谷胱甘肽的簡便測定法
作者：趙旭東 魏東芝 萬群 俞俊棠
單位：趙旭東 魏東芝 萬群 俞俊棠(華東理工大學生物反應器工程國家重點實驗室 上海 200237)
關鍵詞：谷胱甘肽、甲醛、半胱氨酸、DTNB
藥物分析雜志000113 摘 要：目的：建立一種快速簡便測定谷胱甘肽的新方法。方法：樣品1式2份，pH 8.0條件下分別和甲醛反應2 min和60 min，各取1 mL加入5 mL DTNB溶液，25 ℃反應5 min后分別測定在波長412 nm的吸光度，算出2者的差值ΔA，代入標準曲線計算得出谷胱甘肽含量。結(jié)果：谷胱甘肽濃度在0.19～0.95 g.L-1之間線性關系良好，回歸方程為：Y=0.715 4X-0.000 4，r=0.999 9，最大誤差不超過6%。結(jié)論：方法成本低廉，簡單易行，特別適合于有干擾物質(zhì)存在時還原型谷胱甘肽濃度的分析。
, http://www.www.srpcoatings.com
A Simple Method for Rapid Determination of Reduced Glutathione
Zhao Xudong Wei Dongzhi Wan Qun Yu Juntang
(State Key Laboratory of Bioreactor Engineering, Institute of Biochemistry,East China University of Science and Technology, Shanghai 200237)
Abstract：Objective：A new simple method for rapid determination of reduced glutathione in the presence of other thiols is developed based on the reactions of formaldehyde with glutathione and interefering substances. Method:After each aliquot of two same samples reacts with formaldehyde for 2 and 60 min respectively, 1 mL of each solution is added to 5 mL DTNB and reacts for 5 min at 25 ℃. The absorbance is measured immediately at wavelength 412 nm. The difference between two absorbance(ΔA=A2 min-A60 min)is calculated, concentration of glutathione can be obtained from standard curve. Result:There is a good linearity between 0.19 to 0.95 g.L-1 glutathione. Regression equation:Y=0.715 4X-0.000 4，r=0.999 9，maximum deviation is less than 6%. Conclusion:The method is cheap, simple, practicable and is applicable to assay of reduced glutathione in the presence of other interefering substances.
, 百拇醫(yī)藥
Key words：glutathione, formaldehyde, cysteine, DTNB▲
谷胱甘肽(GSH)是由谷氨酸、半胱氨酸(Cys)和甘氨酸組成的天然三肽，用途廣泛。利用基因工程微生物生物合成方法是生產(chǎn)谷胱甘肽的主要方式。作為前體之一，半胱氨酸的濃度較高，對谷胱甘肽的測定有干擾。已有幾種方法用于半胱氨酸存在時谷胱甘肽的測定：酶分析方法[1，2]可測高達1 000倍半胱氨酸存在時谷胱甘肽的含量，結(jié)果較準確，但需價格昂貴的輔酶Ⅱ和谷胱甘肽還原酶，并且后者活力變化嚴重影響測量結(jié)果；色譜法[3，4]冗長費時；Jocelyn[5]采用將樣品在硫酸中煮沸1 h的方法，不太安全；Wronski[6，7]方法效果較好，但需用對羥基汞苯甲酸和螢光黃；熒光法[8]容易受干擾，誤差較大；乙二醛酶法[9]需要復雜的技術和設備。針對上述方法的不足，本文在研究甲醛同谷胱甘肽和常見含巰基物質(zhì)反應特點的基礎上結(jié)合巰基的測定方法[10，11]提出一種簡單，快速的新方法，應用于生物合成反應溶液中谷胱甘肽含量的分析取得滿意結(jié)果。
, http://www.www.srpcoatings.com
1 儀器和試劑
752紫外光柵分光光度計(上海第三分析儀器廠)，恒溫水浴槽(上海醫(yī)療器械五廠)。
GSH，Gys，為生化試劑；3%甲醛溶液由分析純試劑加水配制，用NaOH調(diào)節(jié)pH為8.0；0.25 mol.L-1 pH 8.0的Tris-HCl緩沖液由生化試劑配制；0.01 mol.L-1 DTNB[5，5’-二硫代雙(2-硝基苯甲酸)]溶液由生化試劑加0.05 mol.L-1 pH 7.0的磷酸緩沖液配制，存于棕色瓶中，放于低溫暗處備用；DTNB分析溶液由1體積0.01 mol.L-1DTNB溶液加100體積0.25 mol.L-1 pH 8.0的Tris-HCl緩沖液配制而成，現(xiàn)用現(xiàn)配；其它試劑為分析純；所用水為去離子水。
, 百拇醫(yī)藥
2 分析方法
待分析樣品(Cys含量不大于20 mmol.L-1，GSH濃度小于0.9 g.L-1)1 mL 2份，每份加入0.25 mol.L-1 pH 8.0的Tris-HCl緩沖液3 mL，搖勻，再加入3%甲醛1 mL，搖勻，室溫下分別準確靜置2 min和60 min后，立刻取1 mL加入預先恒溫于25 ℃水浴中的DTNB分析溶液5 mL，搖勻，準確靜置5 min后，立刻在波長412 nm處測定吸光度A，算出2者的A值之差ΔA，代入回歸方程計算相應谷胱甘肽濃度，最大誤差不超過6%。
3 結(jié)果
3.1 顯色溶液的穩(wěn)定性 準確稱取GSH溶于pH 6.5去離子水配成0.48 g.L-1的標準溶液，取1 mL按上述方法分析，已知室溫為26 ℃，5 mL DTNB溶液預先恒溫于25 ℃水浴中，分別加入已與甲醛反應2 min和60 min的樣品溶液1 mL后迅速搖勻，以此刻作為反應開始，于不同時間測定吸光度，見表1。可知反應開始1.5 min到10 min之間顯色溶液保持穩(wěn)定，考慮到因季節(jié)不同，與甲醛反應后的樣品溶液溫度變化，1 mL該溶液加入5 mL預先恒溫于25 ℃水浴中的DTNB溶液后需1～3 min才能恢復到25 ℃，選擇5 min為反應時間。
, 百拇醫(yī)藥
表1 顯色溶液在不同反應時間的吸光度 反應時間/min
反應2 min的樣品
反應60 min的樣品
0.5
0.672
0.011
1.5
0.680
0.013
2.5
0.680
0.013
, http://www.www.srpcoatings.com
5.0
0.680
0.013
10
0.680
0.013
15
0.678
0.012
20
0.678
0.012
30
, 百拇醫(yī)藥
0.670
0.011
60
0.649
0.006
3.2 標準曲線的制作 谷胱甘肽含有疏基，按照疏基的測定方法[11，12]可求出GSH的含量。準確稱取GSH溶于pH 6.5去離子水配成0.95 g.L-1的標準溶液，分別取該溶液0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mL，相應加入0.8，0.6，0.4，0.2，0 mL pH 6.5的去離子水，用水代替甲醛作為對照。按分析方法與甲醛反應2 min和60 min后測定結(jié)果見表2。以Y為縱坐標，表示GSH(g.L-1)濃度，以X為橫坐標，表示ΔA，用最小二乘法計算得回歸方程和相關系數(shù)為：
, http://www.www.srpcoatings.com
Y=0.715 4X-0.000 4 r=0.999 9
說明線性關系良好。表2 GSH濃度(g.L-1)與ΔA之間的關系 GSH加入量/
A2 min
A60 min
ΔA
g.L-1
A2 min-A60 min
0.00
0.000
, 百拇醫(yī)藥
0.000
0.000
0.19
0.272
0.013
0.259
0.38
0.553
0.017
0.536
0.57
0.830
0.027
, 百拇醫(yī)藥
0.803
0.76
1.101
0.030
1.071
0.95
1.352
0.034
1.318
3.3 甲醛同Cys和GSH的反應速度 配制濃度為0.95 g.L-1的GSH標準溶液和2.6 g.L-1的Cys標準溶液，按分析方法分別與甲醛反應不同時間后測量A值，用水代替甲醛作為對照。結(jié)果表明(表3)：室溫下pH 8.0時，和甲醛反應2 min后，98.94%的Cys被掩蔽，而GSH只有3.08%；反應1 h后，97.56%的GSH也被掩蔽，由此可知，甲醛同半胱氨酸的反應更快。利用這種反應速度的差異，可以分別測定Cys和GSH的濃度；由此啟發(fā)研究其他含疏基物質(zhì)與甲醛的反應特性。表3 甲醛同Cys和GSH的反應速度 與甲醛反應
, 百拇醫(yī)藥
時間/min
Gys
GSH
A
A
0
2.159(對照)
1.395(對照)
1
0.240
11.22
, http://www.www.srpcoatings.com
1.384
99.21
2
0.023
1.06
1.352
96.92
3
0.019
0.88
1.329
95.27
30
, 百拇醫(yī)藥
0.019
0.88
0.335
24.01
60
0.018
0.88
0.034
2.44
3.4 多種含疏基物質(zhì)共存時GSH含量分析 生物合成GSH溶液中含有細胞泄漏物如輔酶A、蛋白質(zhì)等含疏基物質(zhì)，提取時還用到疏基乙醇和NaHSO3還原氧化型GSH這些物質(zhì)干擾GSH的分析。進一步研究甲醛同這些物質(zhì)的反應性質(zhì)如表4所示。表4 各種含疏基物質(zhì)同甲醛的反應性質(zhì)及對GSH測定的影響 編號
, 百拇醫(yī)藥
樣品
A2 min
A60 min
A2 min-A60 min
對GSH測定的影響
1
0.2 mL GSH(0.95 g.L-1)
0.272
0.013
0.259
, 百拇醫(yī)藥 2
0.2 mL Cys(2.6 g.L-1)
0.005
0.002
0.003
小
3
0.2 mL巰基乙醇(31.67%)
0.499
0.494
0.005
小
, 百拇醫(yī)藥
4
1 mL二硫蘇糖醇(0.21 g.L-1)c
0.683
0.117
0.556
很大
5
1 mL NaHSO3(1.08 g.L-1)
0.119
0.121
, 百拇醫(yī)藥 -0.002
小
6
1 mL木瓜蛋白酶(2.7 g.L-1)a
0.072
0.071
0.001
小
7
1 mLβ-半乳糖苷酶(3 g.L-1)a
0.187
, 百拇醫(yī)藥
0.187
0.000
沒有
8
0.8 mL酵母細胞裂解液
0.170
0.115
0.055
大
(蛋白質(zhì)濃度53 mg.L-1)b
9
0.5 mL E.coli細胞裂解液
, 百拇醫(yī)藥
0.045
0.032
0.013
大
(蛋白質(zhì)濃度39 mg.L-1)b
a.這2種酶含有巰基，用來說明甲醛同蛋白質(zhì)巰基的反應性質(zhì)
b.生物合成GSH的反應系統(tǒng)含有固定化酵母和E.coli細胞，溶液中有這2種細胞的泄漏物如蛋白質(zhì)、輔酶等含巰基物質(zhì)，分析這2個樣品是為了檢驗這些含巰基物質(zhì)對GSH測定的影響
c.二硫蘇糖醇與巰基乙醇和NaHSO3不同，因為和甲醛反應使它的A值減小許多，給分析帶來麻煩；還原反應溶液中的氧化型GSH時只采用巰基乙醇和NaHSO3
, 百拇醫(yī)藥
表4結(jié)果表明，除二硫蘇糖醇外，與甲醛反應的常見含巰基物質(zhì)基本上可分為4種，第1種和甲醛反應2 min后，幾乎完全被掩蔽，如半胱氨酸；第2種和甲醛反應的時間越長，被掩蔽的越多，以致最后被掩蔽，如谷胱甘肽、酵母和E.coli細胞裂解液中的未知成分；第3種與甲醛的反應在2 min時就已完成，部分被掩蔽，2 min和60 min時的A值幾乎一樣，如NaHSO3和木瓜蛋白酶；第4種是基本上不與甲醛反應，如巰基乙醇和半乳糖苷酶。通過求取和甲醛反應2 min和60 min時的A值之差，可將第1、第3、第4種物質(zhì)的干擾消除；第2種含巰基物質(zhì)共存時，可設立不含GSH的溶液作為對照來消除干擾，如在測量生物合成反應溶液中的GSH濃度時，以不加GSH前體的溶液作為對照。總之，無論哪一種干擾物質(zhì)和GSH共存，采用本文的分析方法都可以測定GSH含量。各種樣品按照分析方法測定的GSH含量如表5所示，每種樣品測定之前用水補加至體積為1 mL，表中數(shù)據(jù)為2次分析的平均值。
表5 各種樣品的GSH含量分析結(jié)果 樣品
, http://www.www.srpcoatings.com
GSH加入量/
g.L-1
A2 min
A60 min
A2 min-A60 min
測量值/
g.L-1
測量值與
加入量之比
/%
, http://www.www.srpcoatings.com
1 樣品1+樣品2
0.190
0.280±0.004
0.016±0.004
0.264
0.188
98.95
2 樣品1+樣品3+0.2 mL樣品5
0.190
0.795±0.012
0.533±0.017
0.262
, http://www.www.srpcoatings.com
0.187
98.42
3 樣品1+0.2 mL樣品5+0.2 mL樣品6
0.190
0.308±0.008
0.056±0.014
0.252
0.180
94.74
4 樣品1+樣品8a
0.190
0.440±0.029
, 百拇醫(yī)藥
0.130±0.011
0.254a
0.181
95.26
5 樣品2+0.3 mL樣品8+0.3 mL樣品9a
0.000
0.099±0.010
0.071±0.009
0.028
6 樣品1+樣品2+0.3 mL樣品8+0.3 mL樣品9
0.190
, http://www.www.srpcoatings.com
0.382±0.035
0.095±0.013
0.259a
0.185
97.37
注：樣品編號見表4
a.分析樣品6必須設立對照，即樣品5，原因見文中解釋；計算樣品6的GSH含量時，應采用樣品6的ΔA與樣品5的ΔA之差0.280。分析樣品4時以表4中樣品8為對照
由表5可知，直接將樣品的ΔΑ代入回歸方程得到的測量結(jié)果誤差最大不超過6%，一般小于5%，可以滿足分析要求。
4 討論
, 百拇醫(yī)藥
4.1 本文提出了一種成本小，簡單、快速測定干擾物質(zhì)共存時還原型GSH濃度的新方法，較適合于GSH含量介于0.19～0.95 g.L-1的樣品分析，這時相對誤差較小，如生物合成反應溶液中的GSH濃度測量，一般情況下90 min可以完成分析過程，得到實驗結(jié)果，誤差最大不超過6%，符合生物合成GSH時的分析要求。采用更高濃度的甲醛可以縮短反應時間和測量濃度更高的樣品，此時應注意設立新的標準曲線。
4.2 二硫蘇糖醇非常容易氧化，對GSH測定干擾較大，本方法不適于二硫蘇糖醇共存時GSH的分析測定。
4.3 與甲醛反應性質(zhì)為第1種的物質(zhì)其濃度不應大于表3中的數(shù)據(jù)，如Cys濃度應小于20 mmol.L-1。
4.4 不能使用磷酸緩沖液，因為容易和DTNB溶液發(fā)生顏色反應干擾分析。
, 百拇醫(yī)藥
4.5 顏色反應必須在25 ℃完成，甲醛不改變最后的A值但會稍微延長顏色反應完成的時間，將分析樣品放于25 ℃水浴中5 min足夠達到要求。
4.6 測定含疏基物質(zhì)如輔酶A、蛋白質(zhì)等含量較高的溶液中的GSH濃度時，最好先減少這些物質(zhì)并作對照。
4.7 氧化型GSH還原以后才能使用本分析方法測定�！�
參考文獻：
[1]Tietze F. Enzymic method for quantitative determination of nanogram amounts of total and oxidized glutathione. Anal Biochem, 1969, 27(3):502
[2]Griffith O W. Determination of glutathione and glutathione disulfide using glutathione reductase and 2-vinylpyridine. Anal Biochem, 1980, 106(1):207
, 百拇醫(yī)藥
[3]Newton G L, Dorian R, Fahey R C. Analysis of biological thiols: derivatization with monobromobimane and separation by reverse-phase high-performance liquid chromatograph. Anal Biochem, 1981, 114(2):383
[4]Anderson M E, Meister A. Transport and direct utilization of γ-glutamylcysteine for glutathione synthesis. Proc Natl Acad Sci U S A, 1983, 80(3):707
[5]Jocelyn P C. An assay for glutathione in acid solution. Anal Biochem, 1967,18(3):493
, 百拇醫(yī)藥
[6]Wronski M. The micro-determination of glutathione and cysteine in the presence of each other. Analyst, 1965, 90(11):697
[7]Wronski M. Hydrolysis of cystine-n-peptide bonds in keratin by hydrochloric acid. Aust J Chem, 1966, 19(2):341
[8]Cohn V H, Lyle J. A fluorometric assay for glutathione. Anal Biochem, 1966, 14(1):434
[9]Woodward G E. Glyoxalase Ⅲ, glyoxalase as a reagent for the quantitative microestimation of glutathione. J Biol Chem, 1935, 109(1):1
, 百拇醫(yī)藥
[10]Kortt A A, Liu T Y. On the mechanism of action streptococcal Proteinase I, Active-site titration. Biochemistry, 1973, 12(2):320
[11]Ellman G L. Tissue sulfhydryl groups. Arch Biochem Biophys, 1959, 82(1):70
[12]蔡武城，袁厚積.生物物質(zhì)常用化學分析法.北京：科學出版社，1982.88
收稿日期：1998-11-19, http://www.www.srpcoatings.com
單位：趙旭東 魏東芝 萬群 俞俊棠(華東理工大學生物反應器工程國家重點實驗室 上海 200237)
關鍵詞：谷胱甘肽、甲醛、半胱氨酸、DTNB
藥物分析雜志000113 摘 要：目的：建立一種快速簡便測定谷胱甘肽的新方法。方法：樣品1式2份，pH 8.0條件下分別和甲醛反應2 min和60 min，各取1 mL加入5 mL DTNB溶液，25 ℃反應5 min后分別測定在波長412 nm的吸光度，算出2者的差值ΔA，代入標準曲線計算得出谷胱甘肽含量。結(jié)果：谷胱甘肽濃度在0.19～0.95 g.L-1之間線性關系良好，回歸方程為：Y=0.715 4X-0.000 4，r=0.999 9，最大誤差不超過6%。結(jié)論：方法成本低廉，簡單易行，特別適合于有干擾物質(zhì)存在時還原型谷胱甘肽濃度的分析。
, http://www.www.srpcoatings.com
A Simple Method for Rapid Determination of Reduced Glutathione
Zhao Xudong Wei Dongzhi Wan Qun Yu Juntang
(State Key Laboratory of Bioreactor Engineering, Institute of Biochemistry,East China University of Science and Technology, Shanghai 200237)
Abstract：Objective：A new simple method for rapid determination of reduced glutathione in the presence of other thiols is developed based on the reactions of formaldehyde with glutathione and interefering substances. Method:After each aliquot of two same samples reacts with formaldehyde for 2 and 60 min respectively, 1 mL of each solution is added to 5 mL DTNB and reacts for 5 min at 25 ℃. The absorbance is measured immediately at wavelength 412 nm. The difference between two absorbance(ΔA=A2 min-A60 min)is calculated, concentration of glutathione can be obtained from standard curve. Result:There is a good linearity between 0.19 to 0.95 g.L-1 glutathione. Regression equation:Y=0.715 4X-0.000 4，r=0.999 9，maximum deviation is less than 6%. Conclusion:The method is cheap, simple, practicable and is applicable to assay of reduced glutathione in the presence of other interefering substances.
, 百拇醫(yī)藥
Key words：glutathione, formaldehyde, cysteine, DTNB▲
谷胱甘肽(GSH)是由谷氨酸、半胱氨酸(Cys)和甘氨酸組成的天然三肽，用途廣泛。利用基因工程微生物生物合成方法是生產(chǎn)谷胱甘肽的主要方式。作為前體之一，半胱氨酸的濃度較高，對谷胱甘肽的測定有干擾。已有幾種方法用于半胱氨酸存在時谷胱甘肽的測定：酶分析方法[1，2]可測高達1 000倍半胱氨酸存在時谷胱甘肽的含量，結(jié)果較準確，但需價格昂貴的輔酶Ⅱ和谷胱甘肽還原酶，并且后者活力變化嚴重影響測量結(jié)果；色譜法[3，4]冗長費時；Jocelyn[5]采用將樣品在硫酸中煮沸1 h的方法，不太安全；Wronski[6，7]方法效果較好，但需用對羥基汞苯甲酸和螢光黃；熒光法[8]容易受干擾，誤差較大；乙二醛酶法[9]需要復雜的技術和設備。針對上述方法的不足，本文在研究甲醛同谷胱甘肽和常見含巰基物質(zhì)反應特點的基礎上結(jié)合巰基的測定方法[10，11]提出一種簡單，快速的新方法，應用于生物合成反應溶液中谷胱甘肽含量的分析取得滿意結(jié)果。
, http://www.www.srpcoatings.com
1 儀器和試劑
752紫外光柵分光光度計(上海第三分析儀器廠)，恒溫水浴槽(上海醫(yī)療器械五廠)。
GSH，Gys，為生化試劑；3%甲醛溶液由分析純試劑加水配制，用NaOH調(diào)節(jié)pH為8.0；0.25 mol.L-1 pH 8.0的Tris-HCl緩沖液由生化試劑配制；0.01 mol.L-1 DTNB[5，5’-二硫代雙(2-硝基苯甲酸)]溶液由生化試劑加0.05 mol.L-1 pH 7.0的磷酸緩沖液配制，存于棕色瓶中，放于低溫暗處備用；DTNB分析溶液由1體積0.01 mol.L-1DTNB溶液加100體積0.25 mol.L-1 pH 8.0的Tris-HCl緩沖液配制而成，現(xiàn)用現(xiàn)配；其它試劑為分析純；所用水為去離子水。
, 百拇醫(yī)藥
2 分析方法
待分析樣品(Cys含量不大于20 mmol.L-1，GSH濃度小于0.9 g.L-1)1 mL 2份，每份加入0.25 mol.L-1 pH 8.0的Tris-HCl緩沖液3 mL，搖勻，再加入3%甲醛1 mL，搖勻，室溫下分別準確靜置2 min和60 min后，立刻取1 mL加入預先恒溫于25 ℃水浴中的DTNB分析溶液5 mL，搖勻，準確靜置5 min后，立刻在波長412 nm處測定吸光度A，算出2者的A值之差ΔA，代入回歸方程計算相應谷胱甘肽濃度，最大誤差不超過6%。
3 結(jié)果
3.1 顯色溶液的穩(wěn)定性 準確稱取GSH溶于pH 6.5去離子水配成0.48 g.L-1的標準溶液，取1 mL按上述方法分析，已知室溫為26 ℃，5 mL DTNB溶液預先恒溫于25 ℃水浴中，分別加入已與甲醛反應2 min和60 min的樣品溶液1 mL后迅速搖勻，以此刻作為反應開始，于不同時間測定吸光度，見表1。可知反應開始1.5 min到10 min之間顯色溶液保持穩(wěn)定，考慮到因季節(jié)不同，與甲醛反應后的樣品溶液溫度變化，1 mL該溶液加入5 mL預先恒溫于25 ℃水浴中的DTNB溶液后需1～3 min才能恢復到25 ℃，選擇5 min為反應時間。
, 百拇醫(yī)藥
表1 顯色溶液在不同反應時間的吸光度 反應時間/min
反應2 min的樣品
反應60 min的樣品
0.5
0.672
0.011
1.5
0.680
0.013
2.5
0.680
0.013
, http://www.www.srpcoatings.com
5.0
0.680
0.013
10
0.680
0.013
15
0.678
0.012
20
0.678
0.012
30
, 百拇醫(yī)藥
0.670
0.011
60
0.649
0.006
3.2 標準曲線的制作 谷胱甘肽含有疏基，按照疏基的測定方法[11，12]可求出GSH的含量。準確稱取GSH溶于pH 6.5去離子水配成0.95 g.L-1的標準溶液，分別取該溶液0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mL，相應加入0.8，0.6，0.4，0.2，0 mL pH 6.5的去離子水，用水代替甲醛作為對照。按分析方法與甲醛反應2 min和60 min后測定結(jié)果見表2。以Y為縱坐標，表示GSH(g.L-1)濃度，以X為橫坐標，表示ΔA，用最小二乘法計算得回歸方程和相關系數(shù)為：
, http://www.www.srpcoatings.com
Y=0.715 4X-0.000 4 r=0.999 9
說明線性關系良好。表2 GSH濃度(g.L-1)與ΔA之間的關系 GSH加入量/
A2 min
A60 min
ΔA
g.L-1
A2 min-A60 min
0.00
0.000
, 百拇醫(yī)藥
0.000
0.000
0.19
0.272
0.013
0.259
0.38
0.553
0.017
0.536
0.57
0.830
0.027
, 百拇醫(yī)藥
0.803
0.76
1.101
0.030
1.071
0.95
1.352
0.034
1.318
3.3 甲醛同Cys和GSH的反應速度 配制濃度為0.95 g.L-1的GSH標準溶液和2.6 g.L-1的Cys標準溶液，按分析方法分別與甲醛反應不同時間后測量A值，用水代替甲醛作為對照。結(jié)果表明(表3)：室溫下pH 8.0時，和甲醛反應2 min后，98.94%的Cys被掩蔽，而GSH只有3.08%；反應1 h后，97.56%的GSH也被掩蔽，由此可知，甲醛同半胱氨酸的反應更快。利用這種反應速度的差異，可以分別測定Cys和GSH的濃度；由此啟發(fā)研究其他含疏基物質(zhì)與甲醛的反應特性。表3 甲醛同Cys和GSH的反應速度 與甲醛反應
, 百拇醫(yī)藥
時間/min
Gys
GSH
A
A
0
2.159(對照)
1.395(對照)
1
0.240
11.22
, http://www.www.srpcoatings.com
1.384
99.21
2
0.023
1.06
1.352
96.92
3
0.019
0.88
1.329
95.27
30
, 百拇醫(yī)藥
0.019
0.88
0.335
24.01
60
0.018
0.88
0.034
2.44
3.4 多種含疏基物質(zhì)共存時GSH含量分析 生物合成GSH溶液中含有細胞泄漏物如輔酶A、蛋白質(zhì)等含疏基物質(zhì)，提取時還用到疏基乙醇和NaHSO3還原氧化型GSH這些物質(zhì)干擾GSH的分析。進一步研究甲醛同這些物質(zhì)的反應性質(zhì)如表4所示。表4 各種含疏基物質(zhì)同甲醛的反應性質(zhì)及對GSH測定的影響 編號
, 百拇醫(yī)藥
樣品
A2 min
A60 min
A2 min-A60 min
對GSH測定的影響
1
0.2 mL GSH(0.95 g.L-1)
0.272
0.013
0.259
, 百拇醫(yī)藥 2
0.2 mL Cys(2.6 g.L-1)
0.005
0.002
0.003
小
3
0.2 mL巰基乙醇(31.67%)
0.499
0.494
0.005
小
, 百拇醫(yī)藥
4
1 mL二硫蘇糖醇(0.21 g.L-1)c
0.683
0.117
0.556
很大
5
1 mL NaHSO3(1.08 g.L-1)
0.119
0.121
, 百拇醫(yī)藥 -0.002
小
6
1 mL木瓜蛋白酶(2.7 g.L-1)a
0.072
0.071
0.001
小
7
1 mLβ-半乳糖苷酶(3 g.L-1)a
0.187
, 百拇醫(yī)藥
0.187
0.000
沒有
8
0.8 mL酵母細胞裂解液
0.170
0.115
0.055
大
(蛋白質(zhì)濃度53 mg.L-1)b
9
0.5 mL E.coli細胞裂解液
, 百拇醫(yī)藥
0.045
0.032
0.013
大
(蛋白質(zhì)濃度39 mg.L-1)b
a.這2種酶含有巰基，用來說明甲醛同蛋白質(zhì)巰基的反應性質(zhì)
b.生物合成GSH的反應系統(tǒng)含有固定化酵母和E.coli細胞，溶液中有這2種細胞的泄漏物如蛋白質(zhì)、輔酶等含巰基物質(zhì)，分析這2個樣品是為了檢驗這些含巰基物質(zhì)對GSH測定的影響
c.二硫蘇糖醇與巰基乙醇和NaHSO3不同，因為和甲醛反應使它的A值減小許多，給分析帶來麻煩；還原反應溶液中的氧化型GSH時只采用巰基乙醇和NaHSO3
, 百拇醫(yī)藥
表4結(jié)果表明，除二硫蘇糖醇外，與甲醛反應的常見含巰基物質(zhì)基本上可分為4種，第1種和甲醛反應2 min后，幾乎完全被掩蔽，如半胱氨酸；第2種和甲醛反應的時間越長，被掩蔽的越多，以致最后被掩蔽，如谷胱甘肽、酵母和E.coli細胞裂解液中的未知成分；第3種與甲醛的反應在2 min時就已完成，部分被掩蔽，2 min和60 min時的A值幾乎一樣，如NaHSO3和木瓜蛋白酶；第4種是基本上不與甲醛反應，如巰基乙醇和半乳糖苷酶。通過求取和甲醛反應2 min和60 min時的A值之差，可將第1、第3、第4種物質(zhì)的干擾消除；第2種含巰基物質(zhì)共存時，可設立不含GSH的溶液作為對照來消除干擾，如在測量生物合成反應溶液中的GSH濃度時，以不加GSH前體的溶液作為對照。總之，無論哪一種干擾物質(zhì)和GSH共存，采用本文的分析方法都可以測定GSH含量。各種樣品按照分析方法測定的GSH含量如表5所示，每種樣品測定之前用水補加至體積為1 mL，表中數(shù)據(jù)為2次分析的平均值。
表5 各種樣品的GSH含量分析結(jié)果 樣品
, http://www.www.srpcoatings.com
GSH加入量/
g.L-1
A2 min
A60 min
A2 min-A60 min
測量值/
g.L-1
測量值與
加入量之比
/%
, http://www.www.srpcoatings.com
1 樣品1+樣品2
0.190
0.280±0.004
0.016±0.004
0.264
0.188
98.95
2 樣品1+樣品3+0.2 mL樣品5
0.190
0.795±0.012
0.533±0.017
0.262
, http://www.www.srpcoatings.com
0.187
98.42
3 樣品1+0.2 mL樣品5+0.2 mL樣品6
0.190
0.308±0.008
0.056±0.014
0.252
0.180
94.74
4 樣品1+樣品8a
0.190
0.440±0.029
, 百拇醫(yī)藥
0.130±0.011
0.254a
0.181
95.26
5 樣品2+0.3 mL樣品8+0.3 mL樣品9a
0.000
0.099±0.010
0.071±0.009
0.028
6 樣品1+樣品2+0.3 mL樣品8+0.3 mL樣品9
0.190
, http://www.www.srpcoatings.com
0.382±0.035
0.095±0.013
0.259a
0.185
97.37
注：樣品編號見表4
a.分析樣品6必須設立對照，即樣品5，原因見文中解釋；計算樣品6的GSH含量時，應采用樣品6的ΔA與樣品5的ΔA之差0.280。分析樣品4時以表4中樣品8為對照
由表5可知，直接將樣品的ΔΑ代入回歸方程得到的測量結(jié)果誤差最大不超過6%，一般小于5%，可以滿足分析要求。
4 討論
, 百拇醫(yī)藥
4.1 本文提出了一種成本小，簡單、快速測定干擾物質(zhì)共存時還原型GSH濃度的新方法，較適合于GSH含量介于0.19～0.95 g.L-1的樣品分析，這時相對誤差較小，如生物合成反應溶液中的GSH濃度測量，一般情況下90 min可以完成分析過程，得到實驗結(jié)果，誤差最大不超過6%，符合生物合成GSH時的分析要求。采用更高濃度的甲醛可以縮短反應時間和測量濃度更高的樣品，此時應注意設立新的標準曲線。
4.2 二硫蘇糖醇非常容易氧化，對GSH測定干擾較大，本方法不適于二硫蘇糖醇共存時GSH的分析測定。
4.3 與甲醛反應性質(zhì)為第1種的物質(zhì)其濃度不應大于表3中的數(shù)據(jù)，如Cys濃度應小于20 mmol.L-1。
4.4 不能使用磷酸緩沖液，因為容易和DTNB溶液發(fā)生顏色反應干擾分析。
, 百拇醫(yī)藥
4.5 顏色反應必須在25 ℃完成，甲醛不改變最后的A值但會稍微延長顏色反應完成的時間，將分析樣品放于25 ℃水浴中5 min足夠達到要求。
4.6 測定含疏基物質(zhì)如輔酶A、蛋白質(zhì)等含量較高的溶液中的GSH濃度時，最好先減少這些物質(zhì)并作對照。
4.7 氧化型GSH還原以后才能使用本分析方法測定�！�
參考文獻：
[1]Tietze F. Enzymic method for quantitative determination of nanogram amounts of total and oxidized glutathione. Anal Biochem, 1969, 27(3):502
[2]Griffith O W. Determination of glutathione and glutathione disulfide using glutathione reductase and 2-vinylpyridine. Anal Biochem, 1980, 106(1):207
, 百拇醫(yī)藥
[3]Newton G L, Dorian R, Fahey R C. Analysis of biological thiols: derivatization with monobromobimane and separation by reverse-phase high-performance liquid chromatograph. Anal Biochem, 1981, 114(2):383
[4]Anderson M E, Meister A. Transport and direct utilization of γ-glutamylcysteine for glutathione synthesis. Proc Natl Acad Sci U S A, 1983, 80(3):707
[5]Jocelyn P C. An assay for glutathione in acid solution. Anal Biochem, 1967,18(3):493
, 百拇醫(yī)藥
[6]Wronski M. The micro-determination of glutathione and cysteine in the presence of each other. Analyst, 1965, 90(11):697
[7]Wronski M. Hydrolysis of cystine-n-peptide bonds in keratin by hydrochloric acid. Aust J Chem, 1966, 19(2):341
[8]Cohn V H, Lyle J. A fluorometric assay for glutathione. Anal Biochem, 1966, 14(1):434
[9]Woodward G E. Glyoxalase Ⅲ, glyoxalase as a reagent for the quantitative microestimation of glutathione. J Biol Chem, 1935, 109(1):1
, 百拇醫(yī)藥
[10]Kortt A A, Liu T Y. On the mechanism of action streptococcal Proteinase I, Active-site titration. Biochemistry, 1973, 12(2):320
[11]Ellman G L. Tissue sulfhydryl groups. Arch Biochem Biophys, 1959, 82(1):70
[12]蔡武城，袁厚積.生物物質(zhì)常用化學分析法.北京：科學出版社，1982.88
收稿日期：1998-11-19, http://www.www.srpcoatings.com