人直腸癌細(xì)胞HR-8348導(dǎo)入p16基因?qū)?xì)胞周期的影響及其意義
作者：王青 吳金生 賴(lài)大年 馬慶久 要秀 潘伯榮
單位：中國(guó)人民解放軍第四軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院普通外科 陜西省西安市 710038
關(guān)鍵詞：直腸腫瘤；p16基因；細(xì)胞周期
世界華人消化雜志991229
中國(guó)圖書(shū)館分類(lèi)號(hào) R735.37
Subject headings rectal neoplasms; p16 gene; cyclin cycle; HR-8348 cell line
目前發(fā)現(xiàn)，在各類(lèi)腫瘤中多腫瘤抑制基因(MTS1)變異率最高(75%)，其相對(duì)分子量最小，是唯一直接抑制腫瘤細(xì)胞增殖周期的細(xì)胞固有蛋白，利于導(dǎo)入，重組和標(biāo)記，在腫瘤基因治療中具有廣闊的前景.我們用脂質(zhì)體包裹法通過(guò)構(gòu)建的MTS1真核表達(dá)載體pcDNA3將p16基因?qū)肴酥蹦c腺癌細(xì)胞系HR-8348中，用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)，分析轉(zhuǎn)染后HR-8348細(xì)胞周期變化及意義.
, 百拇醫(yī)藥
1 材料和方法
1.1 材料 人直腸腺癌細(xì)胞系HR-8348由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤研究所提供.pUC19-P16質(zhì)粒和pcDNA3真核表達(dá)載體由第四軍醫(yī)大學(xué)生化教研室提供.Plasmid Purification Kit購(gòu)自上海華順公司，PCR Purification Kit購(gòu)自Clontech公司.BamHⅠ，EcoRⅠ，T4DNA Ligase，XbaⅠ，HindⅢ,DNA及其他常用試劑購(gòu)自Promega公司和華美公司.脂染素(lipofectin)購(gòu)自北京東方公司.
1.2 方法
1.2.1 MTS1真核表達(dá)載體的構(gòu)建和鑒定 將pUC19-P16質(zhì)粒切下的片段回收，用連接酶將其和pcDNA3真核表達(dá)載體酶切回收的片段連接.將構(gòu)建的MTS1真核表達(dá)載體命名為pcDNA16，并經(jīng)EcoRⅠ，BamHⅠ雙酶切進(jìn)行初步鑒定.再將陽(yáng)性克隆重新提取質(zhì)粒，以XbaⅠ和BamHⅠ，EcoRⅠ和HindⅢ分別雙酶切進(jìn)行進(jìn)一步鑒定.
, 百拇醫(yī)藥
1.2.2 HR-8348細(xì)胞的轉(zhuǎn)染及細(xì)胞周期檢測(cè) 人直腸腺癌細(xì)胞系HR-8348常規(guī)復(fù)蘇培養(yǎng)傳代，制成1×108/L細(xì)胞懸液接種于25mL培養(yǎng)瓶，待細(xì)胞鋪滿(mǎn)瓶底70%時(shí)，更換新鮮培養(yǎng)液培養(yǎng)4h，無(wú)血清培養(yǎng)基洗滌，無(wú)菌條件下，按脂染素說(shuō)明書(shū)操作加入pcDNA16 8μg和脂染素20μL，加入無(wú)血清培養(yǎng)液混勻后加入待轉(zhuǎn)染細(xì)胞，常規(guī)培養(yǎng)24h后再加入胎牛血清繼續(xù)培養(yǎng)48h.同時(shí)轉(zhuǎn)染空載體pcDNA3作為對(duì)照，將HR-8348，HR-8348-pcDNA3，HR-8348-pcDNA16細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)液洗滌后，胰酶消化，制成單細(xì)胞懸液.用Profile Ⅱ型流式細(xì)胞儀檢測(cè).
2 結(jié)果
2.1 載體構(gòu)建及鑒定 將pUC19-p16及pcDNA3酶切片段連接轉(zhuǎn)化后經(jīng)EcoRⅠ，BamHⅠ雙酶切可收到450 bp者即為陽(yáng)性克隆，再提取質(zhì)粒，以XbaⅠ和BamHⅠ，EcoRⅠ和HindⅢ分別雙酶切均可收到450bp片段，表明構(gòu)建正確.將構(gòu)建的真核表達(dá)載體命名為pcDNA16.
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2.2 HR-8348細(xì)胞轉(zhuǎn)染p16基因后細(xì)胞周期變化 HR-8348細(xì)胞及轉(zhuǎn)染空載體的HR-8348-pcDNA3細(xì)胞的S期指數(shù)分別是37.7，28.9，增殖指數(shù)分別是0.61，0.57；轉(zhuǎn)染pcDNA16細(xì)胞的S期指數(shù)是10.0(P<0.01)，增殖指數(shù)是0.41.
3 討論
細(xì)胞周期負(fù)調(diào)控與抑癌基因密切相關(guān)，P16蛋白作為CDK的抑制物，當(dāng)同細(xì)胞周期素D競(jìng)爭(zhēng)與CDK4結(jié)合后，抑制其活性，使CDK4不能催化Rb蛋白磷酸化，阻止細(xì)胞由G1期進(jìn)入S期，從而抑制細(xì)胞分裂生長(zhǎng)[1-3].進(jìn)一步的研究表明，P16INK4編碼的蛋白是CDK4的抑制因子，直接調(diào)控細(xì)胞增殖周期[4].在間皮瘤細(xì)胞(M9K)等3株細(xì)胞系中，轉(zhuǎn)染表達(dá)P16INK4 cDNA的載體后，其克隆形成效率受到抑制[5].Poulos et al[6]以p16基因轉(zhuǎn)染人成膠質(zhì)細(xì)胞瘤細(xì)胞系，有77.5%發(fā)生了G→S期阻滯.國(guó)內(nèi)也有作者將p16基因?qū)氚螂装┘?xì)胞和胃癌細(xì)胞.使表達(dá)外源性P16的裸鼠致瘤作用明顯受到抑制[7，8]，我們?cè)褂迷謊t al[9]構(gòu)建的MTS1逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)載體轉(zhuǎn)染人直腸癌細(xì)胞和膽管癌細(xì)胞.在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)該載體轉(zhuǎn)染效率較低，轉(zhuǎn)染細(xì)胞陽(yáng)性克隆的篩選及傳代均較困難，為此，我們構(gòu)建了MTS1真核表達(dá)載體pcDNA16，同樣，該載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞陽(yáng)性克隆的篩選及傳代仍較困難.目前，構(gòu)建逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞異質(zhì)性載體的方法包括構(gòu)建逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)載體，真核表達(dá)載體及腺病毒表達(dá)載體等.對(duì)于結(jié)直腸癌，由于p16基因5＇CpG島從頭甲基化可能是基因失活的主要或唯一方式[10，11]，如果轉(zhuǎn)染中聯(lián)合應(yīng)用脫甲基劑，轉(zhuǎn)染效率，陽(yáng)性克隆篩選及傳代可能會(huì)得到提高.因此轉(zhuǎn)染效率的提高，陽(yáng)性克隆篩選的成功及傳代的穩(wěn)定可能不僅僅取決于載體種類(lèi)的差異.此外，可能更主要的是p16作為抑癌基因，是目前為止唯一直接抑制腫瘤發(fā)生的細(xì)胞固有成分，在導(dǎo)入腫瘤細(xì)胞后，對(duì)腫瘤細(xì)胞具有直接抑制作用，故難以篩選和傳代.但在急性實(shí)驗(yàn)中，轉(zhuǎn)染后的HR-8348細(xì)胞周期中S期指數(shù)及增殖指數(shù)明顯降低，腫瘤細(xì)胞的DNA合成及惡性增殖受到抑制，表明導(dǎo)入外源性p16基因后，可抑制直腸癌細(xì)胞的分裂增殖，為開(kāi)展消化道腫瘤的基因治療提供了重要依據(jù).
, http://www.www.srpcoatings.com
通訊作者 王青
參考文獻(xiàn)
1 Kamb A，Gruis NA，Weaver Feldhaus J，Liu Q，Harshman K，Tavtigian SV，Stockert E，Day RS 3rd，Johnson BE，Skolnick MH.A cell cycle regulator potentially involved in genesis of many tumor types.Science，1994;264:436-440
2 Nobori T，Miura K，Wu DJ，Lois A，Takabayashi K，Carson DA.Deletion of the cyclin dependent kinase-4 inhibitor gene in multiple human cancers.Nature，1994;368:753-756
, 百拇醫(yī)藥
3 Marx J.A challenge to p16 gene as a major tumor suppressor.Science，1994;264:1846
4 Spillare EA，Okamoto A，Hagiwara K，Demetrick DJ，Serrano M，Beach D，Harris CC.Suppression of growth in vitro and tumorigenicity in vivo of human carcinoma cell lines by transfected P16INK4.Mol-Carcinog，1996;16:53-60
5 Lois AF，Rosenbach M，Miura K，Michimata H，Carson DA，Nobori T.Structural functional analysis of the P16 tumor suppressor.Cancer Res，1995;36(Suppl):575
, 百拇醫(yī)藥
6 Poulos NE，F(xiàn)armer AA，Chan KW，Stanbridge EJ.Design of a novel bicistronic expression vector with demonstration of a p16INK4-induced G(1)-S block(1).Cancer Res，1996;56:1719-1723
7 Yuan JL，Hui HX，Wang JB，Yu MS，Chai YB，Shao GX，Wang ZK，Wang CJ，Xin JG.Inhibitory effects of wild-type MTS1 on human bladder cancer line.Zhonghua Miniao Waike Zazhi，1997;9:545-548
8 Li WM，Lu YY.Introduction of Rb，p53，p16 and H-ras antisense RNA suppresses tumorigenicity in human gastric cancer lines.Zhongguo Zhongliu Shengwu Zhiliao Zazhi，1997;4:90-94
, 百拇醫(yī)藥
9 Yuan JL，Chai YB，Yu MS，Hui HX.Construction and identification of retroviral expression vector of MTS1.Zhonghua Miniao Zazhi，1996;17:395
10 Gonzalez Zulueta M，Bender CM，Yang AS，Nguyen T，Beart RW，Van Tornout JM，Jones PA.Methylation of the 5＇CpG island of the P16/CDKN2 tumor suppressor gene in normal and transformed human tissues correlates with gene silencing.Cancer Res，1995;55:4531-4535
11 Ahuja N，Mohan AL，Li Q，Stolker JM，Herman JG，Hamilton SR，Baylin SB，Issa JP.Association between CpG island methylation and microsatellite instability in colorectal cancer.Cancer Res，1997;57:3370-3374
收稿日期 1999-11-08, http://www.www.srpcoatings.com
單位：中國(guó)人民解放軍第四軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院普通外科 陜西省西安市 710038
關(guān)鍵詞：直腸腫瘤；p16基因；細(xì)胞周期
世界華人消化雜志991229
中國(guó)圖書(shū)館分類(lèi)號(hào) R735.37
Subject headings rectal neoplasms; p16 gene; cyclin cycle; HR-8348 cell line
目前發(fā)現(xiàn)，在各類(lèi)腫瘤中多腫瘤抑制基因(MTS1)變異率最高(75%)，其相對(duì)分子量最小，是唯一直接抑制腫瘤細(xì)胞增殖周期的細(xì)胞固有蛋白，利于導(dǎo)入，重組和標(biāo)記，在腫瘤基因治療中具有廣闊的前景.我們用脂質(zhì)體包裹法通過(guò)構(gòu)建的MTS1真核表達(dá)載體pcDNA3將p16基因?qū)肴酥蹦c腺癌細(xì)胞系HR-8348中，用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)，分析轉(zhuǎn)染后HR-8348細(xì)胞周期變化及意義.
, 百拇醫(yī)藥
1 材料和方法
1.1 材料 人直腸腺癌細(xì)胞系HR-8348由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤研究所提供.pUC19-P16質(zhì)粒和pcDNA3真核表達(dá)載體由第四軍醫(yī)大學(xué)生化教研室提供.Plasmid Purification Kit購(gòu)自上海華順公司，PCR Purification Kit購(gòu)自Clontech公司.BamHⅠ，EcoRⅠ，T4DNA Ligase，XbaⅠ，HindⅢ,DNA及其他常用試劑購(gòu)自Promega公司和華美公司.脂染素(lipofectin)購(gòu)自北京東方公司.
1.2 方法
1.2.1 MTS1真核表達(dá)載體的構(gòu)建和鑒定 將pUC19-P16質(zhì)粒切下的片段回收，用連接酶將其和pcDNA3真核表達(dá)載體酶切回收的片段連接.將構(gòu)建的MTS1真核表達(dá)載體命名為pcDNA16，并經(jīng)EcoRⅠ，BamHⅠ雙酶切進(jìn)行初步鑒定.再將陽(yáng)性克隆重新提取質(zhì)粒，以XbaⅠ和BamHⅠ，EcoRⅠ和HindⅢ分別雙酶切進(jìn)行進(jìn)一步鑒定.
, 百拇醫(yī)藥
1.2.2 HR-8348細(xì)胞的轉(zhuǎn)染及細(xì)胞周期檢測(cè) 人直腸腺癌細(xì)胞系HR-8348常規(guī)復(fù)蘇培養(yǎng)傳代，制成1×108/L細(xì)胞懸液接種于25mL培養(yǎng)瓶，待細(xì)胞鋪滿(mǎn)瓶底70%時(shí)，更換新鮮培養(yǎng)液培養(yǎng)4h，無(wú)血清培養(yǎng)基洗滌，無(wú)菌條件下，按脂染素說(shuō)明書(shū)操作加入pcDNA16 8μg和脂染素20μL，加入無(wú)血清培養(yǎng)液混勻后加入待轉(zhuǎn)染細(xì)胞，常規(guī)培養(yǎng)24h后再加入胎牛血清繼續(xù)培養(yǎng)48h.同時(shí)轉(zhuǎn)染空載體pcDNA3作為對(duì)照，將HR-8348，HR-8348-pcDNA3，HR-8348-pcDNA16細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)液洗滌后，胰酶消化，制成單細(xì)胞懸液.用Profile Ⅱ型流式細(xì)胞儀檢測(cè).
2 結(jié)果
2.1 載體構(gòu)建及鑒定 將pUC19-p16及pcDNA3酶切片段連接轉(zhuǎn)化后經(jīng)EcoRⅠ，BamHⅠ雙酶切可收到450 bp者即為陽(yáng)性克隆，再提取質(zhì)粒，以XbaⅠ和BamHⅠ，EcoRⅠ和HindⅢ分別雙酶切均可收到450bp片段，表明構(gòu)建正確.將構(gòu)建的真核表達(dá)載體命名為pcDNA16.
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2.2 HR-8348細(xì)胞轉(zhuǎn)染p16基因后細(xì)胞周期變化 HR-8348細(xì)胞及轉(zhuǎn)染空載體的HR-8348-pcDNA3細(xì)胞的S期指數(shù)分別是37.7，28.9，增殖指數(shù)分別是0.61，0.57；轉(zhuǎn)染pcDNA16細(xì)胞的S期指數(shù)是10.0(P<0.01)，增殖指數(shù)是0.41.
3 討論
細(xì)胞周期負(fù)調(diào)控與抑癌基因密切相關(guān)，P16蛋白作為CDK的抑制物，當(dāng)同細(xì)胞周期素D競(jìng)爭(zhēng)與CDK4結(jié)合后，抑制其活性，使CDK4不能催化Rb蛋白磷酸化，阻止細(xì)胞由G1期進(jìn)入S期，從而抑制細(xì)胞分裂生長(zhǎng)[1-3].進(jìn)一步的研究表明，P16INK4編碼的蛋白是CDK4的抑制因子，直接調(diào)控細(xì)胞增殖周期[4].在間皮瘤細(xì)胞(M9K)等3株細(xì)胞系中，轉(zhuǎn)染表達(dá)P16INK4 cDNA的載體后，其克隆形成效率受到抑制[5].Poulos et al[6]以p16基因轉(zhuǎn)染人成膠質(zhì)細(xì)胞瘤細(xì)胞系，有77.5%發(fā)生了G→S期阻滯.國(guó)內(nèi)也有作者將p16基因?qū)氚螂装┘?xì)胞和胃癌細(xì)胞.使表達(dá)外源性P16的裸鼠致瘤作用明顯受到抑制[7，8]，我們?cè)褂迷謊t al[9]構(gòu)建的MTS1逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)載體轉(zhuǎn)染人直腸癌細(xì)胞和膽管癌細(xì)胞.在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)該載體轉(zhuǎn)染效率較低，轉(zhuǎn)染細(xì)胞陽(yáng)性克隆的篩選及傳代均較困難，為此，我們構(gòu)建了MTS1真核表達(dá)載體pcDNA16，同樣，該載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞陽(yáng)性克隆的篩選及傳代仍較困難.目前，構(gòu)建逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞異質(zhì)性載體的方法包括構(gòu)建逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)載體，真核表達(dá)載體及腺病毒表達(dá)載體等.對(duì)于結(jié)直腸癌，由于p16基因5＇CpG島從頭甲基化可能是基因失活的主要或唯一方式[10，11]，如果轉(zhuǎn)染中聯(lián)合應(yīng)用脫甲基劑，轉(zhuǎn)染效率，陽(yáng)性克隆篩選及傳代可能會(huì)得到提高.因此轉(zhuǎn)染效率的提高，陽(yáng)性克隆篩選的成功及傳代的穩(wěn)定可能不僅僅取決于載體種類(lèi)的差異.此外，可能更主要的是p16作為抑癌基因，是目前為止唯一直接抑制腫瘤發(fā)生的細(xì)胞固有成分，在導(dǎo)入腫瘤細(xì)胞后，對(duì)腫瘤細(xì)胞具有直接抑制作用，故難以篩選和傳代.但在急性實(shí)驗(yàn)中，轉(zhuǎn)染后的HR-8348細(xì)胞周期中S期指數(shù)及增殖指數(shù)明顯降低，腫瘤細(xì)胞的DNA合成及惡性增殖受到抑制，表明導(dǎo)入外源性p16基因后，可抑制直腸癌細(xì)胞的分裂增殖，為開(kāi)展消化道腫瘤的基因治療提供了重要依據(jù).
, http://www.www.srpcoatings.com
通訊作者 王青
參考文獻(xiàn)
1 Kamb A，Gruis NA，Weaver Feldhaus J，Liu Q，Harshman K，Tavtigian SV，Stockert E，Day RS 3rd，Johnson BE，Skolnick MH.A cell cycle regulator potentially involved in genesis of many tumor types.Science，1994;264:436-440
2 Nobori T，Miura K，Wu DJ，Lois A，Takabayashi K，Carson DA.Deletion of the cyclin dependent kinase-4 inhibitor gene in multiple human cancers.Nature，1994;368:753-756
, 百拇醫(yī)藥
3 Marx J.A challenge to p16 gene as a major tumor suppressor.Science，1994;264:1846
4 Spillare EA，Okamoto A，Hagiwara K，Demetrick DJ，Serrano M，Beach D，Harris CC.Suppression of growth in vitro and tumorigenicity in vivo of human carcinoma cell lines by transfected P16INK4.Mol-Carcinog，1996;16:53-60
5 Lois AF，Rosenbach M，Miura K，Michimata H，Carson DA，Nobori T.Structural functional analysis of the P16 tumor suppressor.Cancer Res，1995;36(Suppl):575
, 百拇醫(yī)藥
6 Poulos NE，F(xiàn)armer AA，Chan KW，Stanbridge EJ.Design of a novel bicistronic expression vector with demonstration of a p16INK4-induced G(1)-S block(1).Cancer Res，1996;56:1719-1723
7 Yuan JL，Hui HX，Wang JB，Yu MS，Chai YB，Shao GX，Wang ZK，Wang CJ，Xin JG.Inhibitory effects of wild-type MTS1 on human bladder cancer line.Zhonghua Miniao Waike Zazhi，1997;9:545-548
8 Li WM，Lu YY.Introduction of Rb，p53，p16 and H-ras antisense RNA suppresses tumorigenicity in human gastric cancer lines.Zhongguo Zhongliu Shengwu Zhiliao Zazhi，1997;4:90-94
, 百拇醫(yī)藥
9 Yuan JL，Chai YB，Yu MS，Hui HX.Construction and identification of retroviral expression vector of MTS1.Zhonghua Miniao Zazhi，1996;17:395
10 Gonzalez Zulueta M，Bender CM，Yang AS，Nguyen T，Beart RW，Van Tornout JM，Jones PA.Methylation of the 5＇CpG island of the P16/CDKN2 tumor suppressor gene in normal and transformed human tissues correlates with gene silencing.Cancer Res，1995;55:4531-4535
11 Ahuja N，Mohan AL，Li Q，Stolker JM，Herman JG，Hamilton SR，Baylin SB，Issa JP.Association between CpG island methylation and microsatellite instability in colorectal cancer.Cancer Res，1997;57:3370-3374
收稿日期 1999-11-08, http://www.www.srpcoatings.com