高效液相色譜法測定何首烏及制首烏中羥芪衍生物的含量
作者：魯靜 粟曉黎 董海榮 李民生
單位：魯靜 粟曉黎(中國藥品生物制品檢定所 北京 100050)；董海榮(承德中藥廠 河北 067000)；李民生(山西省藥品檢驗(yàn)所 太原 030001)
關(guān)鍵詞：何首烏 2，3，5，4′-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷；高效液相色譜法
藥物分析雜志000211摘要 目的：建立中藥何首烏專屬性成分的測定方法。方法：應(yīng)用低壓柱色譜法，從中分離得到羥芪衍生物—2，3，5，4′-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷，并以此對(duì)照建立了測定方法。結(jié)果：采用C18色譜柱，25%乙腈為流動(dòng)相，320 nm檢測。線性關(guān)系考察，回歸方程為：Y=1 024.04+1 588 084.61X，r=0.999 9。加樣回收率平均值為99.76%，RSD=1.22%(n=5)。結(jié)論：本法簡便、靈敏、專屬性強(qiáng)，為何首烏及制首烏的質(zhì)量評(píng)價(jià)提供了有效的方法。
, http://www.www.srpcoatings.com
HPLC Determination of Stilbene Derivative in Radix Polygoni Multiflori
Lu Jing and Su Xiaoli
(National Institute for the Control of Pharmaceutical and Biological Products,Beijing 100050)
Dong Hairong
(Chengde Factory of Traditional Chinese Materia Medica,Hebei 067000)
Li Minsheng
(Shanxi Province Institute of Drug Control,Taiyuan 030001)
, http://www.www.srpcoatings.com
Abstract Objective：A stilbene derivative,2,3,5,4′-tetrahydroxy-stilbene-2-O-β-D-glycoside was separated from Radix Polygoni Multiflori by vacuum chromatographic method.And then the HPLC method for determining the content in crude drug was set up.Method:Using octadecyl silyl bonded silica gel as the stationary phase and 25% acetonitrile as mobile phase,with detection at 320 nm.Results:Calibration equation was Y=1 024.04+1 588 084.61X,r=0.999 9.The recovery was 99.76%，RSD=1.22%(n=5).Conclusion:This method is simple,specific,and provides an efficient method for the quality evaluation of Radix Polygoni Multiflori and its preparation.
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Key words Radix Polygoni Multiflori,2,3,5,4′-tetrahydroxy-stilbene-2-O-β-D-glycoside,HPLC
何首烏(Polygonum multiflorum Thunb.)為常用中藥，藥用歷史悠久。在中醫(yī)臨床，生首烏解毒、消癰，潤腸通便；制首烏補(bǔ)肝腎，益精血，烏須發(fā)，強(qiáng)筋骨[1]。現(xiàn)代藥理研究證明其具有抗衰老、降血脂等多種藥理活性，臨床用于防治衰老及動(dòng)脈粥樣硬化、高血壓、慢性氣管炎、糖尿病、神經(jīng)衰弱等中老年疾病[2]。
何首烏含有的化學(xué)成分主要有蒽醌類、羥芪衍生物及磷脂類等。以往中成藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中大多以蒽醌類作為含量指標(biāo)。由于其含有的蒽醌類成分，如大黃素、大黃酚等在同屬大黃、虎杖等藥材中也含有，因此作為指標(biāo)成分專屬性較差。
在何首烏質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究中，我們分離、鑒定了其中含量較高的羥芪類成分—2，3，5，4′-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[2]該成分為抗衰老、降血脂藥理藥效的活性成分，且為何首烏的特征成分。為此，進(jìn)一步建立了高效液相色譜法測定2，3，5，4′-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷的方法，并測定了生首烏和制首烏商品藥材，為首烏藥材的質(zhì)量評(píng)價(jià)提供了一新的指標(biāo)和方法。
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1 儀器和試藥
高效液相色譜儀(日本島津)：LC-10AD泵；SPD-M10A二極管陣列檢測器；CLASS-10A色譜工作站。
試劑：乙腈為色譜純，乙醇、甲醇等為分析純。
藥材：生首烏、制首烏藥材由本所及湖南、浙江、廣西、云南、四川、河南、廣東等省藥品檢驗(yàn)所協(xié)助采集或收購。經(jīng)本所中藥標(biāo)本館張繼主管藥師鑒定。
對(duì)照品：自行提取、分離制備，經(jīng)UV、IR、NMR光譜測定，數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[3]一致。高效液相色譜歸一化法純度大于98.0%。
2 色譜條件
色譜柱：Platinum(Alltech)C18，5 μm，4.6 mm×250 mm；流動(dòng)相：25%乙腈，1 min。mL-1檢測波長：320 nm。進(jìn)樣量10 μL。
, 百拇醫(yī)藥
3 供試品溶液的制備
取本品粉末(過4號(hào)篩)0.2 g，精密稱定，精密加入50%乙醇25 mL，水浴加熱回流30 min，放冷，補(bǔ)足失重，上清液以0.45 μm濾膜濾過，即得。按上述色譜條件測定的色譜圖見圖1。
圖1 樣品色譜分離情況
a.2，3，5，4′-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷
4 方法學(xué)考察
4.1 線性關(guān)系考察 取對(duì)照品適量，精密稱定，加50%乙醇溶解并稀釋制成0.45 mg。mL-1對(duì)照品溶液。取2，4，6，8，10 μL進(jìn)樣，以上述色譜條件測定峰面積值，結(jié)果以進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)(X)，以峰面積值為縱坐標(biāo)(Y)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程為：
, 百拇醫(yī)藥
Y=1 024.04+1 588 084.61X r=0.999 9
結(jié)果顯示：在0.90～4.50 μg范圍，對(duì)照品量與色譜峰面積值呈良好線性關(guān)系。
4.2 色譜峰峰純度和光譜一致性測定 以上述提取方法及色譜條件得到的結(jié)果，供試品溶液中與對(duì)照品相應(yīng)的色譜峰，峰純度系數(shù)為0.999 1；供試品中與對(duì)照品相應(yīng)色譜峰的光譜相似性系數(shù)1.000 0。
4.3 最小檢出量 將上述對(duì)照品溶液稀釋至0.001 8 mg。mL-1，進(jìn)樣1 μL(0.001 8 μg)，仍可檢出大于基線噪音3倍量的色譜峰。
4.4 重復(fù)性測定 取樣品5份，按“3.4”項(xiàng)制備供試品溶液，并按上述色譜條件測定含量，結(jié)果平均含量為2.38%，RSD為2.28%(n=5)。
, 百拇醫(yī)藥
4.5 回收率測定 取已測知含量(2.38%)的樣品0.1 g，精密稱定，精密加入對(duì)照品溶液(0.122 mg。mL-1)25 mL，照上述方法提取、測定5次，結(jié)果平均回收率為99.76%，RSD為1.22%。
5 樣品含量測定
應(yīng)用上述方法，對(duì)9份生首烏和7份制首烏樣品中2，3，5，4′-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷含量進(jìn)行了測定，結(jié)果見表1。
表1 樣品測定結(jié)果 生首烏
制首烏
產(chǎn)地
含量/%
產(chǎn)地
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含量/%
河北安國
6.348
湖北宜昌
5.180
廣東
1.777
廣東
3.304
浙江
1.086
浙江
0.140
, 百拇醫(yī)藥
廣西百色
0.143
廣西隆林
1.163
四川
6.852
四川
4.709
河南
3.309
河南
0.392
云南
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0.697
云南
3.070
湖南
5.874
湖南
2.307
6 討論
6.1 關(guān)于流動(dòng)相系統(tǒng)，曾先后試驗(yàn)了25%，30%，35%，40%甲醇；20%，25%，30%乙腈等，結(jié)果以25%乙腈系統(tǒng)，色譜分離的峰純度最高，與其它成分的色譜峰分離良好。關(guān)于檢測波長，以二極管陣列檢測器測定2，3，5，4′-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷色譜峰的光譜吸收曲線，其在(320±1) nm有最大吸收，因此選擇檢測波長為320 nm。
, 百拇醫(yī)藥
6.2 測定用生首烏藥材粉碎，分別過2號(hào)、4號(hào)篩，以上述色譜條件測定含量。結(jié)果：過2號(hào)篩樣品粉末與顆粒不均勻，加之取樣量較少，平行測定結(jié)果差異較大；而過4號(hào)篩樣品測定結(jié)果均勻性良好。因此，樣品需過4號(hào)篩后取樣測定。
6.3 供試品提取方法，曾先后以甲醇、30%甲醇、25%乙腈、50%乙醇超聲提取，結(jié)果50%乙醇提取率最高；又以50%乙醇超聲提取和加熱提取進(jìn)行比較，結(jié)果以加熱提取測定結(jié)果較高。因此，確定采用50%乙醇加熱提取的方法。
6.4 2，3，5，4′-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷成分對(duì)光不穩(wěn)定，試驗(yàn)中比較了避光與不避光操作對(duì)含量測定的影響，結(jié)果(表2)表明整個(gè)操作應(yīng)避光進(jìn)行。
表2 避光與不避光操作的比較(%) 放置時(shí)間/h
避光
, 百拇醫(yī)藥 不避光
0
2.294
2.296
4
2.342
2.154
24
2.359
2.030
RSD/%
1.43
6.16
, http://www.www.srpcoatings.com
6.5 對(duì)9份生首烏樣品的測定結(jié)果表明樣品中2，3，5，4′-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷含量差異較大。其中，廣西百色、云南2份樣品較低。這2份樣品，外形上也與傳統(tǒng)藥材有較大差異(“云錦花紋”不明顯，有一明顯木心)。據(jù)鑒定，與近年藥材市場上出現(xiàn)的類似物相似，可能來源于同屬或近緣植物，有待深入研究。
6.6 所測的7份制首烏樣品，含量差異也較明顯。這里有藥材來源的因素，也有炮制加工方法的影響。我們擬進(jìn)一步對(duì)制首烏的炮制方法進(jìn)行考察，以制定合理的限量標(biāo)準(zhǔn)。
參考文獻(xiàn)
1，中國藥典.1995.一部：149
2，鄧文龍，龔世蓉. 何首烏研究進(jìn)展.中草藥，1987，18(3)：42
3，李建北，林茂.何首烏化學(xué)成分的研究.中草藥，1993，24(3)：115
(本文于1999年1月25日收到), http://www.www.srpcoatings.com
單位：魯靜 粟曉黎(中國藥品生物制品檢定所 北京 100050)；董海榮(承德中藥廠 河北 067000)；李民生(山西省藥品檢驗(yàn)所 太原 030001)
關(guān)鍵詞：何首烏 2，3，5，4′-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷；高效液相色譜法
藥物分析雜志000211摘要 目的：建立中藥何首烏專屬性成分的測定方法。方法：應(yīng)用低壓柱色譜法，從中分離得到羥芪衍生物—2，3，5，4′-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷，并以此對(duì)照建立了測定方法。結(jié)果：采用C18色譜柱，25%乙腈為流動(dòng)相，320 nm檢測。線性關(guān)系考察，回歸方程為：Y=1 024.04+1 588 084.61X，r=0.999 9。加樣回收率平均值為99.76%，RSD=1.22%(n=5)。結(jié)論：本法簡便、靈敏、專屬性強(qiáng)，為何首烏及制首烏的質(zhì)量評(píng)價(jià)提供了有效的方法。
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HPLC Determination of Stilbene Derivative in Radix Polygoni Multiflori
Lu Jing and Su Xiaoli
(National Institute for the Control of Pharmaceutical and Biological Products,Beijing 100050)
Dong Hairong
(Chengde Factory of Traditional Chinese Materia Medica,Hebei 067000)
Li Minsheng
(Shanxi Province Institute of Drug Control,Taiyuan 030001)
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Abstract Objective：A stilbene derivative,2,3,5,4′-tetrahydroxy-stilbene-2-O-β-D-glycoside was separated from Radix Polygoni Multiflori by vacuum chromatographic method.And then the HPLC method for determining the content in crude drug was set up.Method:Using octadecyl silyl bonded silica gel as the stationary phase and 25% acetonitrile as mobile phase,with detection at 320 nm.Results:Calibration equation was Y=1 024.04+1 588 084.61X,r=0.999 9.The recovery was 99.76%，RSD=1.22%(n=5).Conclusion:This method is simple,specific,and provides an efficient method for the quality evaluation of Radix Polygoni Multiflori and its preparation.
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Key words Radix Polygoni Multiflori,2,3,5,4′-tetrahydroxy-stilbene-2-O-β-D-glycoside,HPLC
何首烏(Polygonum multiflorum Thunb.)為常用中藥，藥用歷史悠久。在中醫(yī)臨床，生首烏解毒、消癰，潤腸通便；制首烏補(bǔ)肝腎，益精血，烏須發(fā)，強(qiáng)筋骨[1]。現(xiàn)代藥理研究證明其具有抗衰老、降血脂等多種藥理活性，臨床用于防治衰老及動(dòng)脈粥樣硬化、高血壓、慢性氣管炎、糖尿病、神經(jīng)衰弱等中老年疾病[2]。
何首烏含有的化學(xué)成分主要有蒽醌類、羥芪衍生物及磷脂類等。以往中成藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中大多以蒽醌類作為含量指標(biāo)。由于其含有的蒽醌類成分，如大黃素、大黃酚等在同屬大黃、虎杖等藥材中也含有，因此作為指標(biāo)成分專屬性較差。
在何首烏質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究中，我們分離、鑒定了其中含量較高的羥芪類成分—2，3，5，4′-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[2]該成分為抗衰老、降血脂藥理藥效的活性成分，且為何首烏的特征成分。為此，進(jìn)一步建立了高效液相色譜法測定2，3，5，4′-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷的方法，并測定了生首烏和制首烏商品藥材，為首烏藥材的質(zhì)量評(píng)價(jià)提供了一新的指標(biāo)和方法。
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1 儀器和試藥
高效液相色譜儀(日本島津)：LC-10AD泵；SPD-M10A二極管陣列檢測器；CLASS-10A色譜工作站。
試劑：乙腈為色譜純，乙醇、甲醇等為分析純。
藥材：生首烏、制首烏藥材由本所及湖南、浙江、廣西、云南、四川、河南、廣東等省藥品檢驗(yàn)所協(xié)助采集或收購。經(jīng)本所中藥標(biāo)本館張繼主管藥師鑒定。
對(duì)照品：自行提取、分離制備，經(jīng)UV、IR、NMR光譜測定，數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[3]一致。高效液相色譜歸一化法純度大于98.0%。
2 色譜條件
色譜柱：Platinum(Alltech)C18，5 μm，4.6 mm×250 mm；流動(dòng)相：25%乙腈，1 min。mL-1檢測波長：320 nm。進(jìn)樣量10 μL。
, 百拇醫(yī)藥
3 供試品溶液的制備
取本品粉末(過4號(hào)篩)0.2 g，精密稱定，精密加入50%乙醇25 mL，水浴加熱回流30 min，放冷，補(bǔ)足失重，上清液以0.45 μm濾膜濾過，即得。按上述色譜條件測定的色譜圖見圖1。
圖1 樣品色譜分離情況
a.2，3，5，4′-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷
4 方法學(xué)考察
4.1 線性關(guān)系考察 取對(duì)照品適量，精密稱定，加50%乙醇溶解并稀釋制成0.45 mg。mL-1對(duì)照品溶液。取2，4，6，8，10 μL進(jìn)樣，以上述色譜條件測定峰面積值，結(jié)果以進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)(X)，以峰面積值為縱坐標(biāo)(Y)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程為：
, 百拇醫(yī)藥
Y=1 024.04+1 588 084.61X r=0.999 9
結(jié)果顯示：在0.90～4.50 μg范圍，對(duì)照品量與色譜峰面積值呈良好線性關(guān)系。
4.2 色譜峰峰純度和光譜一致性測定 以上述提取方法及色譜條件得到的結(jié)果，供試品溶液中與對(duì)照品相應(yīng)的色譜峰，峰純度系數(shù)為0.999 1；供試品中與對(duì)照品相應(yīng)色譜峰的光譜相似性系數(shù)1.000 0。
4.3 最小檢出量 將上述對(duì)照品溶液稀釋至0.001 8 mg。mL-1，進(jìn)樣1 μL(0.001 8 μg)，仍可檢出大于基線噪音3倍量的色譜峰。
4.4 重復(fù)性測定 取樣品5份，按“3.4”項(xiàng)制備供試品溶液，并按上述色譜條件測定含量，結(jié)果平均含量為2.38%，RSD為2.28%(n=5)。
, 百拇醫(yī)藥
4.5 回收率測定 取已測知含量(2.38%)的樣品0.1 g，精密稱定，精密加入對(duì)照品溶液(0.122 mg。mL-1)25 mL，照上述方法提取、測定5次，結(jié)果平均回收率為99.76%，RSD為1.22%。
5 樣品含量測定
應(yīng)用上述方法，對(duì)9份生首烏和7份制首烏樣品中2，3，5，4′-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷含量進(jìn)行了測定，結(jié)果見表1。
表1 樣品測定結(jié)果 生首烏
制首烏
產(chǎn)地
含量/%
產(chǎn)地
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含量/%
河北安國
6.348
湖北宜昌
5.180
廣東
1.777
廣東
3.304
浙江
1.086
浙江
0.140
, 百拇醫(yī)藥
廣西百色
0.143
廣西隆林
1.163
四川
6.852
四川
4.709
河南
3.309
河南
0.392
云南
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云南
3.070
湖南
5.874
湖南
2.307
6 討論
6.1 關(guān)于流動(dòng)相系統(tǒng)，曾先后試驗(yàn)了25%，30%，35%，40%甲醇；20%，25%，30%乙腈等，結(jié)果以25%乙腈系統(tǒng)，色譜分離的峰純度最高，與其它成分的色譜峰分離良好。關(guān)于檢測波長，以二極管陣列檢測器測定2，3，5，4′-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷色譜峰的光譜吸收曲線，其在(320±1) nm有最大吸收，因此選擇檢測波長為320 nm。
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6.2 測定用生首烏藥材粉碎，分別過2號(hào)、4號(hào)篩，以上述色譜條件測定含量。結(jié)果：過2號(hào)篩樣品粉末與顆粒不均勻，加之取樣量較少，平行測定結(jié)果差異較大；而過4號(hào)篩樣品測定結(jié)果均勻性良好。因此，樣品需過4號(hào)篩后取樣測定。
6.3 供試品提取方法，曾先后以甲醇、30%甲醇、25%乙腈、50%乙醇超聲提取，結(jié)果50%乙醇提取率最高；又以50%乙醇超聲提取和加熱提取進(jìn)行比較，結(jié)果以加熱提取測定結(jié)果較高。因此，確定采用50%乙醇加熱提取的方法。
6.4 2，3，5，4′-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷成分對(duì)光不穩(wěn)定，試驗(yàn)中比較了避光與不避光操作對(duì)含量測定的影響，結(jié)果(表2)表明整個(gè)操作應(yīng)避光進(jìn)行。
表2 避光與不避光操作的比較(%) 放置時(shí)間/h
避光
, 百拇醫(yī)藥 不避光
0
2.294
2.296
4
2.342
2.154
24
2.359
2.030
RSD/%
1.43
6.16
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6.5 對(duì)9份生首烏樣品的測定結(jié)果表明樣品中2，3，5，4′-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷含量差異較大。其中，廣西百色、云南2份樣品較低。這2份樣品，外形上也與傳統(tǒng)藥材有較大差異(“云錦花紋”不明顯，有一明顯木心)。據(jù)鑒定，與近年藥材市場上出現(xiàn)的類似物相似，可能來源于同屬或近緣植物，有待深入研究。
6.6 所測的7份制首烏樣品，含量差異也較明顯。這里有藥材來源的因素，也有炮制加工方法的影響。我們擬進(jìn)一步對(duì)制首烏的炮制方法進(jìn)行考察，以制定合理的限量標(biāo)準(zhǔn)。
參考文獻(xiàn)
1，中國藥典.1995.一部：149
2，鄧文龍，龔世蓉. 何首烏研究進(jìn)展.中草藥，1987，18(3)：42
3，李建北，林茂.何首烏化學(xué)成分的研究.中草藥，1993，24(3)：115
(本文于1999年1月25日收到), http://www.www.srpcoatings.com