肝細(xì)胞移植——從設(shè)想到臨床應(yīng)用
作者：張偉杰(譯) 吳在德(校)
單位：同濟(jì)醫(yī)科大學(xué)附屬同濟(jì)醫(yī)院
關(guān)鍵詞：
德國醫(yī)學(xué)000204Hepatocelluläre Transplantation-
von den Anfängen bis zum klinischen Einsatz
P.M.Markus，H.Becker
歷史發(fā)展
本世紀(jì)初許多學(xué)者提出了移植健康的細(xì)胞或臟器碎片來治療嚴(yán)重的肝及代謝性疾病的設(shè)想，但細(xì)胞移植的發(fā)展一直與原位器官移植及相應(yīng)學(xué)科相形見絀。直到理論上證實(shí)移植分離的細(xì)胞具有許多優(yōu)點(diǎn)，細(xì)胞移植的研究才獲得新的進(jìn)展。
, http://www.www.srpcoatings.com
早在本世紀(jì)30年代Cameron和Oakley已開始了肝碎片移植的基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)�？茖W(xué)家們?cè)噲D異位移植肝碎片，但大多數(shù)病例肝組織在數(shù)日或數(shù)周內(nèi)即退化或消失。
肝細(xì)胞移植的實(shí)質(zhì)性進(jìn)展是在發(fā)展了分離肝細(xì)胞的方法之后，通過原位灌注膠原酶，成功地獲得了大量高度純化的肝細(xì)胞。而在同一時(shí)期取得的另一進(jìn)展，即通過移植分離的胰島細(xì)胞可至少部分逆轉(zhuǎn)實(shí)驗(yàn)性糖尿病，激勵(lì)了肝細(xì)胞移植在歐美的研究熱潮。Groth等先后報(bào)道，門脈內(nèi)輸注分離的肝細(xì)胞或皮下移植肝腫瘤細(xì)胞可明顯降低Gunn大鼠(高膽紅素血癥大鼠)的膽紅素。這是第一次關(guān)于肝細(xì)胞移植成功地糾正代謝缺陷的報(bào)道。
肝細(xì)胞移植的理論觀點(diǎn)
與原位肝移植不同的是在動(dòng)物模型中肝細(xì)胞移植只需移植肝組織總量的一部分，即可糾正先天性代謝疾病。移植4×107個(gè)肝細(xì)胞，約相當(dāng)于12周齡大鼠5%的總肝細(xì)胞，已經(jīng)明顯提高了急性肝功能衰竭的存活率。對(duì)臨床移植而言，這意味著一個(gè)供肝可分配給多個(gè)受體，從而解決或緩解已存在的供體短缺問題。肝細(xì)胞也可作為原位肝移植前的過渡，從而使較長時(shí)間地等待一個(gè)合適的供肝成為可能或者給自身肝臟再生提供足夠的時(shí)間。
, 百拇醫(yī)藥
門脈內(nèi)或選擇脾內(nèi)移植分離的肝細(xì)胞相對(duì)來說是一個(gè)小手術(shù)。肝細(xì)胞可通過培養(yǎng)或冷凍保存，這樣，一旦發(fā)生急性肝功能衰竭可迅速手術(shù)。肝細(xì)胞移植的理想適應(yīng)證是治療先天性代謝性疾病，因?yàn)檫@些病人的肝細(xì)胞通常并未遭到破壞，而小部分肝細(xì)胞即能代償存在的酶缺陷。原則上有兩種可能性來治療遺傳性代謝缺陷，一種是移植健康的同種肝細(xì)胞，另一種更理想的是移植經(jīng)預(yù)先體外基因處理過的自體肝細(xì)胞。
肝細(xì)胞的植入部位
對(duì)于供體肝細(xì)胞的存活來講，受體肝臟應(yīng)是理想的植入部位，只有此處的基質(zhì)適合肝細(xì)胞的生長，具有與肝非實(shí)質(zhì)細(xì)胞的相互反應(yīng)及存在利于細(xì)胞增殖與分化的肝源性因子。但在早期尚無法使供體肝細(xì)胞定位于受體肝臟內(nèi)，所以在隨后的數(shù)十年內(nèi)人們只移植到用傳統(tǒng)的HE或PAS染色方法能容易證實(shí)供體肝細(xì)胞的部位。
1982年Kusano和Mito首次報(bào)道了移植的肝細(xì)胞在受鼠脾臟內(nèi)的長期存活。直到近年來才嘗試將肝細(xì)胞的“故鄉(xiāng)”——肝臟作為肝細(xì)胞的可能植入部位。但在大鼠肝細(xì)胞植入肝內(nèi)常常導(dǎo)致致命性的門靜脈高壓，所以通過選擇性門脈內(nèi)輸注(即通過暫時(shí)夾閉門脈分支)將供體肝細(xì)胞只移植到大約60%的受體肝內(nèi)。那些暫時(shí)未接受供體肝細(xì)胞的肝葉(約占40%)靜脈回流并未受阻，從而阻止了門脈高壓的形成。
, http://www.www.srpcoatings.com
表1列出了根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道的植入部位和細(xì)胞存活情況。
肝細(xì)胞移植的動(dòng)物模型
文獻(xiàn)報(bào)道中絕大部分以大鼠為理想的動(dòng)物模型。原則上模型的制備分為兩類：外科手術(shù)或化學(xué)藥物誘導(dǎo)的嚴(yán)重肝損傷，或是基因性代謝缺損。Gunn大鼠患有UDP-葡萄糖醛酰轉(zhuǎn)移酶缺陷，常用作Crigler-Najjar綜合征的模型；另一種模型是Nagase大鼠，因基因缺損而導(dǎo)致白蛋白合成障礙；第三種模型是Watanabe兔，相當(dāng)于臨床上的家族性高膽固醇血癥。
表1 肝細(xì)胞的植入部位 部 位
技 術(shù)
存活情況
脾
脾實(shí)質(zhì)內(nèi)
, 百拇醫(yī)藥
+++
肝
門脈內(nèi)
-
選擇性門脈內(nèi)
+
胰
實(shí)質(zhì)內(nèi)
+
肺
肺泡腔
+/-
血管床
+/-
, http://www.www.srpcoatings.com
脂肪組織
+
胸腺
實(shí)質(zhì)內(nèi)
+
唾液腺
實(shí)質(zhì)內(nèi)
+
腹腔
分離的肝細(xì)胞
-
“微屏障”內(nèi)的肝細(xì)胞
++
, http://www.www.srpcoatings.com
包裹的肝細(xì)胞
-
腎被膜下
分離的肝細(xì)胞
+
肝細(xì)胞和胰島細(xì)胞
+
腸系膜
分離的肝細(xì)胞
+
+++明顯的細(xì)胞增殖 ++細(xì)胞增殖良好
+暫時(shí)性細(xì)胞存活 -細(xì)胞未存活
, 百拇醫(yī)藥 Sutherland首次報(bào)道了移植健康的肝細(xì)胞可明顯降低動(dòng)物急性肝功能衰竭的死亡率。由于胰島細(xì)胞可合成胰島素及其他肝源性因子，故在急性肝功能衰竭或在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)如Gunn大鼠中聯(lián)合移植胰島和肝細(xì)胞。后來實(shí)驗(yàn)證實(shí)，移植肝細(xì)胞的存活率通過聯(lián)合移植胰島和肝細(xì)胞而得到改善。
證實(shí)移植的肝細(xì)胞
移植的肝細(xì)胞可通過不同染色技術(shù)在受體得到證實(shí)。通常使用HE染色或用PAS法證實(shí)細(xì)胞內(nèi)的糖原儲(chǔ)積。因?yàn)楦渭?xì)胞在受體脾臟內(nèi)相對(duì)容易發(fā)現(xiàn)，有關(guān)文獻(xiàn)主要局限在以脾為植入器官的移植。另外通過免疫組織化學(xué)可用抗CK-5，-6，-8和-17抗體證實(shí)肝細(xì)胞，CK-7和CK-19證實(shí)膽管上皮。
熒光顯微鏡通過結(jié)合DiI-18和DiO而提供了一個(gè)在受體肝內(nèi)證實(shí)肝細(xì)胞相對(duì)簡單的方法。借助這一技術(shù)可在選擇性門脈內(nèi)證實(shí)移植至少40d后的肝細(xì)胞。
肝細(xì)胞移植的臨床應(yīng)用
, 百拇醫(yī)藥
已有多個(gè)研究小組報(bào)道了人肝細(xì)胞移植的情況。Fox等1998年報(bào)道了1例成功的同種肝細(xì)胞移植治療兒童Ⅰ型Crigler-Najjar綜合征�；純�10歲，每天光治療14～16h，接受一次同種肝細(xì)胞移植。肝細(xì)胞通過經(jīng)皮插入門脈的導(dǎo)管輸注，移植的肝細(xì)胞總計(jì)同齡兒童肝總量的5%。術(shù)后11個(gè)月，在減半光治療下間接膽紅素持續(xù)下降，由術(shù)前的25mg/dl降至13.2mg/dl。
1996年和1997年，Bilir和Strom等分別報(bào)道了人肝細(xì)胞移植治療急性肝功能衰竭的結(jié)果。Strom等報(bào)道的5例患者同種肝細(xì)胞移植作為臨時(shí)過渡，直至找到合適的供肝。全部肝細(xì)胞移植受者的血氨水平均顯著下降，臨床癥狀明顯改善。5例患者隨后接受了原位肝移植術(shù)，其中的3例術(shù)后存活超過20個(gè)月。而對(duì)照組另4例同樣嚴(yán)重的肝功能衰竭患者于3d內(nèi)死亡。
除了這種所謂“過渡”以外，暫時(shí)性的肝功能支持還可贏得寶貴的時(shí)間，爭取自身肝的再生。
急性肝功能衰竭時(shí)肝細(xì)胞移植的另一選擇是所謂的“人工肝支持系統(tǒng)”，這種生物反應(yīng)器內(nèi)置分離的豬肝細(xì)胞作為一暫時(shí)性的體外肝功能支持，直到獲得合適的肝移植物。已有多個(gè)研究組成功地將此應(yīng)用于臨床。這兩種方法并不相互矛盾，因?yàn)楦渭?xì)胞移植的目的首先在于長期替代受損的受體肝臟。
盡管目前臨床移植人的肝細(xì)胞只是一種純?cè)囼?yàn)性的研究，但動(dòng)物實(shí)驗(yàn)資料和最近臨床應(yīng)用的成功展示了長期的樂觀的應(yīng)用前景。分離的肝細(xì)胞在培養(yǎng)過程中的增殖及成功的預(yù)先體外轉(zhuǎn)基因，是人類肝細(xì)胞移植具有應(yīng)用意義的關(guān)鍵所在。, 百拇醫(yī)藥
單位：同濟(jì)醫(yī)科大學(xué)附屬同濟(jì)醫(yī)院
關(guān)鍵詞：
德國醫(yī)學(xué)000204Hepatocelluläre Transplantation-
von den Anfängen bis zum klinischen Einsatz
P.M.Markus，H.Becker
歷史發(fā)展
本世紀(jì)初許多學(xué)者提出了移植健康的細(xì)胞或臟器碎片來治療嚴(yán)重的肝及代謝性疾病的設(shè)想，但細(xì)胞移植的發(fā)展一直與原位器官移植及相應(yīng)學(xué)科相形見絀。直到理論上證實(shí)移植分離的細(xì)胞具有許多優(yōu)點(diǎn)，細(xì)胞移植的研究才獲得新的進(jìn)展。
, http://www.www.srpcoatings.com
早在本世紀(jì)30年代Cameron和Oakley已開始了肝碎片移植的基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)�？茖W(xué)家們?cè)噲D異位移植肝碎片，但大多數(shù)病例肝組織在數(shù)日或數(shù)周內(nèi)即退化或消失。
肝細(xì)胞移植的實(shí)質(zhì)性進(jìn)展是在發(fā)展了分離肝細(xì)胞的方法之后，通過原位灌注膠原酶，成功地獲得了大量高度純化的肝細(xì)胞。而在同一時(shí)期取得的另一進(jìn)展，即通過移植分離的胰島細(xì)胞可至少部分逆轉(zhuǎn)實(shí)驗(yàn)性糖尿病，激勵(lì)了肝細(xì)胞移植在歐美的研究熱潮。Groth等先后報(bào)道，門脈內(nèi)輸注分離的肝細(xì)胞或皮下移植肝腫瘤細(xì)胞可明顯降低Gunn大鼠(高膽紅素血癥大鼠)的膽紅素。這是第一次關(guān)于肝細(xì)胞移植成功地糾正代謝缺陷的報(bào)道。
肝細(xì)胞移植的理論觀點(diǎn)
與原位肝移植不同的是在動(dòng)物模型中肝細(xì)胞移植只需移植肝組織總量的一部分，即可糾正先天性代謝疾病。移植4×107個(gè)肝細(xì)胞，約相當(dāng)于12周齡大鼠5%的總肝細(xì)胞，已經(jīng)明顯提高了急性肝功能衰竭的存活率。對(duì)臨床移植而言，這意味著一個(gè)供肝可分配給多個(gè)受體，從而解決或緩解已存在的供體短缺問題。肝細(xì)胞也可作為原位肝移植前的過渡，從而使較長時(shí)間地等待一個(gè)合適的供肝成為可能或者給自身肝臟再生提供足夠的時(shí)間。
, 百拇醫(yī)藥
門脈內(nèi)或選擇脾內(nèi)移植分離的肝細(xì)胞相對(duì)來說是一個(gè)小手術(shù)。肝細(xì)胞可通過培養(yǎng)或冷凍保存，這樣，一旦發(fā)生急性肝功能衰竭可迅速手術(shù)。肝細(xì)胞移植的理想適應(yīng)證是治療先天性代謝性疾病，因?yàn)檫@些病人的肝細(xì)胞通常并未遭到破壞，而小部分肝細(xì)胞即能代償存在的酶缺陷。原則上有兩種可能性來治療遺傳性代謝缺陷，一種是移植健康的同種肝細(xì)胞，另一種更理想的是移植經(jīng)預(yù)先體外基因處理過的自體肝細(xì)胞。
肝細(xì)胞的植入部位
對(duì)于供體肝細(xì)胞的存活來講，受體肝臟應(yīng)是理想的植入部位，只有此處的基質(zhì)適合肝細(xì)胞的生長，具有與肝非實(shí)質(zhì)細(xì)胞的相互反應(yīng)及存在利于細(xì)胞增殖與分化的肝源性因子。但在早期尚無法使供體肝細(xì)胞定位于受體肝臟內(nèi)，所以在隨后的數(shù)十年內(nèi)人們只移植到用傳統(tǒng)的HE或PAS染色方法能容易證實(shí)供體肝細(xì)胞的部位。
1982年Kusano和Mito首次報(bào)道了移植的肝細(xì)胞在受鼠脾臟內(nèi)的長期存活。直到近年來才嘗試將肝細(xì)胞的“故鄉(xiāng)”——肝臟作為肝細(xì)胞的可能植入部位。但在大鼠肝細(xì)胞植入肝內(nèi)常常導(dǎo)致致命性的門靜脈高壓，所以通過選擇性門脈內(nèi)輸注(即通過暫時(shí)夾閉門脈分支)將供體肝細(xì)胞只移植到大約60%的受體肝內(nèi)。那些暫時(shí)未接受供體肝細(xì)胞的肝葉(約占40%)靜脈回流并未受阻，從而阻止了門脈高壓的形成。
, http://www.www.srpcoatings.com
表1列出了根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道的植入部位和細(xì)胞存活情況。
肝細(xì)胞移植的動(dòng)物模型
文獻(xiàn)報(bào)道中絕大部分以大鼠為理想的動(dòng)物模型。原則上模型的制備分為兩類：外科手術(shù)或化學(xué)藥物誘導(dǎo)的嚴(yán)重肝損傷，或是基因性代謝缺損。Gunn大鼠患有UDP-葡萄糖醛酰轉(zhuǎn)移酶缺陷，常用作Crigler-Najjar綜合征的模型；另一種模型是Nagase大鼠，因基因缺損而導(dǎo)致白蛋白合成障礙；第三種模型是Watanabe兔，相當(dāng)于臨床上的家族性高膽固醇血癥。
表1 肝細(xì)胞的植入部位 部 位
技 術(shù)
存活情況
脾
脾實(shí)質(zhì)內(nèi)
, 百拇醫(yī)藥
+++
肝
門脈內(nèi)
-
選擇性門脈內(nèi)
+
胰
實(shí)質(zhì)內(nèi)
+
肺
肺泡腔
+/-
血管床
+/-
, http://www.www.srpcoatings.com
脂肪組織
+
胸腺
實(shí)質(zhì)內(nèi)
+
唾液腺
實(shí)質(zhì)內(nèi)
+
腹腔
分離的肝細(xì)胞
-
“微屏障”內(nèi)的肝細(xì)胞
++
, http://www.www.srpcoatings.com
包裹的肝細(xì)胞
-
腎被膜下
分離的肝細(xì)胞
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肝細(xì)胞和胰島細(xì)胞
+
腸系膜
分離的肝細(xì)胞
+
+++明顯的細(xì)胞增殖 ++細(xì)胞增殖良好
+暫時(shí)性細(xì)胞存活 -細(xì)胞未存活
, 百拇醫(yī)藥 Sutherland首次報(bào)道了移植健康的肝細(xì)胞可明顯降低動(dòng)物急性肝功能衰竭的死亡率。由于胰島細(xì)胞可合成胰島素及其他肝源性因子，故在急性肝功能衰竭或在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)如Gunn大鼠中聯(lián)合移植胰島和肝細(xì)胞。后來實(shí)驗(yàn)證實(shí)，移植肝細(xì)胞的存活率通過聯(lián)合移植胰島和肝細(xì)胞而得到改善。
證實(shí)移植的肝細(xì)胞
移植的肝細(xì)胞可通過不同染色技術(shù)在受體得到證實(shí)。通常使用HE染色或用PAS法證實(shí)細(xì)胞內(nèi)的糖原儲(chǔ)積。因?yàn)楦渭?xì)胞在受體脾臟內(nèi)相對(duì)容易發(fā)現(xiàn)，有關(guān)文獻(xiàn)主要局限在以脾為植入器官的移植。另外通過免疫組織化學(xué)可用抗CK-5，-6，-8和-17抗體證實(shí)肝細(xì)胞，CK-7和CK-19證實(shí)膽管上皮。
熒光顯微鏡通過結(jié)合DiI-18和DiO而提供了一個(gè)在受體肝內(nèi)證實(shí)肝細(xì)胞相對(duì)簡單的方法。借助這一技術(shù)可在選擇性門脈內(nèi)證實(shí)移植至少40d后的肝細(xì)胞。
肝細(xì)胞移植的臨床應(yīng)用
, 百拇醫(yī)藥
已有多個(gè)研究小組報(bào)道了人肝細(xì)胞移植的情況。Fox等1998年報(bào)道了1例成功的同種肝細(xì)胞移植治療兒童Ⅰ型Crigler-Najjar綜合征�；純�10歲，每天光治療14～16h，接受一次同種肝細(xì)胞移植。肝細(xì)胞通過經(jīng)皮插入門脈的導(dǎo)管輸注，移植的肝細(xì)胞總計(jì)同齡兒童肝總量的5%。術(shù)后11個(gè)月，在減半光治療下間接膽紅素持續(xù)下降，由術(shù)前的25mg/dl降至13.2mg/dl。
1996年和1997年，Bilir和Strom等分別報(bào)道了人肝細(xì)胞移植治療急性肝功能衰竭的結(jié)果。Strom等報(bào)道的5例患者同種肝細(xì)胞移植作為臨時(shí)過渡，直至找到合適的供肝。全部肝細(xì)胞移植受者的血氨水平均顯著下降，臨床癥狀明顯改善。5例患者隨后接受了原位肝移植術(shù)，其中的3例術(shù)后存活超過20個(gè)月。而對(duì)照組另4例同樣嚴(yán)重的肝功能衰竭患者于3d內(nèi)死亡。
除了這種所謂“過渡”以外，暫時(shí)性的肝功能支持還可贏得寶貴的時(shí)間，爭取自身肝的再生。
急性肝功能衰竭時(shí)肝細(xì)胞移植的另一選擇是所謂的“人工肝支持系統(tǒng)”，這種生物反應(yīng)器內(nèi)置分離的豬肝細(xì)胞作為一暫時(shí)性的體外肝功能支持，直到獲得合適的肝移植物。已有多個(gè)研究組成功地將此應(yīng)用于臨床。這兩種方法并不相互矛盾，因?yàn)楦渭?xì)胞移植的目的首先在于長期替代受損的受體肝臟。
盡管目前臨床移植人的肝細(xì)胞只是一種純?cè)囼?yàn)性的研究，但動(dòng)物實(shí)驗(yàn)資料和最近臨床應(yīng)用的成功展示了長期的樂觀的應(yīng)用前景。分離的肝細(xì)胞在培養(yǎng)過程中的增殖及成功的預(yù)先體外轉(zhuǎn)基因，是人類肝細(xì)胞移植具有應(yīng)用意義的關(guān)鍵所在。, 百拇醫(yī)藥