丙型肝炎病毒包膜糖蛋白與保護(hù)性免疫
作者：閔峰 郝飛
單位：中國人民解放軍第三軍醫(yī)大學(xué)西南醫(yī)院感染科 重慶市 400038
關(guān)鍵詞：丙型肝炎病毒；包膜蛋白；免疫保護(hù)
世界華人消化雜志991219
中國圖書館分類號 R735.7
Subject headings hepatitis C virus; envelope protein; protective immune
丙型肝炎病毒(HCV)感染后保護(hù)性免疫狀況一直是爭論的問題.一方面HCV包膜糖蛋白區(qū)高度變異和準(zhǔn)種的存在，使病毒逃避機(jī)體免疫系統(tǒng)識別成為可能；另一方面有研究表明HCV包膜糖蛋白區(qū)確實(shí)存在中和抗原表位，此表位能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生保護(hù)性抗體并阻止HCV感染.現(xiàn)就HCV包膜糖蛋白與保護(hù)性免疫的關(guān)系作一綜述.
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1 HCV包膜糖蛋白的中和抗原表位
已知黃病毒和瘟病毒的包膜蛋白免疫接種動物后均能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生保護(hù)性免疫，提示與基因疏水圖相似的HCV包膜糖蛋白可能是機(jī)體免疫攻擊的靶目標(biāo)[1].通過基因分析HCV包膜糖蛋白由gp35和gp70組成，分別與牛腹瀉病毒的gp25和gp53相對應(yīng)而牛腹瀉病毒的gp53能刺激機(jī)體產(chǎn)生中和抗體，此抗體能中和病毒感染，對動物產(chǎn)生保護(hù)作用[2,3].此外HCV gp70的高變區(qū)-1(HVR1)與HIV-Ⅰ型的gp120 V3環(huán)相似，而HIV-Ⅰ型gp120 V3環(huán)含有誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生中和抗原表位，此表位產(chǎn)生抗體在體外能中和HIV感染.由此推測，位于HCVgp70中的HVR1可能含有中和抗原表位[2，3].
通過分析發(fā)現(xiàn)，HCV包膜糖蛋白區(qū)確實(shí)存在中和性表位，但各家報道意見不一致.Weiner et al[2]經(jīng)體外抗體——表位定位研究顯示有5個中和抗原表位，位于396～414氨基酸之間，并證實(shí)HVR1是體液反應(yīng)的主要靶位.Kato et al[3]用體外轉(zhuǎn)錄翻譯表達(dá)HVR1(27aa)融合蛋白與患者血清在體外作免疫沉淀反應(yīng)，結(jié)果提示HVR1含有線性B細(xì)胞表位，位于394aa～404aa和397aa～407aa間.此表位能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生特異性抗體，但有株特異性(isolate-specific).Rosa et al[4]結(jié)合細(xì)胞熒光標(biāo)記與流式細(xì)胞記數(shù)技術(shù)，建立了HCV E2蛋白與靶細(xì)胞中和結(jié)合定量分析檢測系統(tǒng)，結(jié)果顯示HCV E2區(qū)至少存在兩個中和抗原表位，分別位于HVR1區(qū)和E2其他區(qū)域.Esumi et al[5]用相應(yīng)重組蛋白/合成肽免疫小鼠產(chǎn)生抗血清，在體外基于抗體-病毒相互作用，通過免疫沉淀法研究發(fā)現(xiàn)抗E2和抗HVR1能有效地捕獲HCV，而且抗E2和抗HVR1能特異性凝集HCV，并指出免疫決定簇主要位于HVR1序列起始20個氨基酸間即384aa～403aa.另外對HVR1 B細(xì)胞表位的描述還包括有400aa～409aa[6]，398aa～410aa[7]，399aa～405aa[8]等，近年來也有研究表明E1E2復(fù)合體上構(gòu)型表位的形成對包膜糖蛋白誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生保護(hù)性免疫起重要作用.
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2 包膜糖蛋白抗體體外阻斷HCV感染的研究
一般來說，清除病毒建立機(jī)體保護(hù)性免疫通常與針對病毒包膜蛋白上中和抗原表位的抗體產(chǎn)生有關(guān)，這種抗體既可阻止病毒對敏感細(xì)胞的吸附，又可增加細(xì)胞免疫對病毒的識別和清除作用.日本學(xué)者Shimizu et al[9]對慢性HCV感染者隨訪14a，收集不同病程時期的血清在體外與不同HCV分離株混合后接種于培養(yǎng)細(xì)胞(感染5a內(nèi)的血清與初期感染分離株即H77/感染后13a分離株即H90混合).
發(fā)現(xiàn)感染早期血清與H77株結(jié)合，抑制病毒吸附到敏感的T淋巴細(xì)胞(HPB-Ma細(xì)胞)，阻止H77株在HPB-Ma細(xì)胞中復(fù)制，卻不能阻斷H90株感染；同樣用感染后14a的血清(H91)與H77/H90株混合后接種于HPB-Ma細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)H91血清能阻斷H90株在細(xì)胞中復(fù)制，卻不能阻斷H77株.結(jié)果表明HCV感染后確實(shí)能誘導(dǎo)抗病毒抗體產(chǎn)生，但這些抗體僅與最近的病毒株發(fā)生中和反應(yīng)，可能是在機(jī)體的免疫壓力的作用下HCV包膜糖蛋白區(qū)基因發(fā)生了漂移，使產(chǎn)生新的突變株逃避先前抗體的識別.為了進(jìn)一步探索抗-HVR1的中和作用.Shimizu et al[7]合成了與HCV-H77株HVR1區(qū)的相一致多肽(即390aa～414aa)，免疫兔后獲得抗血清在體外與H77/H90株混合后接種于HPB-Ma細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)抗血清能中和同源性病毒株即H77，卻不能中和異源性病毒株即H90株，而對照兔血清對H77株和H90株均無阻斷作用，作者認(rèn)為抗HVR1在體外確實(shí)能中和病毒并且有株的特異性.Zibert et al[10，11] 用慢性HCV-AD78感染者血清在體外進(jìn)行中和實(shí)驗(yàn)，此血清含有HVR1抗體，發(fā)現(xiàn)感染早期血清(感染后1a內(nèi))7份血清有5份血清能干擾病毒顆粒吸附到人成纖維細(xì)胞上，阻止病毒復(fù)制，而感染后期(感染后11a的血清)卻不能阻止HCV-AD78感染.提示抗HVR1在體外確實(shí)能中和病毒感染，但不能排除其他抗體的參與.作者還發(fā)現(xiàn)有15%與HCV-AD78感染無關(guān)的血清抗HVR1亦陽性，其滴度甚至達(dá)1∶1600，推測并非所有的抗HVR1都具有株的特異性，其中和作用存在部分交叉反應(yīng)；可能存在兩種HVR1特異性抗體，一種是感染早期出現(xiàn)，能阻止病毒吸附靶細(xì)胞，另一種可能是在感染過程中針對構(gòu)型表位的保守氨基酸序列而產(chǎn)生，其中和活性可能缺乏或是非特異性.Rosa et al[4]用表達(dá)在哺乳動物細(xì)胞中重組蛋白E2，經(jīng)純化后免疫兔產(chǎn)生多克隆特異性抗E2血清，在體外進(jìn)行中和結(jié)合實(shí)驗(yàn)，并通過定量分析評價E2中和作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)高效價抗E2能中和E2結(jié)合到靶細(xì)胞并阻止HCV感染，同時發(fā)現(xiàn)針對HCV-E2 HVR1特異性單克隆抗體也能部分中和E2結(jié)合靶細(xì)胞，提示抗E2和抗HVR1抗體在體外確實(shí)具有中和病毒作用.
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HCV感染人和黑猩猩后機(jī)體產(chǎn)生免疫力較弱， 為了積極探索其他實(shí)驗(yàn)動物對包膜糖蛋白的免疫應(yīng)答狀況，由此，Ahmed et al[12]以重組蛋白C，E1，E2免疫小鼠，觀察小鼠對其產(chǎn)生的體液免疫反應(yīng)，并用58種合成肽作為抗原行ELISA法檢測小鼠產(chǎn)生的抗體，同時與慢性HCV感染者血清中的抗體進(jìn)行比較.結(jié)果發(fā)現(xiàn)唯獨(dú)小鼠對15種合成肽產(chǎn)生免疫應(yīng)答，且產(chǎn)生的抗體滴度較高，然而慢性HCV感染者血清中未檢測其抗體，15種合成肽中11種肽是針對E2區(qū)線型表位，表明小鼠針對HCV包膜蛋白能夠產(chǎn)生較強(qiáng)的免疫反應(yīng)，而這種免疫反應(yīng)與人和黑猩猩不同；同時在預(yù)實(shí)驗(yàn)中也發(fā)現(xiàn)用E2蛋白免疫小鼠產(chǎn)生的免疫血清能夠捕捉HCV，提示抗E2在體外具有中和病毒的作用.Nakano et al[13]用表達(dá)HCV-1a株包膜糖蛋白E2的不同區(qū)域DNA質(zhì)粒免疫小鼠，并對小鼠產(chǎn)生E2抗體進(jìn)行定性定量分析，通過Rosa et al研制的中和結(jié)合實(shí)驗(yàn)方法篩選出高效價E2抗體，發(fā)現(xiàn)高效價E2抗體能凝集HCV表面非共價結(jié)合E1E2復(fù)合體，作者認(rèn)為這種高效價E2抗體可作為潛在的中和抗體，在體外具有中和病毒的作用.Lagging et al[14]也發(fā)現(xiàn)HCV DNA疫苗免疫接種BALB/c小鼠后，可誘導(dǎo)BALB/c小鼠產(chǎn)生強(qiáng)烈的體液免疫應(yīng)答，并將HCV的E1(174aa～359aa)和E2(371aa～742aa)區(qū)與皰疹病毒G蛋白的跨膜區(qū)和胞質(zhì)尾區(qū)構(gòu)建成嵌合基因，即假型病毒(VSV/HCV)；然后用同源性HCV分離株的包膜糖蛋白免疫黑猩猩后獲得的免疫血清在體外進(jìn)行中和實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)假型病毒不能感染真核細(xì)胞，提示E1和E2在假型病毒感染真核細(xì)胞中起著重要作用，作者認(rèn)為用此嵌合基因免疫小鼠后產(chǎn)生的抗體，可作為潛在的中和抗體為探索HCV疫苗提供一種新途徑.Robert et al用編碼與特異性E2蛋白結(jié)合的5個不同的重組E2抗體，并將這些抗體的Fab切割后進(jìn)行克隆優(yōu)化篩選，再用這些Fab片段在體外進(jìn)行中和實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)3個Fab片段能與HCV E2結(jié)合并抑制HCV吸附到靶細(xì)胞上，結(jié)果表明優(yōu)化重組的Fab能與不同病毒株包膜糖蛋白E2結(jié)合產(chǎn)生交叉反應(yīng).Hebersetzer et al[15]從2例慢性HCV感染者外周血單核細(xì)胞(PBMC)中獲得永生淋巴母細(xì)胞系(immortal lymphoblastoid cell lines)，此淋巴母細(xì)胞分泌人單克隆抗體(HMAbs)，并用表達(dá)在真核細(xì)胞中E2蛋白與HMAbs在體外進(jìn)行中和結(jié)合實(shí)驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)HMAbs：①能識別構(gòu)型依賴型抗原決定族；②能識別HCV1a和HCV1b抗原；③與病毒顆粒表面非共價結(jié)合E1E2復(fù)合體起凝集反應(yīng)；④HCV-Ⅳ感染者的HMAbs在體外顯示中和重組E2蛋白結(jié)合易感細(xì)胞，提示HMAbs在體外具有潛在中和病毒作用.
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3 包膜糖蛋白在動物體內(nèi)保護(hù)作用研究
大部分宿主在HCV感染后并不能產(chǎn)生穩(wěn)定有效的免疫，也不能充分阻止新的變異株攻擊，但臨床和實(shí)驗(yàn)研究表明，初次感染HCV后機(jī)體可產(chǎn)生一定程度的保護(hù)性免疫.Prince et al[17]報道黑猩猩第二次受到病毒攻擊時臨床癥狀較第一次感染時輕，提示體內(nèi)產(chǎn)生了針對病毒抗原的保護(hù)性免疫.Choo et al[16]用重組痘苗病毒載體在HeLa細(xì)胞內(nèi)表達(dá)E1/E2蛋白，經(jīng)純化后適量接種7只黑猩猩，其中2只(A組)9mo內(nèi)接受18次免疫注射，而另5只(B組)僅在0，1，7mo接受3次免疫注射，結(jié)果兩組黑猩猩體內(nèi)均產(chǎn)生了相應(yīng)的E1和E2抗體，但B組抗體滴度明顯高于A組；然后，用HCV-Ⅰ株攻擊，結(jié)果B組未發(fā)病，A組發(fā)病但病情較輕，而對照組4只動物全部發(fā)病且病情較重，表明該重組蛋白具有一定的保護(hù)作用，可用來預(yù)防HCV感染.Farci et al[18]對一慢性HCV感染者隨訪14a，收集不同病程時期的血漿并將其滅活與不同病毒株混合后對黑猩猩進(jìn)行接種，觀察HCV感染者體內(nèi)是否存在中和抗體.結(jié)果發(fā)現(xiàn)H79血漿(感染后2a的血漿)與H77分離株混合后接種黑猩猩均未發(fā)生感染，而H90血漿(感染后13a的血漿)與H77分離株混合后接種黑猩猩全部發(fā)生感染，表明HCV感染后，確實(shí)能產(chǎn)生中和性抗體，對動物有一定的保護(hù)作用，但此抗體有株的特異性，作者認(rèn)為在HCV慢性感染者體內(nèi)有HCV準(zhǔn)種和特異性中和抗體的存在.Farci et al[19]用HCV-H77株HVR1的兩條合成肽(A：390aa～414aa，B：384aa～414aa)免疫接種兔后得到抗HVR1的超免疫血清，然后給5只黑猩猩接種抗血清與不同相似株(H77/H99株)混合物，結(jié)果顯示抗HVR1僅對同源的H77株攻擊有免疫保護(hù)作用，而對異源性病毒株H90無免疫保護(hù)作用.因此作者認(rèn)為中和抗體攻擊的靶位是E2/NS1的HVR1，但宿主產(chǎn)生的這一保護(hù)性免疫應(yīng)答較弱，而且抗HVR1的中和作用有病毒株特異性，結(jié)果與作者早期報道一致.Rosa et al[4]用重組E2蛋白免疫黑猩猩，并通過中和結(jié)合實(shí)驗(yàn)方法檢測其中和結(jié)合抗體滴度，發(fā)現(xiàn)中和結(jié)合抗體滴度在1∶600以上時的動物可獲得較好的保護(hù)性免疫，而中和結(jié)合抗體滴定在1∶300左右動物仍可被感染，但癥狀較輕且病毒最終可被清除，提示中和結(jié)合抗體滴度越高，保護(hù)作用越強(qiáng).
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總之，HCV E區(qū)基因及其編碼的包膜糖蛋白是HCV疫苗研究的重點(diǎn)和關(guān)鍵.研究表明HCV包膜糖蛋白區(qū)確實(shí)存在中和性抗原表位，但E2 HVR1是一個快速突變的蛋白區(qū)易發(fā)生抗原漂移，此表位誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生的中和性抗體僅能和最近HCV株發(fā)生中和反應(yīng)，對其他變異株無交叉反應(yīng)[7-10]，加之HCV有眾多基因型和準(zhǔn)種存在，對其保護(hù)作用很難作出正確評價.我們能否依據(jù)HCV包膜糖蛋白含有中和抗原表位這種屬性，通過噬菌體肽庫篩選與E2抗體特異性反應(yīng)的模擬肽，此模擬肽含有不同株高度保守的位點(diǎn)或多個株多種變異位點(diǎn)，且其確能替代E2區(qū)抗原表位誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生針對多種HCV株的免疫反應(yīng)，可作為探索預(yù)防性疫苗研制的一種方向；另一方面可以運(yùn)用小鼠對HCV包膜蛋白所具有獨(dú)特的體液免疫反應(yīng)[12-15]，以中和結(jié)合實(shí)驗(yàn)方法篩選高效價E2抗體，并將其產(chǎn)生高效價E2抗體的表位與輔助性T細(xì)胞表位和(或)CTL表位偶聯(lián)成具有一定構(gòu)象的大分子嵌合肽有可能成為最終疫苗.隨著分子生物學(xué)技術(shù)飛速發(fā)展，人們對HCV包膜糖蛋白的認(rèn)識逐步加深，不久將會研制一種廣泛的、有效的疫苗預(yù)防HCV.
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通訊作者 閔峰
參考文獻(xiàn)
1 Rumenapf T，Stark R，Meyers G，Thiel HJ.Structural protein of hog cholera virus expression by vaccinia virus: further characterization and induction of protective immunity.J Virol，1991;65:589-597
2 Weiner AJ，Geysen HM，Christopherson C，Eric H，Thmomas J，Mason GS，F(xiàn)erruccio B，Kevin C，Marison CD，Crawford KA，Maurizia B，Barr PJ，Tatsuo M.Evidence for immune selection of hepatitis C virus putative envelope glycoprotein variant: potential role in chronic HCV infections.Proc Natl Aca Sci USA，1992;89:3468-3472
, 百拇醫(yī)藥
3 Kato N，Sekiya H，Ootsuyama Y，Nakazawa T，Hijikata M，Ohkoshi S，Shimotohno K.Humoral immune response to hypervariale region 1 of the putative envelope glycoprotein of hepatitis C virus.J Virol，1993;67:3923-3930
4 Rosa D，Campagnoli S，Moretto C，Guenzi E，Cousenst L，Chin M，Dong C，Amy J，Weiner Choo QI，Chien D，Pileri P，Houghton M，Abrignani S.A quantitative test to estimate neutralizing antibodies to the hepatitis C virus: cytofluorimetric assessment of envelope glycoprotein 2 binding to target cells.Proc Natl Acad Sci USA，1996;93:1759-1763
, http://www.www.srpcoatings.com
5 Esumi M，Ahmed M，Zhou YH，Takahashi H，Shikata T.Murine antibody against E2 and hypervariable region 1 cross-reactivity capture hepatitis C virus.Virology，1998;251:158-164
6 Taniguchi S，Okamoto H，Sakamoto M，Tsuda F，Tanaka T，Munekata E，Muchmore EE，Peterson DA，Mishiro S.A structurally flexible and antigenically variable N-terminal domain of the hepatitis C virus E2/NS1 protein: implication for an escape from antibody.Virology，1993;195:297-301
, http://www.www.srpcoatings.com
7 Shimizu YK，Igarashi H，Kiyohara T，Cabezon T，F(xiàn)arci P，Robert H，Purcell Yoshikura H.A hyperimmune serum against a synthetic peptide corresponding to the hypervariable region 1 of hepatitis C virus can prevent viral infection in cell cultures.Virology，1996;233:409-412
8 Scarselli E，Cerino A，Esposite G.Occurrence of antibodies reactive with more than one variant of the putative envelope glycoprotein hypervariable region 1 in viremic hepatitis C virus-infected patient.J Virol，1995;69:4407-4412
, http://www.www.srpcoatings.com
9 Shimizu YK，Hujikata M，Iwamoto A.Neutralizing antibody against hepatitis C virus and the emergence of neutralization escape mutant virus.J Virol，1994;68:1494-1500
10 Zibert A，Dudziak P，Schreier E.Characterization of antibody response to hepatitis C virus protein E2 and significance of hypervariable region 1-specific antibodies in viral neutralization.Arch Virol，1997;142:523-534
11 Zibert A，Schreier E，Roggendorf M.Antibody in human sera specific to hypervariable region 1 of hepatitis C virus can block viral attachment.Virology，1995;208:653-666
, 百拇醫(yī)藥
12 Ahmed M，Shikata T，Esumi T.Murine humoral immune response against recombinant structural protein of hepatitis C virus distinct from those of patients.Microbiol Immunol，1996;40:168-176
13 Nakano I，Maertens G，Marian E，Major LV，Jean D，Anne F，Guy DM，Christian T，Genevieve I.Immunization with plasmid DNA encoding hepatitis C virus envelope E2 antigenic domains induces antibodies whose immune reactivity is linked to the injection mode.J Virol，1997;71:7101-7109
, 百拇醫(yī)藥
14 Lagging LM，Meyer K，Owens RJ，Ray R.Functional role of hepatitis C virus chimeric glycoproteins in the infectivity pseudotyped virus.J Virol，1998;72:3539-3546
15 Hebersetzer F，F(xiàn)ournillier J，Dubuission J，Rosa D，Abrignani S，Wychowski C，Nakano I，Trepo C，Desgranges C，Inchauspe G.Characterization of human monoclonal antibodies specific to the hepatitis C virus glycoprotein E2 with in vitro binding neutralization properties.Virology，1998;249:32-41
, 百拇醫(yī)藥
16 Choo QL，Kuo G，Ralston A，Chien D，Nest GV，Han J，Berger H，Thudium K，Kuo C，Kansopon J，Mcfarlad J，Tabrizi A，Ching K，Moos B，Cummins LB，Houghton M，Muchmore E.Vaccination of chimpanzees against infection by the hepatitis C virus.Proc Natl Acad Sci USA，1994;91:1294-1299
17 Prince DM，Brotman B，Huima T，Pascual D，Jaffery M.Immunity in hepatitis C virus infection.J Infect Dis，1992;165:438-443
18 Farci P，Alter HJ，Wong DC，Miller RH，Govindarajan S，Engle R，Shapiro M，Purcell RH.Prevention of hepatitis C virus infection in chimpanzees after antibody-mediated in vitro neutralization.Proc Natl Acad Sci USA，1994;91:7792-7796
19 Farci P，Shimoda A，Wong D，Caberzon T，Geoannis DD，Strazzer A，Shimizu Y，Shapiro M，Alter HJ，Purcell RH.Prevention of hepatitis C virus infection in chimpanzees by hyperimmune serum against the hypervariable region 1 of the envelope 2 protein.Proc Natl Acad Sci USA，1996;93:15394-15399
收稿日期 1999-08-11, 百拇醫(yī)藥
單位：中國人民解放軍第三軍醫(yī)大學(xué)西南醫(yī)院感染科 重慶市 400038
關(guān)鍵詞：丙型肝炎病毒；包膜蛋白；免疫保護(hù)
世界華人消化雜志991219
中國圖書館分類號 R735.7
Subject headings hepatitis C virus; envelope protein; protective immune
丙型肝炎病毒(HCV)感染后保護(hù)性免疫狀況一直是爭論的問題.一方面HCV包膜糖蛋白區(qū)高度變異和準(zhǔn)種的存在，使病毒逃避機(jī)體免疫系統(tǒng)識別成為可能；另一方面有研究表明HCV包膜糖蛋白區(qū)確實(shí)存在中和抗原表位，此表位能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生保護(hù)性抗體并阻止HCV感染.現(xiàn)就HCV包膜糖蛋白與保護(hù)性免疫的關(guān)系作一綜述.
, 百拇醫(yī)藥
1 HCV包膜糖蛋白的中和抗原表位
已知黃病毒和瘟病毒的包膜蛋白免疫接種動物后均能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生保護(hù)性免疫，提示與基因疏水圖相似的HCV包膜糖蛋白可能是機(jī)體免疫攻擊的靶目標(biāo)[1].通過基因分析HCV包膜糖蛋白由gp35和gp70組成，分別與牛腹瀉病毒的gp25和gp53相對應(yīng)而牛腹瀉病毒的gp53能刺激機(jī)體產(chǎn)生中和抗體，此抗體能中和病毒感染，對動物產(chǎn)生保護(hù)作用[2,3].此外HCV gp70的高變區(qū)-1(HVR1)與HIV-Ⅰ型的gp120 V3環(huán)相似，而HIV-Ⅰ型gp120 V3環(huán)含有誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生中和抗原表位，此表位產(chǎn)生抗體在體外能中和HIV感染.由此推測，位于HCVgp70中的HVR1可能含有中和抗原表位[2，3].
通過分析發(fā)現(xiàn)，HCV包膜糖蛋白區(qū)確實(shí)存在中和性表位，但各家報道意見不一致.Weiner et al[2]經(jīng)體外抗體——表位定位研究顯示有5個中和抗原表位，位于396～414氨基酸之間，并證實(shí)HVR1是體液反應(yīng)的主要靶位.Kato et al[3]用體外轉(zhuǎn)錄翻譯表達(dá)HVR1(27aa)融合蛋白與患者血清在體外作免疫沉淀反應(yīng)，結(jié)果提示HVR1含有線性B細(xì)胞表位，位于394aa～404aa和397aa～407aa間.此表位能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生特異性抗體，但有株特異性(isolate-specific).Rosa et al[4]結(jié)合細(xì)胞熒光標(biāo)記與流式細(xì)胞記數(shù)技術(shù)，建立了HCV E2蛋白與靶細(xì)胞中和結(jié)合定量分析檢測系統(tǒng)，結(jié)果顯示HCV E2區(qū)至少存在兩個中和抗原表位，分別位于HVR1區(qū)和E2其他區(qū)域.Esumi et al[5]用相應(yīng)重組蛋白/合成肽免疫小鼠產(chǎn)生抗血清，在體外基于抗體-病毒相互作用，通過免疫沉淀法研究發(fā)現(xiàn)抗E2和抗HVR1能有效地捕獲HCV，而且抗E2和抗HVR1能特異性凝集HCV，并指出免疫決定簇主要位于HVR1序列起始20個氨基酸間即384aa～403aa.另外對HVR1 B細(xì)胞表位的描述還包括有400aa～409aa[6]，398aa～410aa[7]，399aa～405aa[8]等，近年來也有研究表明E1E2復(fù)合體上構(gòu)型表位的形成對包膜糖蛋白誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生保護(hù)性免疫起重要作用.
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2 包膜糖蛋白抗體體外阻斷HCV感染的研究
一般來說，清除病毒建立機(jī)體保護(hù)性免疫通常與針對病毒包膜蛋白上中和抗原表位的抗體產(chǎn)生有關(guān)，這種抗體既可阻止病毒對敏感細(xì)胞的吸附，又可增加細(xì)胞免疫對病毒的識別和清除作用.日本學(xué)者Shimizu et al[9]對慢性HCV感染者隨訪14a，收集不同病程時期的血清在體外與不同HCV分離株混合后接種于培養(yǎng)細(xì)胞(感染5a內(nèi)的血清與初期感染分離株即H77/感染后13a分離株即H90混合).
發(fā)現(xiàn)感染早期血清與H77株結(jié)合，抑制病毒吸附到敏感的T淋巴細(xì)胞(HPB-Ma細(xì)胞)，阻止H77株在HPB-Ma細(xì)胞中復(fù)制，卻不能阻斷H90株感染；同樣用感染后14a的血清(H91)與H77/H90株混合后接種于HPB-Ma細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)H91血清能阻斷H90株在細(xì)胞中復(fù)制，卻不能阻斷H77株.結(jié)果表明HCV感染后確實(shí)能誘導(dǎo)抗病毒抗體產(chǎn)生，但這些抗體僅與最近的病毒株發(fā)生中和反應(yīng)，可能是在機(jī)體的免疫壓力的作用下HCV包膜糖蛋白區(qū)基因發(fā)生了漂移，使產(chǎn)生新的突變株逃避先前抗體的識別.為了進(jìn)一步探索抗-HVR1的中和作用.Shimizu et al[7]合成了與HCV-H77株HVR1區(qū)的相一致多肽(即390aa～414aa)，免疫兔后獲得抗血清在體外與H77/H90株混合后接種于HPB-Ma細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)抗血清能中和同源性病毒株即H77，卻不能中和異源性病毒株即H90株，而對照兔血清對H77株和H90株均無阻斷作用，作者認(rèn)為抗HVR1在體外確實(shí)能中和病毒并且有株的特異性.Zibert et al[10，11] 用慢性HCV-AD78感染者血清在體外進(jìn)行中和實(shí)驗(yàn)，此血清含有HVR1抗體，發(fā)現(xiàn)感染早期血清(感染后1a內(nèi))7份血清有5份血清能干擾病毒顆粒吸附到人成纖維細(xì)胞上，阻止病毒復(fù)制，而感染后期(感染后11a的血清)卻不能阻止HCV-AD78感染.提示抗HVR1在體外確實(shí)能中和病毒感染，但不能排除其他抗體的參與.作者還發(fā)現(xiàn)有15%與HCV-AD78感染無關(guān)的血清抗HVR1亦陽性，其滴度甚至達(dá)1∶1600，推測并非所有的抗HVR1都具有株的特異性，其中和作用存在部分交叉反應(yīng)；可能存在兩種HVR1特異性抗體，一種是感染早期出現(xiàn)，能阻止病毒吸附靶細(xì)胞，另一種可能是在感染過程中針對構(gòu)型表位的保守氨基酸序列而產(chǎn)生，其中和活性可能缺乏或是非特異性.Rosa et al[4]用表達(dá)在哺乳動物細(xì)胞中重組蛋白E2，經(jīng)純化后免疫兔產(chǎn)生多克隆特異性抗E2血清，在體外進(jìn)行中和結(jié)合實(shí)驗(yàn)，并通過定量分析評價E2中和作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)高效價抗E2能中和E2結(jié)合到靶細(xì)胞并阻止HCV感染，同時發(fā)現(xiàn)針對HCV-E2 HVR1特異性單克隆抗體也能部分中和E2結(jié)合靶細(xì)胞，提示抗E2和抗HVR1抗體在體外確實(shí)具有中和病毒作用.
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HCV感染人和黑猩猩后機(jī)體產(chǎn)生免疫力較弱， 為了積極探索其他實(shí)驗(yàn)動物對包膜糖蛋白的免疫應(yīng)答狀況，由此，Ahmed et al[12]以重組蛋白C，E1，E2免疫小鼠，觀察小鼠對其產(chǎn)生的體液免疫反應(yīng)，并用58種合成肽作為抗原行ELISA法檢測小鼠產(chǎn)生的抗體，同時與慢性HCV感染者血清中的抗體進(jìn)行比較.結(jié)果發(fā)現(xiàn)唯獨(dú)小鼠對15種合成肽產(chǎn)生免疫應(yīng)答，且產(chǎn)生的抗體滴度較高，然而慢性HCV感染者血清中未檢測其抗體，15種合成肽中11種肽是針對E2區(qū)線型表位，表明小鼠針對HCV包膜蛋白能夠產(chǎn)生較強(qiáng)的免疫反應(yīng)，而這種免疫反應(yīng)與人和黑猩猩不同；同時在預(yù)實(shí)驗(yàn)中也發(fā)現(xiàn)用E2蛋白免疫小鼠產(chǎn)生的免疫血清能夠捕捉HCV，提示抗E2在體外具有中和病毒的作用.Nakano et al[13]用表達(dá)HCV-1a株包膜糖蛋白E2的不同區(qū)域DNA質(zhì)粒免疫小鼠，并對小鼠產(chǎn)生E2抗體進(jìn)行定性定量分析，通過Rosa et al研制的中和結(jié)合實(shí)驗(yàn)方法篩選出高效價E2抗體，發(fā)現(xiàn)高效價E2抗體能凝集HCV表面非共價結(jié)合E1E2復(fù)合體，作者認(rèn)為這種高效價E2抗體可作為潛在的中和抗體，在體外具有中和病毒的作用.Lagging et al[14]也發(fā)現(xiàn)HCV DNA疫苗免疫接種BALB/c小鼠后，可誘導(dǎo)BALB/c小鼠產(chǎn)生強(qiáng)烈的體液免疫應(yīng)答，并將HCV的E1(174aa～359aa)和E2(371aa～742aa)區(qū)與皰疹病毒G蛋白的跨膜區(qū)和胞質(zhì)尾區(qū)構(gòu)建成嵌合基因，即假型病毒(VSV/HCV)；然后用同源性HCV分離株的包膜糖蛋白免疫黑猩猩后獲得的免疫血清在體外進(jìn)行中和實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)假型病毒不能感染真核細(xì)胞，提示E1和E2在假型病毒感染真核細(xì)胞中起著重要作用，作者認(rèn)為用此嵌合基因免疫小鼠后產(chǎn)生的抗體，可作為潛在的中和抗體為探索HCV疫苗提供一種新途徑.Robert et al用編碼與特異性E2蛋白結(jié)合的5個不同的重組E2抗體，并將這些抗體的Fab切割后進(jìn)行克隆優(yōu)化篩選，再用這些Fab片段在體外進(jìn)行中和實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)3個Fab片段能與HCV E2結(jié)合并抑制HCV吸附到靶細(xì)胞上，結(jié)果表明優(yōu)化重組的Fab能與不同病毒株包膜糖蛋白E2結(jié)合產(chǎn)生交叉反應(yīng).Hebersetzer et al[15]從2例慢性HCV感染者外周血單核細(xì)胞(PBMC)中獲得永生淋巴母細(xì)胞系(immortal lymphoblastoid cell lines)，此淋巴母細(xì)胞分泌人單克隆抗體(HMAbs)，并用表達(dá)在真核細(xì)胞中E2蛋白與HMAbs在體外進(jìn)行中和結(jié)合實(shí)驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)HMAbs：①能識別構(gòu)型依賴型抗原決定族；②能識別HCV1a和HCV1b抗原；③與病毒顆粒表面非共價結(jié)合E1E2復(fù)合體起凝集反應(yīng)；④HCV-Ⅳ感染者的HMAbs在體外顯示中和重組E2蛋白結(jié)合易感細(xì)胞，提示HMAbs在體外具有潛在中和病毒作用.
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3 包膜糖蛋白在動物體內(nèi)保護(hù)作用研究
大部分宿主在HCV感染后并不能產(chǎn)生穩(wěn)定有效的免疫，也不能充分阻止新的變異株攻擊，但臨床和實(shí)驗(yàn)研究表明，初次感染HCV后機(jī)體可產(chǎn)生一定程度的保護(hù)性免疫.Prince et al[17]報道黑猩猩第二次受到病毒攻擊時臨床癥狀較第一次感染時輕，提示體內(nèi)產(chǎn)生了針對病毒抗原的保護(hù)性免疫.Choo et al[16]用重組痘苗病毒載體在HeLa細(xì)胞內(nèi)表達(dá)E1/E2蛋白，經(jīng)純化后適量接種7只黑猩猩，其中2只(A組)9mo內(nèi)接受18次免疫注射，而另5只(B組)僅在0，1，7mo接受3次免疫注射，結(jié)果兩組黑猩猩體內(nèi)均產(chǎn)生了相應(yīng)的E1和E2抗體，但B組抗體滴度明顯高于A組；然后，用HCV-Ⅰ株攻擊，結(jié)果B組未發(fā)病，A組發(fā)病但病情較輕，而對照組4只動物全部發(fā)病且病情較重，表明該重組蛋白具有一定的保護(hù)作用，可用來預(yù)防HCV感染.Farci et al[18]對一慢性HCV感染者隨訪14a，收集不同病程時期的血漿并將其滅活與不同病毒株混合后對黑猩猩進(jìn)行接種，觀察HCV感染者體內(nèi)是否存在中和抗體.結(jié)果發(fā)現(xiàn)H79血漿(感染后2a的血漿)與H77分離株混合后接種黑猩猩均未發(fā)生感染，而H90血漿(感染后13a的血漿)與H77分離株混合后接種黑猩猩全部發(fā)生感染，表明HCV感染后，確實(shí)能產(chǎn)生中和性抗體，對動物有一定的保護(hù)作用，但此抗體有株的特異性，作者認(rèn)為在HCV慢性感染者體內(nèi)有HCV準(zhǔn)種和特異性中和抗體的存在.Farci et al[19]用HCV-H77株HVR1的兩條合成肽(A：390aa～414aa，B：384aa～414aa)免疫接種兔后得到抗HVR1的超免疫血清，然后給5只黑猩猩接種抗血清與不同相似株(H77/H99株)混合物，結(jié)果顯示抗HVR1僅對同源的H77株攻擊有免疫保護(hù)作用，而對異源性病毒株H90無免疫保護(hù)作用.因此作者認(rèn)為中和抗體攻擊的靶位是E2/NS1的HVR1，但宿主產(chǎn)生的這一保護(hù)性免疫應(yīng)答較弱，而且抗HVR1的中和作用有病毒株特異性，結(jié)果與作者早期報道一致.Rosa et al[4]用重組E2蛋白免疫黑猩猩，并通過中和結(jié)合實(shí)驗(yàn)方法檢測其中和結(jié)合抗體滴度，發(fā)現(xiàn)中和結(jié)合抗體滴度在1∶600以上時的動物可獲得較好的保護(hù)性免疫，而中和結(jié)合抗體滴定在1∶300左右動物仍可被感染，但癥狀較輕且病毒最終可被清除，提示中和結(jié)合抗體滴度越高，保護(hù)作用越強(qiáng).
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總之，HCV E區(qū)基因及其編碼的包膜糖蛋白是HCV疫苗研究的重點(diǎn)和關(guān)鍵.研究表明HCV包膜糖蛋白區(qū)確實(shí)存在中和性抗原表位，但E2 HVR1是一個快速突變的蛋白區(qū)易發(fā)生抗原漂移，此表位誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生的中和性抗體僅能和最近HCV株發(fā)生中和反應(yīng)，對其他變異株無交叉反應(yīng)[7-10]，加之HCV有眾多基因型和準(zhǔn)種存在，對其保護(hù)作用很難作出正確評價.我們能否依據(jù)HCV包膜糖蛋白含有中和抗原表位這種屬性，通過噬菌體肽庫篩選與E2抗體特異性反應(yīng)的模擬肽，此模擬肽含有不同株高度保守的位點(diǎn)或多個株多種變異位點(diǎn)，且其確能替代E2區(qū)抗原表位誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生針對多種HCV株的免疫反應(yīng)，可作為探索預(yù)防性疫苗研制的一種方向；另一方面可以運(yùn)用小鼠對HCV包膜蛋白所具有獨(dú)特的體液免疫反應(yīng)[12-15]，以中和結(jié)合實(shí)驗(yàn)方法篩選高效價E2抗體，并將其產(chǎn)生高效價E2抗體的表位與輔助性T細(xì)胞表位和(或)CTL表位偶聯(lián)成具有一定構(gòu)象的大分子嵌合肽有可能成為最終疫苗.隨著分子生物學(xué)技術(shù)飛速發(fā)展，人們對HCV包膜糖蛋白的認(rèn)識逐步加深，不久將會研制一種廣泛的、有效的疫苗預(yù)防HCV.
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通訊作者 閔峰
參考文獻(xiàn)
1 Rumenapf T，Stark R，Meyers G，Thiel HJ.Structural protein of hog cholera virus expression by vaccinia virus: further characterization and induction of protective immunity.J Virol，1991;65:589-597
2 Weiner AJ，Geysen HM，Christopherson C，Eric H，Thmomas J，Mason GS，F(xiàn)erruccio B，Kevin C，Marison CD，Crawford KA，Maurizia B，Barr PJ，Tatsuo M.Evidence for immune selection of hepatitis C virus putative envelope glycoprotein variant: potential role in chronic HCV infections.Proc Natl Aca Sci USA，1992;89:3468-3472
, 百拇醫(yī)藥
3 Kato N，Sekiya H，Ootsuyama Y，Nakazawa T，Hijikata M，Ohkoshi S，Shimotohno K.Humoral immune response to hypervariale region 1 of the putative envelope glycoprotein of hepatitis C virus.J Virol，1993;67:3923-3930
4 Rosa D，Campagnoli S，Moretto C，Guenzi E，Cousenst L，Chin M，Dong C，Amy J，Weiner Choo QI，Chien D，Pileri P，Houghton M，Abrignani S.A quantitative test to estimate neutralizing antibodies to the hepatitis C virus: cytofluorimetric assessment of envelope glycoprotein 2 binding to target cells.Proc Natl Acad Sci USA，1996;93:1759-1763
, http://www.www.srpcoatings.com
5 Esumi M，Ahmed M，Zhou YH，Takahashi H，Shikata T.Murine antibody against E2 and hypervariable region 1 cross-reactivity capture hepatitis C virus.Virology，1998;251:158-164
6 Taniguchi S，Okamoto H，Sakamoto M，Tsuda F，Tanaka T，Munekata E，Muchmore EE，Peterson DA，Mishiro S.A structurally flexible and antigenically variable N-terminal domain of the hepatitis C virus E2/NS1 protein: implication for an escape from antibody.Virology，1993;195:297-301
, http://www.www.srpcoatings.com
7 Shimizu YK，Igarashi H，Kiyohara T，Cabezon T，F(xiàn)arci P，Robert H，Purcell Yoshikura H.A hyperimmune serum against a synthetic peptide corresponding to the hypervariable region 1 of hepatitis C virus can prevent viral infection in cell cultures.Virology，1996;233:409-412
8 Scarselli E，Cerino A，Esposite G.Occurrence of antibodies reactive with more than one variant of the putative envelope glycoprotein hypervariable region 1 in viremic hepatitis C virus-infected patient.J Virol，1995;69:4407-4412
, http://www.www.srpcoatings.com
9 Shimizu YK，Hujikata M，Iwamoto A.Neutralizing antibody against hepatitis C virus and the emergence of neutralization escape mutant virus.J Virol，1994;68:1494-1500
10 Zibert A，Dudziak P，Schreier E.Characterization of antibody response to hepatitis C virus protein E2 and significance of hypervariable region 1-specific antibodies in viral neutralization.Arch Virol，1997;142:523-534
11 Zibert A，Schreier E，Roggendorf M.Antibody in human sera specific to hypervariable region 1 of hepatitis C virus can block viral attachment.Virology，1995;208:653-666
, 百拇醫(yī)藥
12 Ahmed M，Shikata T，Esumi T.Murine humoral immune response against recombinant structural protein of hepatitis C virus distinct from those of patients.Microbiol Immunol，1996;40:168-176
13 Nakano I，Maertens G，Marian E，Major LV，Jean D，Anne F，Guy DM，Christian T，Genevieve I.Immunization with plasmid DNA encoding hepatitis C virus envelope E2 antigenic domains induces antibodies whose immune reactivity is linked to the injection mode.J Virol，1997;71:7101-7109
, 百拇醫(yī)藥
14 Lagging LM，Meyer K，Owens RJ，Ray R.Functional role of hepatitis C virus chimeric glycoproteins in the infectivity pseudotyped virus.J Virol，1998;72:3539-3546
15 Hebersetzer F，F(xiàn)ournillier J，Dubuission J，Rosa D，Abrignani S，Wychowski C，Nakano I，Trepo C，Desgranges C，Inchauspe G.Characterization of human monoclonal antibodies specific to the hepatitis C virus glycoprotein E2 with in vitro binding neutralization properties.Virology，1998;249:32-41
, 百拇醫(yī)藥
16 Choo QL，Kuo G，Ralston A，Chien D，Nest GV，Han J，Berger H，Thudium K，Kuo C，Kansopon J，Mcfarlad J，Tabrizi A，Ching K，Moos B，Cummins LB，Houghton M，Muchmore E.Vaccination of chimpanzees against infection by the hepatitis C virus.Proc Natl Acad Sci USA，1994;91:1294-1299
17 Prince DM，Brotman B，Huima T，Pascual D，Jaffery M.Immunity in hepatitis C virus infection.J Infect Dis，1992;165:438-443
18 Farci P，Alter HJ，Wong DC，Miller RH，Govindarajan S，Engle R，Shapiro M，Purcell RH.Prevention of hepatitis C virus infection in chimpanzees after antibody-mediated in vitro neutralization.Proc Natl Acad Sci USA，1994;91:7792-7796
19 Farci P，Shimoda A，Wong D，Caberzon T，Geoannis DD，Strazzer A，Shimizu Y，Shapiro M，Alter HJ，Purcell RH.Prevention of hepatitis C virus infection in chimpanzees by hyperimmune serum against the hypervariable region 1 of the envelope 2 protein.Proc Natl Acad Sci USA，1996;93:15394-15399
收稿日期 1999-08-11, 百拇醫(yī)藥