甲狀腺素對脾虛小鼠脾細(xì)胞和胸腺細(xì)胞表達(dá)IL-3 mRNA的影響
作者：章梅 夏天 靳風(fēng)爍 顏真 吳少華 張仲海
單位：章 梅 夏 天 吳少華 張仲海 (中國人民解放軍第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院中醫(yī)科 陜西省西安市 710033)； 顏 真 (中國人民解放軍第四軍醫(yī)大學(xué)生物技術(shù)中心)； 靳風(fēng)爍 (中國人民解放軍第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院泌外科)
關(guān)鍵詞：甲狀腺素；脾虛；白細(xì)胞介素-3；核糖核酸，信使
世界華人消化雜志991231 Subject headings thyroxine; spleen asthenia; interleukin-3 mRNA
中國圖書館分類號 R256.3
白介素3(IL-3)是一種多功能造血干細(xì)胞刺激因子，因而具有調(diào)節(jié)體內(nèi)造血功能的作用[1].甲狀腺素可通過神經(jīng)內(nèi)分泌免疫調(diào)節(jié)環(huán)路改善造血功能.為探討甲狀腺素對脾虛小鼠脾細(xì)胞和胸腺細(xì)胞IL-3表達(dá)的影響，我們在ConA刺激的脾細(xì)胞和胸腺細(xì)胞中加入甲狀腺素，用斑點(diǎn)雜交法檢測其對脾虛小鼠脾細(xì)胞和胸腺細(xì)胞IL-3 mRNA的影響.
, http://www.www.srpcoatings.com
1 材料和方法
1.1 材料 BALB/c 6周齡～8周齡純系♂小鼠，體質(zhì)量19g±3g，由本校動物中心提供.甲狀腺素T3，使用T3放免藥盒標(biāo)準(zhǔn)品，上海原子能研究所生產(chǎn)；RPMI 1640培養(yǎng)液，美國Gibco；新生牛血清，杭州四季青制品廠，分裝-20℃凍存；ConA美國Sigma；IL-3基因探針，靳風(fēng)爍博士惠贈；總RNA提取試劑盒Promaga.
1.2 方法 將24只BALB/c小鼠隨機(jī)分為3組，每組8只.①正常組(controls)：皮下注射生理鹽水0.2mL/d，同時灌服蒸餾水0.25mL/d；②脾虛組(MMSA)：皮下注射利舍平(利血平)0.3mg/(kg.d)，并灌服蒸餾水0.25mL/d；③四君子湯治療組(MTSD)：皮下注射利舍平0.3mg/(kg.d)，并灌服四君子湯煎液0.25mL/d(含生藥1g)，于d6始，脾虛組小鼠出現(xiàn)食少，少動諸癥狀，于d12脾虛組小鼠稀便，少動，食少，體重減輕等脾虛諸癥明顯加重，而治療組及正常組均無此表現(xiàn).脾細(xì)胞懸液制備按常規(guī)方法進(jìn)行[2].細(xì)胞懸于加15g/L小牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基中，濃度為8×109/L，用進(jìn)口24孔培養(yǎng)板培養(yǎng)，每孔加相應(yīng)細(xì)胞懸液100μL，ConA 50μL，甲狀腺素50μL.每孔終體積為200μL(同時設(shè)不加甲狀腺素的陰性對照孔，每個樣品均設(shè)3個復(fù)孔)，在37℃ 50mL/L CO2，飽和濕度條件下靜止培養(yǎng)20h.細(xì)胞總RNA提取按試劑盒說明進(jìn)行，分別收集各孔細(xì)胞，PBS 5mL洗滌2次；加1mL變性液裂解細(xì)胞；加0.1體積2mol/L NaAc(pH4.0)及等體積酚-氯仿-異戊醇抽提；冰浴15min，10000r/min，4℃離心20min；上層水相加等體積異丙醇，-20℃過夜；10000r/min，4℃離心20min；加0.5mL變性液溶解RNA，加0.5mL異丙醇1h沉淀RNA；10000r/min，40℃離心15min，沉淀洗滌，抽干，保存于100μL TE液中(-20℃).取樣本RNA 10μL，加1kg/L甲酰胺20μL，370g/L甲醛7μL，2×SSC 2μL，68℃作用15min，然后用裂隙式點(diǎn)樣器在20×SSC處理過的硝酸纖維素膜上點(diǎn)樣，自然干燥后于80℃烘烤2h，按Dig試劑盒法進(jìn)行預(yù)雜交、雜交、洗膜，顯色，24h觀察結(jié)果.雜交結(jié)果用HPVectra PC微機(jī)圖象處理系統(tǒng)進(jìn)行光密度掃描，用曝光斑點(diǎn)的平均A值(OD值)X面積代表脾細(xì)胞IL-3 mRNA的相對含量.
, 百拇醫(yī)藥
2 結(jié)果
脾虛組脾淋巴細(xì)胞生成IL-3 mRNA較正常組明顯低下，四君子湯治療組較脾虛組明顯升高，與正常組無顯著差異(P>0.05，表1).在甲狀腺素作用下，3組IL-3 mRNA表達(dá)水平相近，無顯著差別，但加入T3后，相對增加的表達(dá)水平則脾虛組明顯大于正常組和四君子湯治療組(P<0.05，表2).
表1 三組小鼠淋巴細(xì)胞生成IL-3 mRNA比較 (n=8，
±s) 組別
IL-3 mRNA
脾
胸腺
對照組
, 百拇醫(yī)藥
36.81±5.32
0.941±0.003
MMSA
26.83±4.17bd
0.402±0.003bd
MTSD
35.96±3.29
0.944±0.002
bP<0.01，vs對照；dP<0.01，vs MTSD.
表2 甲狀腺素對三組小鼠淋巴細(xì)胞生成IL-3 mRNA作用比較 (n=8,±s) 組別
, 百拇醫(yī)藥
IL-3mRNA
相對增加的表達(dá)水平
脾
胸腺
脾
胸腺
對照組
52.28±4.17
1.763±0.087
15.54±2.13
0.742±0.013
MMSA
, 百拇醫(yī)藥 53.16±3.94
1.772±0.065
26.83±4.25b
1.253±0.24b
MTSD
54.45±4.92
1.779±0.058
19.18±4.16a
0.974±0.021a
aP<0.05，bP<0.01，vs 對照.
, 百拇醫(yī)藥
3 討論
白介素3主要由絲裂原或抗原刺激后的T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生[1]，它參與調(diào)節(jié)多功能造血干細(xì)胞和各系祖細(xì)胞的分化、增殖，因而具有調(diào)節(jié)造血的功能[3]T細(xì)胞受抗原或有絲分裂刺激后產(chǎn)生的多種因子中，IL-3與造血的關(guān)系最為密切.IL-3是一種糖蛋白質(zhì)，又稱多功能造血干細(xì)胞刺激因子.它作用于骨髓衍化的多功能造血干細(xì)胞各系祖細(xì)胞，刺激其增殖，分化[4]，影響淋巴細(xì)胞的生長和活化[5]，作用于成熟粒細(xì)胞促進(jìn)其功能活性[6]，促進(jìn)造血干細(xì)胞的自我更新[7].本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，脾虛時脾細(xì)胞或胸腺細(xì)胞IL-3 mRNA的表達(dá)低于正常組，四君子湯治療組和正常組則無明顯差異，說明脾虛時機(jī)體的造血功能是低下的，而健脾(四君子湯治療后)可明顯提高脾細(xì)胞和胸腺細(xì)胞IL-3 mRNA的表達(dá)，說明脾與造血功能有密切關(guān)系.進(jìn)一步研究表明，在培養(yǎng)的小鼠脾或胸腺細(xì)胞中加入T3，即在甲狀腺素作用下，3組IL-3 mRNA相對增加的表達(dá)水平則脾虛組明顯大于正常組和四君子湯治療組(P<0.01)，進(jìn)一步證明甲狀腺作為一種內(nèi)分泌激素通過神經(jīng)內(nèi)分泌免疫調(diào)節(jié)環(huán)路改善低下的造血功能，使之達(dá)到平衡狀態(tài).甲狀腺素的作用與機(jī)體的狀態(tài)有關(guān)，對不同造血狀態(tài)的機(jī)體，甲狀腺素能發(fā)揮相應(yīng)的調(diào)節(jié)作用.同時研究表明四君子湯治療組和正常組的脾或胸腺淋巴細(xì)胞在加入甲狀腺素后的IL-3 mRNA的表達(dá)具有顯著差異(P<0.05)，結(jié)果說明四君子湯亦參與造血功能的調(diào)節(jié)，表明其對淋巴細(xì)胞IL-3 mRNA表達(dá)有一定促進(jìn)作用，四君子湯是通過健脾增加脾的運(yùn)化功能而調(diào)節(jié)造血功能的.
, 百拇醫(yī)藥
我們的研究結(jié)果表明，脾虛與機(jī)體的造血功能有密切關(guān)系，脾虛時存在T淋巴細(xì)胞IL-3 mRNA表達(dá)下降，而甲狀腺素可改善T淋巴細(xì)胞IL-3 mRNA的表達(dá)，改善造血功能，通過神經(jīng)內(nèi)分泌免疫調(diào)節(jié)環(huán)路共同組成的反饋環(huán)路，使機(jī)體維持于自穩(wěn)態(tài)，與中醫(yī)脾主運(yùn)化，化氣生血即脾生血的理論認(rèn)識相符合，有助于從神經(jīng)內(nèi)分泌免疫調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)和分子水平的角度加深對脾本質(zhì)的認(rèn)識.
通訊作者 章梅
參考文獻(xiàn)
1 Nicola NA，Vadas M.Hemopoietic colony-stimulating factors.Immunol Today，1984;5:76
2 Sideras P，Susanne BL，Severinson E.Partial biochemical characterization of lgG inducing factor.Eur J Immunol，1985;15:593
, 百拇醫(yī)藥
3 Yokotao T，Lee F，Rennick D.Isolation and characterization of a mouse cDNA clone that express mast cell growth factor activity in monkey cells.Proc Natl Acad Sci USA，1984;81:1070
4 Messner HA，Kamo Y，Jama IN. Growth of human hemopoietic colonies in response to recombiant gibbon IL.Proc Natl Acad Sci USA，1987;84:6765
5 Rothenberg ME，Nwen WF，Silberstein DS.Human eosinophils have prolonged survival，enhanced functional properties.J Clin Invest，1988;81:1986
6 Kobayashi M，Van Leemwen BH，Elsburg S.IL-3 is more effective than other colony stimulating factors derived colony-forming cell in vivo.Blood，1989;73:1836
7 Valent P，Schmidt G，Besemer J.IL-3 is a differentiation factor for human basophils.Blood，1989;73:1763
收稿日期 1998-11-20, http://www.www.srpcoatings.com
單位：章 梅 夏 天 吳少華 張仲海 (中國人民解放軍第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院中醫(yī)科 陜西省西安市 710033)； 顏 真 (中國人民解放軍第四軍醫(yī)大學(xué)生物技術(shù)中心)； 靳風(fēng)爍 (中國人民解放軍第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院泌外科)
關(guān)鍵詞：甲狀腺素；脾虛；白細(xì)胞介素-3；核糖核酸，信使
世界華人消化雜志991231 Subject headings thyroxine; spleen asthenia; interleukin-3 mRNA
中國圖書館分類號 R256.3
白介素3(IL-3)是一種多功能造血干細(xì)胞刺激因子，因而具有調(diào)節(jié)體內(nèi)造血功能的作用[1].甲狀腺素可通過神經(jīng)內(nèi)分泌免疫調(diào)節(jié)環(huán)路改善造血功能.為探討甲狀腺素對脾虛小鼠脾細(xì)胞和胸腺細(xì)胞IL-3表達(dá)的影響，我們在ConA刺激的脾細(xì)胞和胸腺細(xì)胞中加入甲狀腺素，用斑點(diǎn)雜交法檢測其對脾虛小鼠脾細(xì)胞和胸腺細(xì)胞IL-3 mRNA的影響.
, http://www.www.srpcoatings.com
1 材料和方法
1.1 材料 BALB/c 6周齡～8周齡純系♂小鼠，體質(zhì)量19g±3g，由本校動物中心提供.甲狀腺素T3，使用T3放免藥盒標(biāo)準(zhǔn)品，上海原子能研究所生產(chǎn)；RPMI 1640培養(yǎng)液，美國Gibco；新生牛血清，杭州四季青制品廠，分裝-20℃凍存；ConA美國Sigma；IL-3基因探針，靳風(fēng)爍博士惠贈；總RNA提取試劑盒Promaga.
1.2 方法 將24只BALB/c小鼠隨機(jī)分為3組，每組8只.①正常組(controls)：皮下注射生理鹽水0.2mL/d，同時灌服蒸餾水0.25mL/d；②脾虛組(MMSA)：皮下注射利舍平(利血平)0.3mg/(kg.d)，并灌服蒸餾水0.25mL/d；③四君子湯治療組(MTSD)：皮下注射利舍平0.3mg/(kg.d)，并灌服四君子湯煎液0.25mL/d(含生藥1g)，于d6始，脾虛組小鼠出現(xiàn)食少，少動諸癥狀，于d12脾虛組小鼠稀便，少動，食少，體重減輕等脾虛諸癥明顯加重，而治療組及正常組均無此表現(xiàn).脾細(xì)胞懸液制備按常規(guī)方法進(jìn)行[2].細(xì)胞懸于加15g/L小牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基中，濃度為8×109/L，用進(jìn)口24孔培養(yǎng)板培養(yǎng)，每孔加相應(yīng)細(xì)胞懸液100μL，ConA 50μL，甲狀腺素50μL.每孔終體積為200μL(同時設(shè)不加甲狀腺素的陰性對照孔，每個樣品均設(shè)3個復(fù)孔)，在37℃ 50mL/L CO2，飽和濕度條件下靜止培養(yǎng)20h.細(xì)胞總RNA提取按試劑盒說明進(jìn)行，分別收集各孔細(xì)胞，PBS 5mL洗滌2次；加1mL變性液裂解細(xì)胞；加0.1體積2mol/L NaAc(pH4.0)及等體積酚-氯仿-異戊醇抽提；冰浴15min，10000r/min，4℃離心20min；上層水相加等體積異丙醇，-20℃過夜；10000r/min，4℃離心20min；加0.5mL變性液溶解RNA，加0.5mL異丙醇1h沉淀RNA；10000r/min，40℃離心15min，沉淀洗滌，抽干，保存于100μL TE液中(-20℃).取樣本RNA 10μL，加1kg/L甲酰胺20μL，370g/L甲醛7μL，2×SSC 2μL，68℃作用15min，然后用裂隙式點(diǎn)樣器在20×SSC處理過的硝酸纖維素膜上點(diǎn)樣，自然干燥后于80℃烘烤2h，按Dig試劑盒法進(jìn)行預(yù)雜交、雜交、洗膜，顯色，24h觀察結(jié)果.雜交結(jié)果用HPVectra PC微機(jī)圖象處理系統(tǒng)進(jìn)行光密度掃描，用曝光斑點(diǎn)的平均A值(OD值)X面積代表脾細(xì)胞IL-3 mRNA的相對含量.
, 百拇醫(yī)藥
2 結(jié)果
脾虛組脾淋巴細(xì)胞生成IL-3 mRNA較正常組明顯低下，四君子湯治療組較脾虛組明顯升高，與正常組無顯著差異(P>0.05，表1).在甲狀腺素作用下，3組IL-3 mRNA表達(dá)水平相近，無顯著差別，但加入T3后，相對增加的表達(dá)水平則脾虛組明顯大于正常組和四君子湯治療組(P<0.05，表2).
表1 三組小鼠淋巴細(xì)胞生成IL-3 mRNA比較 (n=8，
±s) 組別IL-3 mRNA
脾
胸腺
對照組
, 百拇醫(yī)藥
36.81±5.32
0.941±0.003
MMSA
26.83±4.17bd
0.402±0.003bd
MTSD
35.96±3.29
0.944±0.002
bP<0.01，vs對照；dP<0.01，vs MTSD.
表2 甲狀腺素對三組小鼠淋巴細(xì)胞生成IL-3 mRNA作用比較 (n=8,
±s) 組別, 百拇醫(yī)藥
IL-3mRNA
相對增加的表達(dá)水平
脾
胸腺
脾
胸腺
對照組
52.28±4.17
1.763±0.087
15.54±2.13
0.742±0.013
MMSA
, 百拇醫(yī)藥 53.16±3.94
1.772±0.065
26.83±4.25b
1.253±0.24b
MTSD
54.45±4.92
1.779±0.058
19.18±4.16a
0.974±0.021a
aP<0.05，bP<0.01，vs 對照.
, 百拇醫(yī)藥
3 討論
白介素3主要由絲裂原或抗原刺激后的T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生[1]，它參與調(diào)節(jié)多功能造血干細(xì)胞和各系祖細(xì)胞的分化、增殖，因而具有調(diào)節(jié)造血的功能[3]T細(xì)胞受抗原或有絲分裂刺激后產(chǎn)生的多種因子中，IL-3與造血的關(guān)系最為密切.IL-3是一種糖蛋白質(zhì)，又稱多功能造血干細(xì)胞刺激因子.它作用于骨髓衍化的多功能造血干細(xì)胞各系祖細(xì)胞，刺激其增殖，分化[4]，影響淋巴細(xì)胞的生長和活化[5]，作用于成熟粒細(xì)胞促進(jìn)其功能活性[6]，促進(jìn)造血干細(xì)胞的自我更新[7].本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，脾虛時脾細(xì)胞或胸腺細(xì)胞IL-3 mRNA的表達(dá)低于正常組，四君子湯治療組和正常組則無明顯差異，說明脾虛時機(jī)體的造血功能是低下的，而健脾(四君子湯治療后)可明顯提高脾細(xì)胞和胸腺細(xì)胞IL-3 mRNA的表達(dá)，說明脾與造血功能有密切關(guān)系.進(jìn)一步研究表明，在培養(yǎng)的小鼠脾或胸腺細(xì)胞中加入T3，即在甲狀腺素作用下，3組IL-3 mRNA相對增加的表達(dá)水平則脾虛組明顯大于正常組和四君子湯治療組(P<0.01)，進(jìn)一步證明甲狀腺作為一種內(nèi)分泌激素通過神經(jīng)內(nèi)分泌免疫調(diào)節(jié)環(huán)路改善低下的造血功能，使之達(dá)到平衡狀態(tài).甲狀腺素的作用與機(jī)體的狀態(tài)有關(guān)，對不同造血狀態(tài)的機(jī)體，甲狀腺素能發(fā)揮相應(yīng)的調(diào)節(jié)作用.同時研究表明四君子湯治療組和正常組的脾或胸腺淋巴細(xì)胞在加入甲狀腺素后的IL-3 mRNA的表達(dá)具有顯著差異(P<0.05)，結(jié)果說明四君子湯亦參與造血功能的調(diào)節(jié)，表明其對淋巴細(xì)胞IL-3 mRNA表達(dá)有一定促進(jìn)作用，四君子湯是通過健脾增加脾的運(yùn)化功能而調(diào)節(jié)造血功能的.
, 百拇醫(yī)藥
我們的研究結(jié)果表明，脾虛與機(jī)體的造血功能有密切關(guān)系，脾虛時存在T淋巴細(xì)胞IL-3 mRNA表達(dá)下降，而甲狀腺素可改善T淋巴細(xì)胞IL-3 mRNA的表達(dá)，改善造血功能，通過神經(jīng)內(nèi)分泌免疫調(diào)節(jié)環(huán)路共同組成的反饋環(huán)路，使機(jī)體維持于自穩(wěn)態(tài)，與中醫(yī)脾主運(yùn)化，化氣生血即脾生血的理論認(rèn)識相符合，有助于從神經(jīng)內(nèi)分泌免疫調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)和分子水平的角度加深對脾本質(zhì)的認(rèn)識.
通訊作者 章梅
參考文獻(xiàn)
1 Nicola NA，Vadas M.Hemopoietic colony-stimulating factors.Immunol Today，1984;5:76
2 Sideras P，Susanne BL，Severinson E.Partial biochemical characterization of lgG inducing factor.Eur J Immunol，1985;15:593
, 百拇醫(yī)藥
3 Yokotao T，Lee F，Rennick D.Isolation and characterization of a mouse cDNA clone that express mast cell growth factor activity in monkey cells.Proc Natl Acad Sci USA，1984;81:1070
4 Messner HA，Kamo Y，Jama IN. Growth of human hemopoietic colonies in response to recombiant gibbon IL.Proc Natl Acad Sci USA，1987;84:6765
5 Rothenberg ME，Nwen WF，Silberstein DS.Human eosinophils have prolonged survival，enhanced functional properties.J Clin Invest，1988;81:1986
6 Kobayashi M，Van Leemwen BH，Elsburg S.IL-3 is more effective than other colony stimulating factors derived colony-forming cell in vivo.Blood，1989;73:1836
7 Valent P，Schmidt G，Besemer J.IL-3 is a differentiation factor for human basophils.Blood，1989;73:1763
收稿日期 1998-11-20, http://www.www.srpcoatings.com