RP-HPLC法測定貫葉連翹片劑中有效成分金絲桃素和金絲桃苷的含量
作者：王峰 高天兵 田金改
單位：王峰 高天兵 田金改(中國藥品生物制品檢定所 北京 100050)
關(guān)鍵詞：貫葉連翹；金絲桃素；金絲桃苷；RP-HPLC
藥物分析雜志000210 摘要 目的：采用RP-HPLC法測定貫葉連翹片劑中有效成分金絲桃素(hypericin)和金絲桃苷(hyperoside)的含量。方法：分別使用ODS和ODS-2色譜柱，流動相分別是1.56 %磷酸二氫鈉(用磷酸調(diào)pH至2.1)-甲醇-醋酸乙酯(1∶4∶1)及甲醇-0.5%磷酸(45∶55，用三乙胺調(diào)pH至3.0)，檢測波長分別為590 nm，360 nm。結(jié)果：加樣回收率分別為98.32%(n=5),96.04%(n=5)。金絲桃素的進(jìn)樣量為0.009 8～0.16 μg、金絲桃苷的進(jìn)樣量為0.43～3.42 μg時(shí)，線性關(guān)系良好。結(jié)論：本方法有良好的重現(xiàn)性及精密度。
, 百拇醫(yī)藥
Determination of Effective Compounds Hypericin and Hyperoside in Hypericum perforatum Tablets by RP-HPLC
Wang Feng, Gao Tianbing and Tian Jingai
(National Institute for the Control of Pharmaceutical and Biological Products, Beijin 100050)
Abstract Objective：To determine hypericin and hyperoside, which are two effective constituents of Hypericum perforatum by RP-HPLC.Method:Hypericin and hyperoside were separated by ODS column with 1.56 % sodium dihydrogen phosphate (adjusted to pH=2.1 with phosphoric acid)-methanol-ethyl acetate(1∶4∶1) as mobile phase and ODS-2 column with methanol-0.5% phosphoric acid(45∶55，adjusted to pH=3.0 with triethylamine) as mobile phase, and detected with UV/ vis at 590 nm and 360 nm respectively.Result:The linear ranges of hypericin and hyperoside were 0.009 8～0.16 μg and 0.43～3.42 μg, respectively. The recoveries of them were 98.32% (n=5) and 96.04% (n=5), respectively.Conclusion:These methods had good reproducibility and sensitivity.
, 百拇醫(yī)藥
Key words Hypericum perforatum L., hypericin, hyperoside, RP-HPLC
貫葉連翹(Hypericum perforatum L.)含有金絲桃苷(Hyperoside)、槲皮素、槲皮苷、綠原酸、咖啡酸、衣馬寧(Imanin)、金絲桃素(Hypericin)等成分，傳統(tǒng)理論認(rèn)為其有清熱解毒、收斂止血、利尿等功效，現(xiàn)代藥理學(xué)研究證實(shí)有收縮血管、升高血壓、利膽、抗菌、驅(qū)蟲等作用，其中金絲桃素類成分還具有治療精神抑郁的作用[1]，而近年來的研究結(jié)果進(jìn)一步表明，金絲桃素對于愛滋病、腫瘤等亦有一定的治療作用[2～4]。李星海等[5]報(bào)道了用薄層-紫外分光光度法測定3種金絲桃屬植物中金絲桃苷的含量，沙明等[6]報(bào)道了采用HPLC法測定朝鮮淫羊藿中金絲桃苷的含量；Micali等[7,8]分別報(bào)道金絲桃素的測定方法；但未見采用HPLC法測定天然藥物制劑中金絲桃素含量的報(bào)道。本文建立了用RP-HPLC法測定貫葉連翹片劑中有效成分金絲桃素和金絲桃苷含量，分離效果好，方法快速準(zhǔn)確，重現(xiàn)性好。
, 百拇醫(yī)藥
1 儀器與試劑
PE 200高效液相色譜儀，PE LC-295紫外可見檢測器。
金絲桃素對照品(由德國Willmar Schwabe公司提供，純度>98%)，金絲桃苷對照品(德國Carl Both公司，純度>98%)，甲醇、醋酸乙酯、磷酸二氫鈉、磷酸、三乙胺等均為分析純(北京化工廠)。
樣品由德國Willmar Schwabe公司提供，每粒300 mg。
2 色譜條件
2.1 金絲桃素 色譜柱：Inerteil ODS(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相：1.56%磷酸二氫鈉(用磷酸調(diào)pH至2.1)-甲醇-醋酸乙酯(1∶4∶1)，流速：1 mL。min-1；檢測波長：590 nm；柱溫：室溫；進(jìn)樣量：20 μL。色譜圖見圖1。
, http://www.www.srpcoatings.com
圖1 金絲桃素對照品(A)及樣品(B)色譜圖
1.金絲桃素(9.36 min)
2.2 金絲桃苷 色譜柱：Inerteil ODS-2(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相：甲醇-0.5 %磷酸(45∶55，用三乙胺調(diào)pH至3.0)，流速：1 mL.min-1；檢測波長：360 nm，柱溫：35 ℃；進(jìn)樣量：10 μL。色譜圖見圖2。
圖2 金絲桃苷對照品(A)及樣品(B)色譜圖
1.金絲桃苷(8.95 min)
3 線性關(guān)系
, 百拇醫(yī)藥 精密稱取金絲桃素對照品2.5 mg，置100 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，精密吸取此溶液0，1，2，4，8，12，16 mL，分別置于50 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，分別進(jìn)樣20 μL，測定，以進(jìn)樣量(μg)為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，求得回歸方程為：
Y=-1 345.2+2 639 612.0 X r=0.999 9
說明金絲桃素的進(jìn)樣量在0.009 8～0.16 μg范圍內(nèi)呈良好線性。
精密稱取金絲桃苷對照品10 mg，置25 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，精密吸取此溶液1，2，4，6，8 mL，分別置于10 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，分別進(jìn)樣10 μL，測定，求得回歸方程為：
Y=-30 822.0+2 343 235.8X r=0.999 9
, http://www.www.srpcoatings.com
說明金絲桃苷的進(jìn)樣量在0.43～3.42 μg范圍內(nèi)呈良好線性。
4 回收率試驗(yàn)
取樣品0.05 g，精密稱定，精密加入4.88 μg.mL-1金絲桃素對照品溶液3.0 mL，金絲桃苷對照品1 mg，其余操作同樣品測定，測定回收率(n=5)。測得金絲桃素、金絲桃苷的平均回收率分別為98.32%、96.04%，RSD分別為1.4%，1.2%。說明2種成分互不干擾。
5 精密度試驗(yàn)
分別精密吸取9.76 μg.mL-1金絲桃素對照品溶液20 μL，0.214 mg.mL-1金絲桃苷對照品溶液10 μL，連續(xù)進(jìn)樣5次，測得峰面積，結(jié)果金絲桃素和金絲桃苷的RSD分別為0.71%和1.2%。
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6 重現(xiàn)性試驗(yàn)
取同一份樣品，按樣品測定方法分別制備5份樣品溶液，分別在各自的色譜條件下測定含量。結(jié)果金絲桃素和金絲桃苷的RSD分別為1.2 %和2.2 %。
7 樣品測定
取樣品研細(xì)，精密稱取0.1 g，置25 mL量瓶中，加甲醇20 mL，超聲處理10 min，放冷，加甲醇至刻度，搖勻，置室內(nèi)放置2 h，用0.45 μm濾膜濾過，取續(xù)濾液，分別在各自的色譜條件下測定(n=6)。結(jié)果見表1。
8 討論
8.1 檢測波長的選擇 據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[9]，金絲桃素在284，331，375，473，508.5，548，590 nm處均有吸收。其中590 nm處為最大吸收；金絲桃苷在256(257)，358(361)nm處均有吸收。經(jīng)試驗(yàn)結(jié)果證明金絲桃素在590 nm處、金絲桃苷在360 nm處測得樣品干擾較少，且分離效果良好，故選用此波長。
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表1 樣品測定結(jié)果(n=6) 樣品
金絲桃素
金絲桃苷
含量/mg.g-1
RSD/%
含量/mg.g-1
RSD/%
1
0.18
0.21
46.58
, 百拇醫(yī)藥
0.5
2
0.46
1.7
28.76
1.6
3
0.34
0.38
36.11
1.4
8.2 穩(wěn)定性試驗(yàn)
8.2.1 光穩(wěn)定性試驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，光照對樣品溶液中金絲桃素含量有一定的影響，因此將新制備的樣品溶液分別置日光及室內(nèi)自然光下放置0，0.5，1，1.5，2 h，測定，結(jié)果表明見光放置1.5 h后，金絲桃素峰面積基本穩(wěn)定。
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8.2.2 熱穩(wěn)定性試驗(yàn) 為考察溫度對金絲桃素的影響，將樣品室溫下測定及置50，70，90 ℃水浴中加熱1 h，試驗(yàn)過程中注意避光，放置室溫后測定，結(jié)果表明溫度對金絲桃素影響不大。
8.3 提取時(shí)間的選擇 實(shí)驗(yàn)中，分別將樣品超聲處理5，10，15，20，30 min，分別在各自的色譜條件下測定金絲桃苷和金絲桃素含量。結(jié)果表明，超聲處理10 min后，金絲桃苷和金絲桃素基本提取完全。
8.4 普通ODS柱與ODS-2柱不同之處在于，普通ODS柱所用填料含有較多的自由硅醇基團(tuán)，易與呈酸堿性的化合物發(fā)生作用，而ODS-2則為采用封尾技術(shù)，自由硅醇基團(tuán)水平極低的填料，基本不與呈酸堿性的化合物發(fā)生作用，使呈酸堿性的化合物能夠得到理想的峰形。
參考文獻(xiàn)
1，江蘇新醫(yī)學(xué)院. 中藥大辭典. 上海：上�？萍汲霭嫔�, 1986. 1448
, http://www.www.srpcoatings.com
2，Vlietinck AJ, De Bruyne, Apers S, et al. Plant-derived leading compounds for chemotherapy of human immunodeficiency virus (HIV) infection. Planta Med, 1998, 64(2)：97
3，趙晶，張致平，陳鴻珊. 金絲桃素和乙基金絲桃素的全合成及對人免疫缺陷逆轉(zhuǎn)錄酶的抑制活性. 藥學(xué)學(xué)報(bào)， 1998, 33(1)：67
4，Vander Werf QM, Saxton RE, Chang A, et al. Hypericin：a new laser phototargeting agent for human cancer cells. Laryngoscope, 1996, 106(4)：479
5，李星海，王軍憲，唐有明. 秦嶺三種金絲桃屬植物中金絲桃苷的含量測定. 西北藥學(xué)雜志， 1994, 9(1)：18
, 百拇醫(yī)藥
6，沙明，曹愛民，楊松松. 高效液相色譜法測定朝鮮淫羊藿中金絲桃苷的含量. 中國中藥雜志， 1995, 20(6)：357
7，Micali G, Lanuzza F, Gurro P. High-performance liquid chromatographic determination of the biologically active principle hypericin in phytotherapeutic vegetable extracts and alcoholic beverages. J Chromatogr A, 1996, 731(1-2):336
8，Liebes L, Mazur R, Freeman D, et al. A method for the quantitation of Hypericin, an antiviral agent, in biological fluids by high-performance liquid chromatography. Anal Biochem, 1991, 195(1)：77
9，國家醫(yī)藥管理局中草藥情報(bào)中心站. 植物藥有效成分手冊. 北京：人民衛(wèi)生出版社，1986. 596
(本文于1998年12月29日收到), 百拇醫(yī)藥
單位：王峰 高天兵 田金改(中國藥品生物制品檢定所 北京 100050)
關(guān)鍵詞：貫葉連翹；金絲桃素；金絲桃苷；RP-HPLC
藥物分析雜志000210 摘要 目的：采用RP-HPLC法測定貫葉連翹片劑中有效成分金絲桃素(hypericin)和金絲桃苷(hyperoside)的含量。方法：分別使用ODS和ODS-2色譜柱，流動相分別是1.56 %磷酸二氫鈉(用磷酸調(diào)pH至2.1)-甲醇-醋酸乙酯(1∶4∶1)及甲醇-0.5%磷酸(45∶55，用三乙胺調(diào)pH至3.0)，檢測波長分別為590 nm，360 nm。結(jié)果：加樣回收率分別為98.32%(n=5),96.04%(n=5)。金絲桃素的進(jìn)樣量為0.009 8～0.16 μg、金絲桃苷的進(jìn)樣量為0.43～3.42 μg時(shí)，線性關(guān)系良好。結(jié)論：本方法有良好的重現(xiàn)性及精密度。
, 百拇醫(yī)藥
Determination of Effective Compounds Hypericin and Hyperoside in Hypericum perforatum Tablets by RP-HPLC
Wang Feng, Gao Tianbing and Tian Jingai
(National Institute for the Control of Pharmaceutical and Biological Products, Beijin 100050)
Abstract Objective：To determine hypericin and hyperoside, which are two effective constituents of Hypericum perforatum by RP-HPLC.Method:Hypericin and hyperoside were separated by ODS column with 1.56 % sodium dihydrogen phosphate (adjusted to pH=2.1 with phosphoric acid)-methanol-ethyl acetate(1∶4∶1) as mobile phase and ODS-2 column with methanol-0.5% phosphoric acid(45∶55，adjusted to pH=3.0 with triethylamine) as mobile phase, and detected with UV/ vis at 590 nm and 360 nm respectively.Result:The linear ranges of hypericin and hyperoside were 0.009 8～0.16 μg and 0.43～3.42 μg, respectively. The recoveries of them were 98.32% (n=5) and 96.04% (n=5), respectively.Conclusion:These methods had good reproducibility and sensitivity.
, 百拇醫(yī)藥
Key words Hypericum perforatum L., hypericin, hyperoside, RP-HPLC
貫葉連翹(Hypericum perforatum L.)含有金絲桃苷(Hyperoside)、槲皮素、槲皮苷、綠原酸、咖啡酸、衣馬寧(Imanin)、金絲桃素(Hypericin)等成分，傳統(tǒng)理論認(rèn)為其有清熱解毒、收斂止血、利尿等功效，現(xiàn)代藥理學(xué)研究證實(shí)有收縮血管、升高血壓、利膽、抗菌、驅(qū)蟲等作用，其中金絲桃素類成分還具有治療精神抑郁的作用[1]，而近年來的研究結(jié)果進(jìn)一步表明，金絲桃素對于愛滋病、腫瘤等亦有一定的治療作用[2～4]。李星海等[5]報(bào)道了用薄層-紫外分光光度法測定3種金絲桃屬植物中金絲桃苷的含量，沙明等[6]報(bào)道了采用HPLC法測定朝鮮淫羊藿中金絲桃苷的含量；Micali等[7,8]分別報(bào)道金絲桃素的測定方法；但未見采用HPLC法測定天然藥物制劑中金絲桃素含量的報(bào)道。本文建立了用RP-HPLC法測定貫葉連翹片劑中有效成分金絲桃素和金絲桃苷含量，分離效果好，方法快速準(zhǔn)確，重現(xiàn)性好。
, 百拇醫(yī)藥
1 儀器與試劑
PE 200高效液相色譜儀，PE LC-295紫外可見檢測器。
金絲桃素對照品(由德國Willmar Schwabe公司提供，純度>98%)，金絲桃苷對照品(德國Carl Both公司，純度>98%)，甲醇、醋酸乙酯、磷酸二氫鈉、磷酸、三乙胺等均為分析純(北京化工廠)。
樣品由德國Willmar Schwabe公司提供，每粒300 mg。
2 色譜條件
2.1 金絲桃素 色譜柱：Inerteil ODS(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相：1.56%磷酸二氫鈉(用磷酸調(diào)pH至2.1)-甲醇-醋酸乙酯(1∶4∶1)，流速：1 mL。min-1；檢測波長：590 nm；柱溫：室溫；進(jìn)樣量：20 μL。色譜圖見圖1。
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圖1 金絲桃素對照品(A)及樣品(B)色譜圖
1.金絲桃素(9.36 min)
2.2 金絲桃苷 色譜柱：Inerteil ODS-2(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相：甲醇-0.5 %磷酸(45∶55，用三乙胺調(diào)pH至3.0)，流速：1 mL.min-1；檢測波長：360 nm，柱溫：35 ℃；進(jìn)樣量：10 μL。色譜圖見圖2。
圖2 金絲桃苷對照品(A)及樣品(B)色譜圖
1.金絲桃苷(8.95 min)
3 線性關(guān)系
, 百拇醫(yī)藥 精密稱取金絲桃素對照品2.5 mg，置100 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，精密吸取此溶液0，1，2，4，8，12，16 mL，分別置于50 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，分別進(jìn)樣20 μL，測定，以進(jìn)樣量(μg)為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，求得回歸方程為：
Y=-1 345.2+2 639 612.0 X r=0.999 9
說明金絲桃素的進(jìn)樣量在0.009 8～0.16 μg范圍內(nèi)呈良好線性。
精密稱取金絲桃苷對照品10 mg，置25 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，精密吸取此溶液1，2，4，6，8 mL，分別置于10 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，分別進(jìn)樣10 μL，測定，求得回歸方程為：
Y=-30 822.0+2 343 235.8X r=0.999 9
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說明金絲桃苷的進(jìn)樣量在0.43～3.42 μg范圍內(nèi)呈良好線性。
4 回收率試驗(yàn)
取樣品0.05 g，精密稱定，精密加入4.88 μg.mL-1金絲桃素對照品溶液3.0 mL，金絲桃苷對照品1 mg，其余操作同樣品測定，測定回收率(n=5)。測得金絲桃素、金絲桃苷的平均回收率分別為98.32%、96.04%，RSD分別為1.4%，1.2%。說明2種成分互不干擾。
5 精密度試驗(yàn)
分別精密吸取9.76 μg.mL-1金絲桃素對照品溶液20 μL，0.214 mg.mL-1金絲桃苷對照品溶液10 μL，連續(xù)進(jìn)樣5次，測得峰面積，結(jié)果金絲桃素和金絲桃苷的RSD分別為0.71%和1.2%。
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6 重現(xiàn)性試驗(yàn)
取同一份樣品，按樣品測定方法分別制備5份樣品溶液，分別在各自的色譜條件下測定含量。結(jié)果金絲桃素和金絲桃苷的RSD分別為1.2 %和2.2 %。
7 樣品測定
取樣品研細(xì)，精密稱取0.1 g，置25 mL量瓶中，加甲醇20 mL，超聲處理10 min，放冷，加甲醇至刻度，搖勻，置室內(nèi)放置2 h，用0.45 μm濾膜濾過，取續(xù)濾液，分別在各自的色譜條件下測定(n=6)。結(jié)果見表1。
8 討論
8.1 檢測波長的選擇 據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[9]，金絲桃素在284，331，375，473，508.5，548，590 nm處均有吸收。其中590 nm處為最大吸收；金絲桃苷在256(257)，358(361)nm處均有吸收。經(jīng)試驗(yàn)結(jié)果證明金絲桃素在590 nm處、金絲桃苷在360 nm處測得樣品干擾較少，且分離效果良好，故選用此波長。
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表1 樣品測定結(jié)果(n=6) 樣品
金絲桃素
金絲桃苷
含量/mg.g-1
RSD/%
含量/mg.g-1
RSD/%
1
0.18
0.21
46.58
, 百拇醫(yī)藥
0.5
2
0.46
1.7
28.76
1.6
3
0.34
0.38
36.11
1.4
8.2 穩(wěn)定性試驗(yàn)
8.2.1 光穩(wěn)定性試驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，光照對樣品溶液中金絲桃素含量有一定的影響，因此將新制備的樣品溶液分別置日光及室內(nèi)自然光下放置0，0.5，1，1.5，2 h，測定，結(jié)果表明見光放置1.5 h后，金絲桃素峰面積基本穩(wěn)定。
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8.2.2 熱穩(wěn)定性試驗(yàn) 為考察溫度對金絲桃素的影響，將樣品室溫下測定及置50，70，90 ℃水浴中加熱1 h，試驗(yàn)過程中注意避光，放置室溫后測定，結(jié)果表明溫度對金絲桃素影響不大。
8.3 提取時(shí)間的選擇 實(shí)驗(yàn)中，分別將樣品超聲處理5，10，15，20，30 min，分別在各自的色譜條件下測定金絲桃苷和金絲桃素含量。結(jié)果表明，超聲處理10 min后，金絲桃苷和金絲桃素基本提取完全。
8.4 普通ODS柱與ODS-2柱不同之處在于，普通ODS柱所用填料含有較多的自由硅醇基團(tuán)，易與呈酸堿性的化合物發(fā)生作用，而ODS-2則為采用封尾技術(shù)，自由硅醇基團(tuán)水平極低的填料，基本不與呈酸堿性的化合物發(fā)生作用，使呈酸堿性的化合物能夠得到理想的峰形。
參考文獻(xiàn)
1，江蘇新醫(yī)學(xué)院. 中藥大辭典. 上海：上�？萍汲霭嫔�, 1986. 1448
, http://www.www.srpcoatings.com
2，Vlietinck AJ, De Bruyne, Apers S, et al. Plant-derived leading compounds for chemotherapy of human immunodeficiency virus (HIV) infection. Planta Med, 1998, 64(2)：97
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4，Vander Werf QM, Saxton RE, Chang A, et al. Hypericin：a new laser phototargeting agent for human cancer cells. Laryngoscope, 1996, 106(4)：479
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, 百拇醫(yī)藥
6，沙明，曹愛民，楊松松. 高效液相色譜法測定朝鮮淫羊藿中金絲桃苷的含量. 中國中藥雜志， 1995, 20(6)：357
7，Micali G, Lanuzza F, Gurro P. High-performance liquid chromatographic determination of the biologically active principle hypericin in phytotherapeutic vegetable extracts and alcoholic beverages. J Chromatogr A, 1996, 731(1-2):336
8，Liebes L, Mazur R, Freeman D, et al. A method for the quantitation of Hypericin, an antiviral agent, in biological fluids by high-performance liquid chromatography. Anal Biochem, 1991, 195(1)：77
9，國家醫(yī)藥管理局中草藥情報(bào)中心站. 植物藥有效成分手冊. 北京：人民衛(wèi)生出版社，1986. 596
(本文于1998年12月29日收到), 百拇醫(yī)藥