天麻苷與鉤藤生物堿在實驗動物體內(nèi)的代謝分析
作者：王英鋒 魏璐雪
單位：王英鋒(首都師范大學(xué)化學(xué)系 北京 100037)；魏璐雪(北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院 北京 100029)
關(guān)鍵詞：
藥物分析雜志000225 中藥藥對作為復(fù)方中一種相對固定的組方單位，是前人對2藥配對應(yīng)用后產(chǎn)生某些特殊功效的精辟總結(jié)，自有其內(nèi)在規(guī)律。天麻、鉤藤作為平肝熄風(fēng)中藥，常配伍使用。本課題通過對2藥活性成分在生物體內(nèi)的代謝研究，旨在用現(xiàn)代方法研究其配伍機理，為中醫(yī)理論的論證及臨床實踐提供新的方法學(xué)和依據(jù)。
鉤藤為常用中藥，其主要活性成分為鉤藤生物堿，其中，鉤藤堿(Rhynchophyline)、異鉤藤堿(Isorhynchophyline)含量較高[1]。由于鉤藤在治療高血壓、改善血液循環(huán)及腦功能方面呈現(xiàn)良好效果，因此受到國內(nèi)外醫(yī)藥工作者的重視，已對其資源、提取工藝、含量等進行了研究，但對其體內(nèi)藥物研究尚鮮有報道。本作者對鉤藤生物堿在大、小鼠體內(nèi)的代謝情況已進行了考察，建立了鉤藤生物堿生物體內(nèi)樣品分析方法[2]，本文是在上述工作基礎(chǔ)上進一步考察了大鼠服用鉤藤生物堿與天麻苷合用劑后鉤藤生物堿的代謝情況。天麻苷為天麻中的活性成分，其藥物動力學(xué)已有報道[3]，本作者在文獻報道基礎(chǔ)上，用HPLC方法對與鉤藤生物堿配伍后的天麻苷的體內(nèi)代謝藥-時關(guān)系進行了初步研究。
, 百拇醫(yī)藥
1 儀器與材料
儀器：島津LC-7A高效液相色譜儀，色譜柱：Phenomenex C18 5 μm(4.0 mm×250 mm)。
動物：昆明小鼠30只，Wistar大鼠10只。
對照物：鉤藤堿、異鉤藤堿，自制，純度為99.7%；天麻苷、卡馬西平，含量測定用，購自中國藥品生物制品檢定所；間苯三酚、天麻苷元(對羥基苯甲醇)，北京化學(xué)試劑公司，純度均在99.99%以上；鉤藤總堿，自制；抗凝劑：肝素；甲醇、乙醚、三乙胺均為國產(chǎn)分析純。
2 色譜條件
測定鉤藤生物堿流動相：甲醇-水(55∶45)(含0.01 mol。L-1三乙胺，冰醋酸調(diào)pH=7.5)，流速：1.0 mL。min-1，檢測波長：254 nm，進樣量：20 μL。
, 百拇醫(yī)藥
測定天麻苷流動相：水(0.001 mol。L-1NaH2PO4-0.001 mol。L-1Na2HPO4，pH=7.5)，測定天麻苷元流動相：甲醇-水(0.000 5 mol。L-1H3PO4-0.000 5 mol。L-1NaH2PO4)(96∶4)，流速：1.8 mL。min-1，檢測波長：221 nm，進樣量：20 μL。
3 標(biāo)準(zhǔn)曲線制作
3.1 鉤藤堿、異鉤藤堿標(biāo)準(zhǔn)曲線制作
精密稱取鉤藤堿1.10 mg、異鉤藤堿1.05 mg，用1%鹽酸定容于10 mL容量瓶中，得標(biāo)準(zhǔn)儲備液，濃度分別為鉤藤堿0.110 mg。mL-1、異鉤藤堿0.105 mg。mL-1。
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精密稱取卡馬西平5.50 mg，用甲醇定容于5 mL容量瓶中，得內(nèi)標(biāo)儲備液。
精取鉤藤堿、異鉤藤堿標(biāo)準(zhǔn)儲備液1，2，4，8，16 μL，分別加入大鼠空白血漿0.50 mL中，再各準(zhǔn)確加入內(nèi)標(biāo)儲備液10 μL，混勻，氨水調(diào)pH=11，加入乙醚2.0 mL萃取，乙醚萃取液揮干，用甲醇定容至0.20 mL，得標(biāo)準(zhǔn)溶液。取標(biāo)準(zhǔn)溶液20 μL進行HPLC分析，以組分與內(nèi)標(biāo)的色譜信號比對組分濃度做標(biāo)準(zhǔn)曲線，求得鉤藤堿和異鉤藤堿回歸方程分別為：
Y=0.087X-0.020 r=0.999 1
Y=0.092X-0.005 r=0.999 4
鉤藤堿、異鉤藤堿分別在0.550～8.80 μg。mL-1及0.525～8.40 μg。mL-1范圍內(nèi)線性良好。
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3.2 天麻苷標(biāo)準(zhǔn)曲線制作 精稱天麻苷5.0 mg，用濃度為11.3 μg。mL-1的間苯三酚甲醇液(內(nèi)標(biāo))定容于5.0 mL容量瓶中，精取該溶液20，40，60，80，160 μL，用內(nèi)標(biāo)液定容至2.0 mL，得標(biāo)準(zhǔn)系列溶液，取上述溶液各0.50 mL，分別加入至0.50 mL大鼠空白血漿中，沉淀，離心，取上清液過微孔濾膜，取過濾液20 μL進行HPLC分析，以天麻苷與間苯三酚的色譜信號比對天麻苷濃度作標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程為：
Y=0.020 3X-0.002 3 r=0.999 8
天麻苷在10.9～87.0 μg。mL-1范圍內(nèi)線性良好。
3.3 天麻苷元標(biāo)準(zhǔn)曲線制作 精稱對羥基苯甲醇2.0 mg，用甲醇定容于10 mL容量瓶中，取該溶液5，10，20，40，80 μL分別加入0.50 mL大鼠空白血漿中，1%鹽酸調(diào)pH=3，再各加入濃度為1.13 mg。mL-1間苯三酚甲醇液10 μL，混勻，用乙醚2 mL萃取，乙醚萃取液揮干，甲醇定容至0.20 mL，取上述標(biāo)準(zhǔn)溶液20 μL進行HPLC分析，以天麻苷元與內(nèi)標(biāo)的色譜信號比對苷元濃度作標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程為：
, 百拇醫(yī)藥
Y=0.011X+0.009 r=0.999 7
天麻苷元濃度在5.00～80.0 μg。mL-1范圍內(nèi)線性良好。
4 灌胃大鼠服用天麻苷與鉤藤總堿合劑后，其體內(nèi)藥-時關(guān)系初探
4.1 灌胃液配制 稱取鉤藤總堿1 g，用1%鹽酸溶解，加水稀釋至50 mL，取上述鉤藤總堿鹽酸鹽溶液20 mL，加入天麻苷2.0 g。
4.2 樣品測定 雄性大鼠(約400 g)3只，灌胃劑量：天麻苷500 mg。kg-1，鉤藤總堿100 mg。kg-1，烏拉坦麻醉。分別于灌胃后40，60，80，110，130 min下腔靜脈取血，加肝素抗凝，離心取血漿。取血漿0.50 mL，加1%鹽酸調(diào)pH=3，再加入內(nèi)標(biāo)液10 μL，乙醚2 mL萃取，揮干乙醚，加入甲醇0.20 mL溶解，HPLC測定天麻苷元，結(jié)果見表1及圖1；取血漿0.50 mL，加氨水調(diào)pH=11，加卡馬西平內(nèi)標(biāo)儲備液10 μL，混勻，乙醚2.0 mL萃取，萃取液揮干，準(zhǔn)確加入甲醇0.20 mL溶解，HPLC測定鉤藤堿、異鉤藤堿，結(jié)果見表2，色譜圖見文獻[2]，取血漿0.50 mL，加入內(nèi)標(biāo)液0.50 mL，沉淀，離心，取上清液過微孔濾膜，以續(xù)濾液測定天麻苷見表3及圖2。
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表1 大鼠體內(nèi)天麻苷及其苷元血藥濃度-時間關(guān)系 時間/min
濃度/μg。mL-1
天麻苷
苷元
40
16.5
0
60
1.4
0
80
3.62
, http://www.www.srpcoatings.com
0.274
110
0
5.09
130
0
9.0
圖1 天麻苷元血樣品HPLC圖
1.內(nèi)標(biāo) 2.天麻苷元
可見，天麻苷在大鼠體內(nèi)有一部分代謝為苷元，天麻苷進入大鼠體內(nèi)后迅速代謝，約1.5 h后代謝已盡。
, http://www.www.srpcoatings.com 表2 大鼠體內(nèi)鉤藤生物堿血藥濃度-時間關(guān)系 時間/min
濃度/μg。mL-1
異鉤藤堿
鉤藤堿
40
3.24
1.16
60
4.11
1.53
80
4.34
, 百拇醫(yī)藥
2.25
110
5.09
2.76
130
5.35
2.6
圖2 天麻苷血樣品HPLC圖
1.內(nèi)標(biāo) 2.天麻苷
由上述測定結(jié)果可以看出，大鼠口服鉤藤生物堿后約2 h，體內(nèi)血藥濃度接近高峰。
5 結(jié)果與討論
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5.1 方法精密度測定 取各標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別測定5次，以色譜信號求方法精密度結(jié)果見表3。
5.2 方法重現(xiàn)性測定 取4份血漿樣品，分別按樣品操作步驟進行前處理及測定，計算各物質(zhì)結(jié)果重現(xiàn)性，見表3。
5.3 加標(biāo)回收率測定 取3份血漿樣品，分別加入不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)樣品，分別按樣品操作步驟進行前處理及測定，測定加標(biāo)后各物質(zhì)濃度，計算加標(biāo)回收率，結(jié)果見表3。
5.4 最低檢出限測定 按2倍噪聲原則，測定各物質(zhì)方法最低檢出限，結(jié)果見表3。
表3 精密度、重現(xiàn)性、加標(biāo)回收率、最低檢出限 測定對象
異鉤藤堿
鉤藤堿
天麻苷
, 百拇醫(yī)藥
天麻苷元
精密度RSD/%
4.45
4.32
3.67
5.16
重現(xiàn)性RSD/%
3.32
5.54
3.59
4.40
加標(biāo)回收率/%
106～108
, 百拇醫(yī)藥
95.5～109.5
87～90
86～92
最低檢出限/
μg。mL-1
0.14
0.33
1.05
0.58
5.5 結(jié)論與討論 由以上實驗數(shù)據(jù)可以看出，大鼠口服鉤藤總堿及天麻苷后，鉤藤生物堿代謝較慢，約2 h后，體內(nèi)濃度達到高峰；而天麻苷代謝較快，約1.5 h后，原形藥在血液中幾乎已完全消失；天麻苷代謝產(chǎn)物苷元在血液中含量隨時間延長而升高。以上結(jié)果表明，2藥在體內(nèi)代謝時間上互補，2藥合用可以保持體內(nèi)藥物的有效濃度，促進治療效果，這在一定程度上反映了天麻鉤藤作為常用藥對用于中藥復(fù)方中的用藥機理。2藥在體內(nèi)的代謝時間與文獻報道的單位用藥的代謝情況相一致，也說明2藥代謝在時間上互不影響。
參考文獻
1，天津藥品檢驗藥物研究所.鉤藤降壓有效成分的提取及藥理研究.中草藥通報，1974，4：8
2，王英鋒，魏璐雪，王保中.鉤藤生物堿實驗動物體內(nèi)藥物分析.藥物分析雜志，1999，19(1)：56
3，陸光偉，鄒元杰，莫啟忠等.不同給藥時辰對[3H]天麻素大鼠體內(nèi)過程的影響.中國藥理學(xué)報，1986，7(2)：190
(本文于1999年9月7日收到), 百拇醫(yī)藥
單位：王英鋒(首都師范大學(xué)化學(xué)系 北京 100037)；魏璐雪(北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院 北京 100029)
關(guān)鍵詞：
藥物分析雜志000225 中藥藥對作為復(fù)方中一種相對固定的組方單位，是前人對2藥配對應(yīng)用后產(chǎn)生某些特殊功效的精辟總結(jié)，自有其內(nèi)在規(guī)律。天麻、鉤藤作為平肝熄風(fēng)中藥，常配伍使用。本課題通過對2藥活性成分在生物體內(nèi)的代謝研究，旨在用現(xiàn)代方法研究其配伍機理，為中醫(yī)理論的論證及臨床實踐提供新的方法學(xué)和依據(jù)。
鉤藤為常用中藥，其主要活性成分為鉤藤生物堿，其中，鉤藤堿(Rhynchophyline)、異鉤藤堿(Isorhynchophyline)含量較高[1]。由于鉤藤在治療高血壓、改善血液循環(huán)及腦功能方面呈現(xiàn)良好效果，因此受到國內(nèi)外醫(yī)藥工作者的重視，已對其資源、提取工藝、含量等進行了研究，但對其體內(nèi)藥物研究尚鮮有報道。本作者對鉤藤生物堿在大、小鼠體內(nèi)的代謝情況已進行了考察，建立了鉤藤生物堿生物體內(nèi)樣品分析方法[2]，本文是在上述工作基礎(chǔ)上進一步考察了大鼠服用鉤藤生物堿與天麻苷合用劑后鉤藤生物堿的代謝情況。天麻苷為天麻中的活性成分，其藥物動力學(xué)已有報道[3]，本作者在文獻報道基礎(chǔ)上，用HPLC方法對與鉤藤生物堿配伍后的天麻苷的體內(nèi)代謝藥-時關(guān)系進行了初步研究。
, 百拇醫(yī)藥
1 儀器與材料
儀器：島津LC-7A高效液相色譜儀，色譜柱：Phenomenex C18 5 μm(4.0 mm×250 mm)。
動物：昆明小鼠30只，Wistar大鼠10只。
對照物：鉤藤堿、異鉤藤堿，自制，純度為99.7%；天麻苷、卡馬西平，含量測定用，購自中國藥品生物制品檢定所；間苯三酚、天麻苷元(對羥基苯甲醇)，北京化學(xué)試劑公司，純度均在99.99%以上；鉤藤總堿，自制；抗凝劑：肝素；甲醇、乙醚、三乙胺均為國產(chǎn)分析純。
2 色譜條件
測定鉤藤生物堿流動相：甲醇-水(55∶45)(含0.01 mol。L-1三乙胺，冰醋酸調(diào)pH=7.5)，流速：1.0 mL。min-1，檢測波長：254 nm，進樣量：20 μL。
, 百拇醫(yī)藥
測定天麻苷流動相：水(0.001 mol。L-1NaH2PO4-0.001 mol。L-1Na2HPO4，pH=7.5)，測定天麻苷元流動相：甲醇-水(0.000 5 mol。L-1H3PO4-0.000 5 mol。L-1NaH2PO4)(96∶4)，流速：1.8 mL。min-1，檢測波長：221 nm，進樣量：20 μL。
3 標(biāo)準(zhǔn)曲線制作
3.1 鉤藤堿、異鉤藤堿標(biāo)準(zhǔn)曲線制作
精密稱取鉤藤堿1.10 mg、異鉤藤堿1.05 mg，用1%鹽酸定容于10 mL容量瓶中，得標(biāo)準(zhǔn)儲備液，濃度分別為鉤藤堿0.110 mg。mL-1、異鉤藤堿0.105 mg。mL-1。
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精密稱取卡馬西平5.50 mg，用甲醇定容于5 mL容量瓶中，得內(nèi)標(biāo)儲備液。
精取鉤藤堿、異鉤藤堿標(biāo)準(zhǔn)儲備液1，2，4，8，16 μL，分別加入大鼠空白血漿0.50 mL中，再各準(zhǔn)確加入內(nèi)標(biāo)儲備液10 μL，混勻，氨水調(diào)pH=11，加入乙醚2.0 mL萃取，乙醚萃取液揮干，用甲醇定容至0.20 mL，得標(biāo)準(zhǔn)溶液。取標(biāo)準(zhǔn)溶液20 μL進行HPLC分析，以組分與內(nèi)標(biāo)的色譜信號比對組分濃度做標(biāo)準(zhǔn)曲線，求得鉤藤堿和異鉤藤堿回歸方程分別為：
Y=0.087X-0.020 r=0.999 1
Y=0.092X-0.005 r=0.999 4
鉤藤堿、異鉤藤堿分別在0.550～8.80 μg。mL-1及0.525～8.40 μg。mL-1范圍內(nèi)線性良好。
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3.2 天麻苷標(biāo)準(zhǔn)曲線制作 精稱天麻苷5.0 mg，用濃度為11.3 μg。mL-1的間苯三酚甲醇液(內(nèi)標(biāo))定容于5.0 mL容量瓶中，精取該溶液20，40，60，80，160 μL，用內(nèi)標(biāo)液定容至2.0 mL，得標(biāo)準(zhǔn)系列溶液，取上述溶液各0.50 mL，分別加入至0.50 mL大鼠空白血漿中，沉淀，離心，取上清液過微孔濾膜，取過濾液20 μL進行HPLC分析，以天麻苷與間苯三酚的色譜信號比對天麻苷濃度作標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程為：
Y=0.020 3X-0.002 3 r=0.999 8
天麻苷在10.9～87.0 μg。mL-1范圍內(nèi)線性良好。
3.3 天麻苷元標(biāo)準(zhǔn)曲線制作 精稱對羥基苯甲醇2.0 mg，用甲醇定容于10 mL容量瓶中，取該溶液5，10，20，40，80 μL分別加入0.50 mL大鼠空白血漿中，1%鹽酸調(diào)pH=3，再各加入濃度為1.13 mg。mL-1間苯三酚甲醇液10 μL，混勻，用乙醚2 mL萃取，乙醚萃取液揮干，甲醇定容至0.20 mL，取上述標(biāo)準(zhǔn)溶液20 μL進行HPLC分析，以天麻苷元與內(nèi)標(biāo)的色譜信號比對苷元濃度作標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程為：
, 百拇醫(yī)藥
Y=0.011X+0.009 r=0.999 7
天麻苷元濃度在5.00～80.0 μg。mL-1范圍內(nèi)線性良好。
4 灌胃大鼠服用天麻苷與鉤藤總堿合劑后，其體內(nèi)藥-時關(guān)系初探
4.1 灌胃液配制 稱取鉤藤總堿1 g，用1%鹽酸溶解，加水稀釋至50 mL，取上述鉤藤總堿鹽酸鹽溶液20 mL，加入天麻苷2.0 g。
4.2 樣品測定 雄性大鼠(約400 g)3只，灌胃劑量：天麻苷500 mg。kg-1，鉤藤總堿100 mg。kg-1，烏拉坦麻醉。分別于灌胃后40，60，80，110，130 min下腔靜脈取血，加肝素抗凝，離心取血漿。取血漿0.50 mL，加1%鹽酸調(diào)pH=3，再加入內(nèi)標(biāo)液10 μL，乙醚2 mL萃取，揮干乙醚，加入甲醇0.20 mL溶解，HPLC測定天麻苷元，結(jié)果見表1及圖1；取血漿0.50 mL，加氨水調(diào)pH=11，加卡馬西平內(nèi)標(biāo)儲備液10 μL，混勻，乙醚2.0 mL萃取，萃取液揮干，準(zhǔn)確加入甲醇0.20 mL溶解，HPLC測定鉤藤堿、異鉤藤堿，結(jié)果見表2，色譜圖見文獻[2]，取血漿0.50 mL，加入內(nèi)標(biāo)液0.50 mL，沉淀，離心，取上清液過微孔濾膜，以續(xù)濾液測定天麻苷見表3及圖2。
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表1 大鼠體內(nèi)天麻苷及其苷元血藥濃度-時間關(guān)系 時間/min
濃度/μg。mL-1
天麻苷
苷元
40
16.5
0
60
1.4
0
80
3.62
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0.274
110
0
5.09
130
0
9.0
圖1 天麻苷元血樣品HPLC圖
1.內(nèi)標(biāo) 2.天麻苷元
可見，天麻苷在大鼠體內(nèi)有一部分代謝為苷元，天麻苷進入大鼠體內(nèi)后迅速代謝，約1.5 h后代謝已盡。
, http://www.www.srpcoatings.com 表2 大鼠體內(nèi)鉤藤生物堿血藥濃度-時間關(guān)系 時間/min
濃度/μg。mL-1
異鉤藤堿
鉤藤堿
40
3.24
1.16
60
4.11
1.53
80
4.34
, 百拇醫(yī)藥
2.25
110
5.09
2.76
130
5.35
2.6
圖2 天麻苷血樣品HPLC圖
1.內(nèi)標(biāo) 2.天麻苷
由上述測定結(jié)果可以看出，大鼠口服鉤藤生物堿后約2 h，體內(nèi)血藥濃度接近高峰。
5 結(jié)果與討論
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5.1 方法精密度測定 取各標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別測定5次，以色譜信號求方法精密度結(jié)果見表3。
5.2 方法重現(xiàn)性測定 取4份血漿樣品，分別按樣品操作步驟進行前處理及測定，計算各物質(zhì)結(jié)果重現(xiàn)性，見表3。
5.3 加標(biāo)回收率測定 取3份血漿樣品，分別加入不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)樣品，分別按樣品操作步驟進行前處理及測定，測定加標(biāo)后各物質(zhì)濃度，計算加標(biāo)回收率，結(jié)果見表3。
5.4 最低檢出限測定 按2倍噪聲原則，測定各物質(zhì)方法最低檢出限，結(jié)果見表3。
表3 精密度、重現(xiàn)性、加標(biāo)回收率、最低檢出限 測定對象
異鉤藤堿
鉤藤堿
天麻苷
, 百拇醫(yī)藥
天麻苷元
精密度RSD/%
4.45
4.32
3.67
5.16
重現(xiàn)性RSD/%
3.32
5.54
3.59
4.40
加標(biāo)回收率/%
106～108
, 百拇醫(yī)藥
95.5～109.5
87～90
86～92
最低檢出限/
μg。mL-1
0.14
0.33
1.05
0.58
5.5 結(jié)論與討論 由以上實驗數(shù)據(jù)可以看出，大鼠口服鉤藤總堿及天麻苷后，鉤藤生物堿代謝較慢，約2 h后，體內(nèi)濃度達到高峰；而天麻苷代謝較快，約1.5 h后，原形藥在血液中幾乎已完全消失；天麻苷代謝產(chǎn)物苷元在血液中含量隨時間延長而升高。以上結(jié)果表明，2藥在體內(nèi)代謝時間上互補，2藥合用可以保持體內(nèi)藥物的有效濃度，促進治療效果，這在一定程度上反映了天麻鉤藤作為常用藥對用于中藥復(fù)方中的用藥機理。2藥在體內(nèi)的代謝時間與文獻報道的單位用藥的代謝情況相一致，也說明2藥代謝在時間上互不影響。
參考文獻
1，天津藥品檢驗藥物研究所.鉤藤降壓有效成分的提取及藥理研究.中草藥通報，1974，4：8
2，王英鋒，魏璐雪，王保中.鉤藤生物堿實驗動物體內(nèi)藥物分析.藥物分析雜志，1999，19(1)：56
3，陸光偉，鄒元杰，莫啟忠等.不同給藥時辰對[3H]天麻素大鼠體內(nèi)過程的影響.中國藥理學(xué)報，1986，7(2)：190
(本文于1999年9月7日收到), 百拇醫(yī)藥