,4 u/ml。一劑量法測定金霉素效價的標準曲線劑間比例為1∶0.8,中心濃度為1 u/ml,濃度范圍為0.25~10 u/ml。二劑量法高低劑量分別為1,0.5 u/ml。
采用藤黃微球菌:標準曲線制備同中國藥典1977年版,二劑量法按中國藥典1995年版操作。
2 結果
2.1 抑菌圈 采用pH6.0磷酸鹽緩沖液及Ⅱ號培養(yǎng)基,短小芽孢桿菌的抑菌圈清晰度較好。按2%~3%比例將短小芽孢桿菌液加入培養(yǎng)基作為菌層,35℃~37℃的條件下培養(yǎng)14~16 h,所得到的抑菌圈大小較為合適(表1)。
, 百拇醫(yī)藥
表1 短小芽孢桿菌測定抑菌圈直徑(mm) 樣品
菌液加入量(%)
高劑量
低劑量
四環(huán)素
2
22
19
土霉素
2
21
18
金霉素
, http://www.www.srpcoatings.com
3
20
17
2.2 試驗菌測定的標準曲線 見表2。表2 兩種試驗菌標準曲線斜率 樣品
短小芽孢桿菌
藤黃微球菌
四環(huán)素
1.67
1.41
土霉素
1.13
1.18
, 百拇醫(yī)藥
金霉素
1.36
1.49
2.3 兩種試驗菌測定的效價 表3~5。 表3 兩種試驗菌測定土霉素效價對比 樣品*
序號
短小芽孢菌
藤黃微球菌
差值
片劑
(%)
1
72.3
, 百拇醫(yī)藥
73.9
-1.6
2
93.6
93.1
0.5
3
69.2
69.5
-0.3
4
98.3
100.1
, 百拇醫(yī)藥
-1.8
5
82.2
79.7
2.5
6
95.4
93.1
2.3
7
81.3
82.6
-1.3
, 百拇醫(yī)藥
8
81.9
81.5
0.4
9
92.0
91.0
1.0
10
101.9
102.8
-0.9
原料
, 百拇醫(yī)藥
(u/mg)
11
93.8
92.4
1.4
12
878
878
0
13
876
874
4
, 百拇醫(yī)藥
14
876
875
1
15
874
873
1
16
865
875
-10
17
859
, http://www.www.srpcoatings.com
875
-10
注:*序號12~17樣品數據由西安光華制藥廠提供表4 兩種試驗菌測定四環(huán)素效價對比 樣品*
序號
短小芽孢桿菌
藤黃微球菌
差值
片劑
(%)
1
78.5
76.4
, http://www.www.srpcoatings.com
2.1
2
97.1
91.7
5.4
3
86.2
89.1
-2.9
4
94.2
95.8
-1.6
, 百拇醫(yī)藥
5
81.3
82.6
-1.3
6
85.2
86.1
0.9
原料
(u/mg)
7
999
978
, 百拇醫(yī)藥
21
8
986
978
8
9
986
976
10
10
976
979
-3
11
, 百拇醫(yī)藥
994
989
5
12
988
979
9
13
991
988
3
14
983
979
, 百拇醫(yī)藥
4
15
985
979
6
16
986
980
6
17
987
981
6
18
, 百拇醫(yī)藥
976
970
6
粗制品
19
716
704
-12
(u/mg)
20
682
681
1
, http://www.www.srpcoatings.com 注:*序號8~19樣品數據由西安制藥廠提供表5 兩種試驗菌測定金霉素效價對比 樣品
序號
短小芽孢桿菌
藤黃微球菌
差值
原料
(u/mg)
1
890.0
896.8
-6.0
2
, http://www.www.srpcoatings.com
877.1
893.6
-16.5
3
881.0
884.0
-3
4
871.0
868.2
2.8
5
888.6
, 百拇醫(yī)藥
873.4
15.2
6
906.7
916.9
-10.2
軟膏(%)
7
103.8
103.8
0
2.4 雜質含量測定 結果見表6。表6 兩種試驗菌測定四環(huán)素產品雜質含量結果(u/mg) 雜質名稱
, http://www.www.srpcoatings.com
短小芽孢桿菌
藤黃微球菌
差值
4-差向四環(huán)素
394.8
372.0
22.8
脫水差向四環(huán)素
5.9
6.0
-0.1
脫水四環(huán)素
17.6
, 百拇醫(yī)藥
7.6
10.0
4 討論與小結
①表2顯示,兩種試驗菌測定結果無顯著差異,曲線斜率均較穩(wěn)定,兩條直線互相平行。②表3~表5列出四環(huán)素(20批)、土霉素(17批)及金霉素(7批)的考核數據。概率分析表明,兩種試驗菌測定的效價無顯著差異(P>0.05)。③四環(huán)素類抗生素不夠穩(wěn)定,尤其是四環(huán)素與金霉素的差向化均較快,產品中差向金霉素含量可高達16%~17%。表6顯示,兩種試驗菌對各種雜質的敏感度無明顯差異(表中脫水四環(huán)素之測定含量兩項數據,有待進一步予以驗證)。④四環(huán)類抗生素微生物檢定法改用短小芽孢桿菌測定的優(yōu)點在于:菌液穩(wěn)定,可保存較長時間,供隨時取用,無需臨時制備;菌種靈敏;抑菌圈成形快(培養(yǎng)時間短于15 h);抑菌圈清晰,邊緣整齊,便于準確測量,故而誤差小,復試率低;菌液耐溫,可在70℃左右的培養(yǎng)基上攤布菌層。
參考文獻
1 BP 1993:150,472,661;A166
2 USP ⅩⅩⅢ,1995:1510,621(1221)
3 日本抗生物質醫(yī)藥品基準解說1990:333
4 中國藥典1995年版二部.1995:附錄70~74
5 中國藥典1977年版二部.1997:附錄
(收稿:1998-07-08), 百拇醫(yī)藥
單位:張正潔張玉良(西安制藥廠);傅燕芳 李曉珍(西安市藥品檢驗所 西安 710054)
關鍵詞:四環(huán)素類抗生素;短小芽孢桿菌;藤黃微球菌;微生物檢定法;
摘要 采用管碟法 摘要 采用管碟法,測定短小芽孢桿菌對四環(huán)素類抗生素的敏感度,并與藤黃微球菌進行比較。結果概率分析表明,兩種試驗菌測定的效價無顯著差異,表明短小芽孢桿菌法優(yōu)于中國藥典1995年版方法。
四環(huán)素類抗生素(土霉素、金霉素、四環(huán)素等)微生物檢定法采用的試驗菌種,各國藥典規(guī)定不一。英國藥典〔1〕采用短小芽孢桿菌(Bacillus pumilus),美國藥典〔2〕采用金黃葡萄球菌(Staphylococcus aureus),日本標準〔3〕與中國藥典〔4〕均采用藤黃微球菌(Micrococcus lutea)。鑒于以藤黃微球菌作試驗菌存在諸多缺點(菌種容易變異、培養(yǎng)時間長、抑菌圈邊緣欠清晰、測定結果誤差大),而英美兩國藥典所收載的色譜法〔1,2〕在我國目前又難于普及,本文試用短小芽孢桿菌作為四環(huán)素類抗生素效價測定的試驗菌種,并獲較滿意結果。
, 百拇醫(yī)藥
1 材料
1.1 藥品 四環(huán)素類抗生素(西安藥廠、光華藥廠及福州抗生素廠等,包括原料藥、片劑、軟膏);四環(huán)素類抗生素標準品(中國藥品生物制品檢定所)。
1.2 實驗菌株 短小芽孢桿菌〔CMCC(B)63202〕(按中國藥典1995版二部附錄72頁方法制成透光率為25%的菌液);藤黃微球菌〔CMCC(B)28001〕(制成透光率為20%的菌液)。
1.3 培養(yǎng)基 Ⅰ號培養(yǎng)基pH 7.8~8.0,Ⅱ號培養(yǎng)基pH 6.6(中國藥品生物制品檢定所)。
1.4 磷酸鹽緩沖液 pH6.0緩沖液(KH2PO4 8 g,K2HPO4 2 g,加水至1L;pH8.0緩沖液(KH2PO4 0.523 g,K2HPO4 16.73 g,加水至1L);pH 4.5緩沖液(KH2PO4 13.6 g,加水至1L)。
, 百拇醫(yī)藥
2 方法
采用短小芽孢桿菌:一劑量法〔5〕測定四環(huán)素與土霉素效價的標準曲線劑間比例為1∶0.8,中心濃度為8 u/ml,濃度范圍為4~20 u/ml。二劑量法〔4〕高低劑量分別為8,4 u/ml。一劑量法測定金霉素效價的標準曲線劑間比例為1∶0.8,中心濃度為1 u/ml,濃度范圍為0.25~10 u/ml。二劑量法高低劑量分別為1,0.5 u/ml。
采用藤黃微球菌:標準曲線制備同中國藥典1977年版,二劑量法按中國藥典1995年版操作。
2 結果
2.1 抑菌圈 采用pH6.0磷酸鹽緩沖液及Ⅱ號培養(yǎng)基,短小芽孢桿菌的抑菌圈清晰度較好。按2%~3%比例將短小芽孢桿菌液加入培養(yǎng)基作為菌層,35℃~37℃的條件下培養(yǎng)14~16 h,所得到的抑菌圈大小較為合適(表1)。
, 百拇醫(yī)藥
表1 短小芽孢桿菌測定抑菌圈直徑(mm) 樣品
菌液加入量(%)
高劑量
低劑量
四環(huán)素
2
22
19
土霉素
2
21
18
金霉素
, http://www.www.srpcoatings.com
3
20
17
2.2 試驗菌測定的標準曲線 見表2。表2 兩種試驗菌標準曲線斜率 樣品
短小芽孢桿菌
藤黃微球菌
四環(huán)素
1.67
1.41
土霉素
1.13
1.18
, 百拇醫(yī)藥
金霉素
1.36
1.49
2.3 兩種試驗菌測定的效價 表3~5。 表3 兩種試驗菌測定土霉素效價對比 樣品*
序號
短小芽孢菌
藤黃微球菌
差值
片劑
(%)
1
72.3
, 百拇醫(yī)藥
73.9
-1.6
2
93.6
93.1
0.5
3
69.2
69.5
-0.3
4
98.3
100.1
, 百拇醫(yī)藥
-1.8
5
82.2
79.7
2.5
6
95.4
93.1
2.3
7
81.3
82.6
-1.3
, 百拇醫(yī)藥
8
81.9
81.5
0.4
9
92.0
91.0
1.0
10
101.9
102.8
-0.9
原料
, 百拇醫(yī)藥
(u/mg)
11
93.8
92.4
1.4
12
878
878
0
13
876
874
4
, 百拇醫(yī)藥
14
876
875
1
15
874
873
1
16
865
875
-10
17
859
, http://www.www.srpcoatings.com
875
-10
注:*序號12~17樣品數據由西安光華制藥廠提供表4 兩種試驗菌測定四環(huán)素效價對比 樣品*
序號
短小芽孢桿菌
藤黃微球菌
差值
片劑
(%)
1
78.5
76.4
, http://www.www.srpcoatings.com
2.1
2
97.1
91.7
5.4
3
86.2
89.1
-2.9
4
94.2
95.8
-1.6
, 百拇醫(yī)藥
5
81.3
82.6
-1.3
6
85.2
86.1
0.9
原料
(u/mg)
7
999
978
, 百拇醫(yī)藥
21
8
986
978
8
9
986
976
10
10
976
979
-3
11
, 百拇醫(yī)藥
994
989
5
12
988
979
9
13
991
988
3
14
983
979
, 百拇醫(yī)藥
4
15
985
979
6
16
986
980
6
17
987
981
6
18
, 百拇醫(yī)藥
976
970
6
粗制品
19
716
704
-12
(u/mg)
20
682
681
1
, http://www.www.srpcoatings.com 注:*序號8~19樣品數據由西安制藥廠提供表5 兩種試驗菌測定金霉素效價對比 樣品
序號
短小芽孢桿菌
藤黃微球菌
差值
原料
(u/mg)
1
890.0
896.8
-6.0
2
, http://www.www.srpcoatings.com
877.1
893.6
-16.5
3
881.0
884.0
-3
4
871.0
868.2
2.8
5
888.6
, 百拇醫(yī)藥
873.4
15.2
6
906.7
916.9
-10.2
軟膏(%)
7
103.8
103.8
0
2.4 雜質含量測定 結果見表6。表6 兩種試驗菌測定四環(huán)素產品雜質含量結果(u/mg) 雜質名稱
, http://www.www.srpcoatings.com
短小芽孢桿菌
藤黃微球菌
差值
4-差向四環(huán)素
394.8
372.0
22.8
脫水差向四環(huán)素
5.9
6.0
-0.1
脫水四環(huán)素
17.6
, 百拇醫(yī)藥
7.6
10.0
4 討論與小結
①表2顯示,兩種試驗菌測定結果無顯著差異,曲線斜率均較穩(wěn)定,兩條直線互相平行。②表3~表5列出四環(huán)素(20批)、土霉素(17批)及金霉素(7批)的考核數據。概率分析表明,兩種試驗菌測定的效價無顯著差異(P>0.05)。③四環(huán)素類抗生素不夠穩(wěn)定,尤其是四環(huán)素與金霉素的差向化均較快,產品中差向金霉素含量可高達16%~17%。表6顯示,兩種試驗菌對各種雜質的敏感度無明顯差異(表中脫水四環(huán)素之測定含量兩項數據,有待進一步予以驗證)。④四環(huán)類抗生素微生物檢定法改用短小芽孢桿菌測定的優(yōu)點在于:菌液穩(wěn)定,可保存較長時間,供隨時取用,無需臨時制備;菌種靈敏;抑菌圈成形快(培養(yǎng)時間短于15 h);抑菌圈清晰,邊緣整齊,便于準確測量,故而誤差小,復試率低;菌液耐溫,可在70℃左右的培養(yǎng)基上攤布菌層。
參考文獻
1 BP 1993:150,472,661;A166
2 USP ⅩⅩⅢ,1995:1510,621(1221)
3 日本抗生物質醫(yī)藥品基準解說1990:333
4 中國藥典1995年版二部.1995:附錄70~74
5 中國藥典1977年版二部.1997:附錄
(收稿:1998-07-08), 百拇醫(yī)藥