HPLC-ELSD分析測定貝母類藥材中生物堿成分
作者:朱丹妮 譚豐萍 高山林
單位:朱丹妮 譚豐萍 高山林(中國藥科大學(xué) 南京 210038)
關(guān)鍵詞:貝母;貝母甲素;高效液相-蒸發(fā)光散射
藥物分析雜志000205 摘要 目的:利用高效液相色譜法測定貝母類藥材中生物堿成分。方法:采用Silica 5 μm (4.6 mm×250 mm) 色譜柱,流動相:A.環(huán)己烷-乙酸乙酯-二乙胺(6∶4∶1), B.環(huán)己烷-乙酸乙酯-二乙胺(6∶4∶0.12),流速1.0 mL.min-1,以ELSD-500為檢測器,外標(biāo)法定量。結(jié)果:貝母甲素在 0.75~3.00 μg范圍內(nèi)呈線性,回收率為 97.21% (n=5),RSD為1.58%。結(jié)論:5種不同貝母藥材的HPLC圖譜有明顯差異,本法為良好的測定貝母甲素的方法,可用于貝母藥材的質(zhì)量監(jiān)控。
, http://www.www.srpcoatings.com
Determination of Alkaloids in Fritillaria spp.by HPLC-ELSD Method
Zhu Danni, Tan Fengping and Gao Shanlin
(China Pharmaceutical University, Nanjing 210038)
Abstract Objective:To determine the content of alkaloid compound in Fritillaria by using a new HPLC-ELSD methods.Method:Alltech Silica column (5 μm,4.6 mm× 250 mm) was used, mobile phase A consisted of cyclohexane-acetic ester-ethylamine(6∶4∶1), mobile phase B consisted of cyclohexane-acetic ester-ethylamine(6∶4∶0.12), at 1 mL.min-1 flow rate. ELSD-500 detector was used for qualitative and quantitative analysis by external standard method.Results:Within 0.75~3.00 μg peimine had a good linearity. The average recovery was 97.21%(n=5) with RSD 1.58%.Conclusion:There are significant differences in HPLC trace among five species of Fritillaria, the method is sensitive and reproducible and it could be used for quantitative determination of Fritillaria drug.
, 百拇醫(yī)藥
Key words Fritillaria, peimine, HPLC-ELSD
貝母為百合科(Liliaceae)貝母屬Fritillaria多種植物的鱗莖,在我國有悠久的使用歷史,貝母清熱化痰,潤肺止咳,貝母生物堿為貝母的有效成分,對貝母中生物堿的含量測定有薄層掃描法[1]、反相離子對高效液相色譜法[2]、柱前衍生化HPLC法[3]、氣相色譜法[4];采用HPLC-ELSD法測定貝母中貝母甲素含量,國內(nèi)外未見報(bào)道。本文運(yùn)用HPLC-ELSD法分析幾種商品貝母中生物堿,建立了貝母甲素的含量測定方法;實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,幾種貝母藥材HPLC-ELSD圖譜有明顯差異,平貝母、浙貝母中含貝母甲素、貝母乙素,但平貝母中貝母甲、乙素的含量明顯較浙貝母低,伊貝母、梭砂貝母含西貝素,但2者含量差異較大,暗紫貝母不含貝母甲素、貝母乙素,也不含西貝素,但有其獨(dú)自的特征峰。
1 儀器、試劑與樣品材料
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Shimadzu-10A高效液相色譜儀; Shimadzu C-R6A數(shù)據(jù)處理機(jī),Alltech ELSD-500型蒸發(fā)光散射檢測器。
環(huán)己烷、乙酸乙酯、二乙胺(分析純)經(jīng)重蒸餾處理,其他試劑均為分析純。
貝母甲素、貝母乙素、西貝素對照品購自中國藥品生物制品檢定所。
暗紫貝母(Fritillaria unibracteata Hsiao et K.C.Hsia)購自四川阿壩州紅原縣,浙貝母(Fritillaria thunbergii Miq.)購自江蘇省南京市藥材公司。梭砂貝母(Fritillaria delavayi Franch)、伊貝母(Fritillaria pallidiflora Schrank)、平貝母(Fritillaria ussuriensis Maxim)購自安徽亳州藥材公司,以上貝母藥材均經(jīng)本校生藥教研室鑒定,符合1995年版中國藥典規(guī)定。
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2 色譜分析條件
色譜柱:Alltech Silica 5 μm柱(4.6 mm×250 mm);流動相:A.環(huán)己烷-乙酸乙酯-二乙胺(6∶4∶1),B.環(huán)己烷-乙酸乙酯-二乙胺(6∶4∶0.12),流速:1.0mL.min-1,進(jìn)樣量:20 μL;ELSD參數(shù):漂移管溫度90 ℃,氮?dú)饬魉?.87 L.min-1。
3 樣品提取條件試驗(yàn)
樣品提取條件的優(yōu)選按正交試驗(yàn)進(jìn)行,選擇溶劑種類、溶劑用量、浸提時(shí)間、氨水用量4個(gè)因素為考察內(nèi)容, 每個(gè)因素安排3個(gè)水平,以貝母甲素的量為篩選標(biāo)準(zhǔn),正交試驗(yàn)表頭設(shè)計(jì)如下:
表1 提取條件優(yōu)選因素水平表因子水平表 因素水平
, 百拇醫(yī)藥 溶劑種類
溶劑用量/mL
浸提時(shí)間/h
氨水用量/mL
1
乙醚
30(5 × W)
16
1.2(0.2×W)
2
氯仿
45(7.5×W)
24
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1.8(0.3×W)
3
混合溶劑
60(10×W)
32
2.4(0.4×W)
注:混合溶劑為乙醚-氯仿-95%乙醇(25∶8∶2.5);W:樣品量(g)
根據(jù)表1,選用L9(34)正交表按各試驗(yàn)號進(jìn)行試驗(yàn), 每次取同一批浙貝母藥材,粉碎過40目篩,干燥至恒重,精密稱取約6 g,精密加入氨水適量使?jié)櫇,精密加入溶劑適量,密塞,放置一定時(shí)間(h)后過濾,精密量取續(xù)濾液(1/2溶劑加入量),揮干溶劑,殘?jiān)勇确露ㄈ葜? mL,以0.45 μm的微孔濾膜過濾后備用。以HPLC-ELSD法(用流動相A)測定不同提取條件下樣品中貝母甲素的含量,結(jié)果見表2。
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表2 不同提取條件的正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果 試驗(yàn)號
溶劑
溶劑用量/mL
浸提時(shí)間/h
氨水用量/mL
貝母甲素含量/μg.g-1
1
乙醚
30
16
1.2
73.67
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2
乙醚
45
24
1.8
133.93
3
乙醚
60
32
2.4
207.18
4
, http://www.www.srpcoatings.com 氯仿
30
24
2.4
227.42
5
氯仿
45
32
1.2
108.05
6
氯仿
60
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16
1.8
181.09
7
混合溶劑
30
32
1.8
213.93
8
混合溶劑
45
16
, 百拇醫(yī)藥
2.4
236.09
9
混合溶劑
60
24
1.2
80.83
K1
414.78
515.02
490.84
262.54
, 百拇醫(yī)藥
G=1462.18
K2
516.55
478.07
442.17
528.95
CT=237550.64
K3
530.85
469.10
529.16
670.69
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Q
240221.35
237945.23
2388179.28
2661798.20
S
2670.71
394.91
1267.22
28628.64
由上述正交試驗(yàn)和方差結(jié)果分析可知,9種提取條件所測得的樣品中貝母甲素含量差異很大,最低73.67 μg.g-1,最高236.09 μg.g-1,說明不同提取條件對貝母甲素提取的影響是明顯的。其中以混合溶劑、溶劑用量30 mL、浸提時(shí)間32 h、氨水用量2.4 mL最優(yōu)。加入的氨水量為有顯著意義的因素,其次為溶劑種類、浸提時(shí)間,溶劑用量影響較小。綜合以上分析結(jié)果, 因混合溶劑提取雜質(zhì)較多;氯仿與混合溶劑提取的貝母甲素的含量無明顯差異,且浸提時(shí)間、溶劑用量對提取貝母甲素的影響很小,選用最低水平可以節(jié)省溶劑和時(shí)間。本文設(shè)計(jì)最佳提取方法為加入氨水2.4 mL使?jié)駶?加入氯仿30 mL,密塞,放置16 h后,將溶液過濾,精密量取續(xù)濾液15 mL,揮干溶劑,殘?jiān)勇确露ㄈ葜? mL,以0.45 μm的微孔濾膜過濾,備用。
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4 線性關(guān)系的考察
精密稱取貝母甲素對照品適量,加氯仿制成0.75 mg.mL-1的溶液,作為對照品貯備液。吸取貯備液250 μL至1 mL的容量瓶中,用氯仿稀釋至刻度,搖勻,取上述溶液4,8,10,12,16 μL依次進(jìn)樣,按上述色譜條件測定, 以對照品峰面積的自然對數(shù)值為縱坐標(biāo),以進(jìn)樣量(μg)的自然對數(shù)值為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸,貝母甲素的進(jìn)樣量在0.75~3.00 μg范圍內(nèi)與峰面積值呈線性關(guān)系,回歸方程為:
Y=12.587 9+1.251 6X r=0.999 9
對照品的色譜圖見圖1-A。
圖1 色譜圖(流動相A)
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A.貝母甲素 B.浙貝母
1.貝母甲素(17.74 min)
5 回收率的測定
準(zhǔn)確稱取已測知貝母甲素含量為0.268 mg.g-1的浙貝干粉3 g,加入1 mg.mL-1貝母甲素對照品貯備液1 mL,按“浙貝母藥材測定”項(xiàng)下方法提取,測定計(jì)算回收率,結(jié)果平均回收率為97.21%, RSD為1.58%,n=5。
6 精密度試驗(yàn)
取對照品溶液,重復(fù)進(jìn)樣5次,每次20 μL, 貝母甲素的峰面積積分值的RSD為1.01%。
7 重現(xiàn)性試驗(yàn)
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精密稱取同批浙貝母藥材粉約6 g,共取5份,按“3”項(xiàng)下方法提取,測定,結(jié)果該批浙貝母中貝母甲素的含量為0.027%,RSD為1.63%。實(shí)驗(yàn)表明,本法有較好的重現(xiàn)性。
8 浙貝母藥材的測定
按“3”項(xiàng)下所選方法提取,測定,色譜圖見圖1-B。根據(jù)峰面積和隨行對照品標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中貝母甲素含量。3批浙貝母藥材的分析結(jié)果(n=3)分別為0.027%, 0.026%, 0.028%。
9 5種商品貝母中生物堿成分的HPLC分析
取平貝母、伊貝母、梭砂貝母、暗紫貝母、浙貝母幾種藥材,按“3”項(xiàng)下所選方法提取制成供試品溶液,各溶液以流動相A進(jìn)行分析,結(jié)果見圖2-A;各溶液以流動相B進(jìn)行分析,結(jié)果見圖2-B。
定性結(jié)果分析表明:不同貝母藥材HPLC-ELSD圖譜有明顯的差別,其中只有平貝母、浙貝母含貝母甲、乙素,但平貝母中貝母甲、乙素含量明顯較浙貝母中低;只有伊貝母、梭砂貝母含西貝素,但2者含量差異較大;暗紫貝母不含有貝母甲、乙素和西貝素,圖2-B顯示暗紫貝母有其自身的特征峰;伊貝母、梭砂貝母、暗紫貝母均有一特征峰(出峰時(shí)間11.2 min),但含量差異較大。
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圖2 5種貝母藥材HPLC-ELSD色譜圖
A. 流動相A B.流動相B
1.貝母甲素(17.74 min) 2. 貝母乙素(12.66 min) 3. 西貝素(13.32 min) 4. 未知成分(11.74 min)
10 討論
10.1 正交試驗(yàn)結(jié)果表明:氨水用量顯著影響貝母甲素提取效果,用量為2.4 mL(0.4倍樣品量)最佳;這是因?yàn)樘崛∷幉闹猩飰A時(shí),氨水用量直接影響藥材中生物堿成分的游離,用量不足不利于生物堿成分的游離,用量超過0.4倍樣品量,樣品成團(tuán)也不利于提取。用本文設(shè)計(jì)的提取條件,待測樣品中的生物堿可提取完全。
10.2 目前貝母中單體生物堿含量測定的方法有不少報(bào)道,多采用薄層掃描法,也有用高效液相色譜法者,但或是需要衍生化,或是采用末端吸收檢測,存在前處理步驟多,排除干擾較困難等不足之處,本文采用的HPLC-ELSD法對浙貝母中貝母甲素進(jìn)行含量測定, 分離度好,樣品制備簡便,重現(xiàn)性佳,是一種良好的貝母甲素的測定方法,可用于貝母藥材的質(zhì)量監(jiān)控。
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10.3 5種商品貝母中生物堿成分的HPLC-ELSD圖譜顯示:生物堿成分在平貝母、浙貝母中與伊貝母、梭砂貝母、暗紫貝母中的存在狀態(tài)有一定規(guī)律可尋,前者藥材中不含西貝素,后者藥材中不含貝母甲、乙素。這一結(jié)果與余世春通過對貝母屬植物化學(xué)與系統(tǒng)學(xué)的研究發(fā)現(xiàn)[5~7], 已分離并確定結(jié)構(gòu)的貝母生物堿有100余種,其中的異甾體生物堿占75%,貝母屬植物中較富含的異甾體生物堿中5α-cevanine類是其特征性成分;并認(rèn)為該特征性成分在中國分布區(qū)內(nèi)該屬植物類群中的存在狀態(tài)有一定規(guī)律可尋,在高海拔地區(qū)如四川、甘肅等本屬植物種(川貝母、梭砂貝母、伊貝母等)中未檢出C13、C17雙氫反式構(gòu)型的5α-cevanine異甾類生物堿,只存在西貝素、川貝酮等C13、C17雙氫順式構(gòu)型者;而低海拔地區(qū)如浙江、安徽、湖北等本屬植物種(浙貝母、安徽貝母、鄂北貝母、平貝母等)均存在C13、C17雙氫反式構(gòu)型的5α-cevanine者如貝母甲素、貝母乙素,但未檢出C13、C17雙氫順式構(gòu)型類成分的報(bào)道一致。說明如對HPLC-ELSD定性分析方法加以系統(tǒng)研究和完善,可以成為一種新的貝母類藥材定性鑒別及品質(zhì)評價(jià)的方法。
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10.4 本文測定貝母甲素和貝母乙素,選用了2種不同的流動相,實(shí)驗(yàn)表明二乙胺的比例對貝母甲素和貝母乙素的出峰時(shí)間有很大影響,流動相B中二乙胺的比例較小,貝母乙素的出峰時(shí)間為12.66 min,而貝母甲素的出峰時(shí)間在30 min以后,且峰形變寬;調(diào)整二乙胺的比例,當(dāng)二乙胺的比例增大到1時(shí),貝母甲素的出峰時(shí)間提前到17.74 min,而貝母乙素的出峰時(shí)間大大提前,與貝母中其它成分混在一起,因缺少梯度洗脫的條件,本實(shí)驗(yàn)只能選用2種不同的流動相分別分析貝母甲、乙素。
參考文獻(xiàn)
1,李萍,劉理南,徐國鈞. 12種貝母的西貝素含量測定. 中草藥,1991, 22(5):205
2,晁若冰,胡玲. 高效液相色譜法測定貝母中貝母辛的含量. 藥學(xué)學(xué)報(bào),1993, 28(9):705
3,李文彥,畢開順,喬延江等. 柱前衍生化高效液相色譜法測定伊貝母中西貝素含量.中國藥學(xué)雜志, 1997, 32(6):363
4,覃寧,楊昌全.伊犁素的裂解氣相色譜測定. 藥物分析雜志,1989,9(2):107
5,余世春,肖培根.中國貝母屬植物種質(zhì)資源及其利用. 中藥材,1991,14(1):18
6,余世春,肖培根.中藥貝母的藥用歷史及發(fā)展方向. 中國中藥雜志,1990,15(8):454
7,余世春,肖培根.貝母屬植物異甾體生物堿的存在及其分類學(xué)意義. 植物分類學(xué)報(bào),1992,30(5):450
(本文于1999年7月8日收到), http://www.www.srpcoatings.com
單位:朱丹妮 譚豐萍 高山林(中國藥科大學(xué) 南京 210038)
關(guān)鍵詞:貝母;貝母甲素;高效液相-蒸發(fā)光散射
藥物分析雜志000205 摘要 目的:利用高效液相色譜法測定貝母類藥材中生物堿成分。方法:采用Silica 5 μm (4.6 mm×250 mm) 色譜柱,流動相:A.環(huán)己烷-乙酸乙酯-二乙胺(6∶4∶1), B.環(huán)己烷-乙酸乙酯-二乙胺(6∶4∶0.12),流速1.0 mL.min-1,以ELSD-500為檢測器,外標(biāo)法定量。結(jié)果:貝母甲素在 0.75~3.00 μg范圍內(nèi)呈線性,回收率為 97.21% (n=5),RSD為1.58%。結(jié)論:5種不同貝母藥材的HPLC圖譜有明顯差異,本法為良好的測定貝母甲素的方法,可用于貝母藥材的質(zhì)量監(jiān)控。
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Determination of Alkaloids in Fritillaria spp.by HPLC-ELSD Method
Zhu Danni, Tan Fengping and Gao Shanlin
(China Pharmaceutical University, Nanjing 210038)
Abstract Objective:To determine the content of alkaloid compound in Fritillaria by using a new HPLC-ELSD methods.Method:Alltech Silica column (5 μm,4.6 mm× 250 mm) was used, mobile phase A consisted of cyclohexane-acetic ester-ethylamine(6∶4∶1), mobile phase B consisted of cyclohexane-acetic ester-ethylamine(6∶4∶0.12), at 1 mL.min-1 flow rate. ELSD-500 detector was used for qualitative and quantitative analysis by external standard method.Results:Within 0.75~3.00 μg peimine had a good linearity. The average recovery was 97.21%(n=5) with RSD 1.58%.Conclusion:There are significant differences in HPLC trace among five species of Fritillaria, the method is sensitive and reproducible and it could be used for quantitative determination of Fritillaria drug.
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Key words Fritillaria, peimine, HPLC-ELSD
貝母為百合科(Liliaceae)貝母屬Fritillaria多種植物的鱗莖,在我國有悠久的使用歷史,貝母清熱化痰,潤肺止咳,貝母生物堿為貝母的有效成分,對貝母中生物堿的含量測定有薄層掃描法[1]、反相離子對高效液相色譜法[2]、柱前衍生化HPLC法[3]、氣相色譜法[4];采用HPLC-ELSD法測定貝母中貝母甲素含量,國內(nèi)外未見報(bào)道。本文運(yùn)用HPLC-ELSD法分析幾種商品貝母中生物堿,建立了貝母甲素的含量測定方法;實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,幾種貝母藥材HPLC-ELSD圖譜有明顯差異,平貝母、浙貝母中含貝母甲素、貝母乙素,但平貝母中貝母甲、乙素的含量明顯較浙貝母低,伊貝母、梭砂貝母含西貝素,但2者含量差異較大,暗紫貝母不含貝母甲素、貝母乙素,也不含西貝素,但有其獨(dú)自的特征峰。
1 儀器、試劑與樣品材料
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Shimadzu-10A高效液相色譜儀; Shimadzu C-R6A數(shù)據(jù)處理機(jī),Alltech ELSD-500型蒸發(fā)光散射檢測器。
環(huán)己烷、乙酸乙酯、二乙胺(分析純)經(jīng)重蒸餾處理,其他試劑均為分析純。
貝母甲素、貝母乙素、西貝素對照品購自中國藥品生物制品檢定所。
暗紫貝母(Fritillaria unibracteata Hsiao et K.C.Hsia)購自四川阿壩州紅原縣,浙貝母(Fritillaria thunbergii Miq.)購自江蘇省南京市藥材公司。梭砂貝母(Fritillaria delavayi Franch)、伊貝母(Fritillaria pallidiflora Schrank)、平貝母(Fritillaria ussuriensis Maxim)購自安徽亳州藥材公司,以上貝母藥材均經(jīng)本校生藥教研室鑒定,符合1995年版中國藥典規(guī)定。
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2 色譜分析條件
色譜柱:Alltech Silica 5 μm柱(4.6 mm×250 mm);流動相:A.環(huán)己烷-乙酸乙酯-二乙胺(6∶4∶1),B.環(huán)己烷-乙酸乙酯-二乙胺(6∶4∶0.12),流速:1.0mL.min-1,進(jìn)樣量:20 μL;ELSD參數(shù):漂移管溫度90 ℃,氮?dú)饬魉?.87 L.min-1。
3 樣品提取條件試驗(yàn)
樣品提取條件的優(yōu)選按正交試驗(yàn)進(jìn)行,選擇溶劑種類、溶劑用量、浸提時(shí)間、氨水用量4個(gè)因素為考察內(nèi)容, 每個(gè)因素安排3個(gè)水平,以貝母甲素的量為篩選標(biāo)準(zhǔn),正交試驗(yàn)表頭設(shè)計(jì)如下:
表1 提取條件優(yōu)選因素水平表因子水平表 因素水平
, 百拇醫(yī)藥 溶劑種類
溶劑用量/mL
浸提時(shí)間/h
氨水用量/mL
1
乙醚
30(5 × W)
16
1.2(0.2×W)
2
氯仿
45(7.5×W)
24
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1.8(0.3×W)
3
混合溶劑
60(10×W)
32
2.4(0.4×W)
注:混合溶劑為乙醚-氯仿-95%乙醇(25∶8∶2.5);W:樣品量(g)
根據(jù)表1,選用L9(34)正交表按各試驗(yàn)號進(jìn)行試驗(yàn), 每次取同一批浙貝母藥材,粉碎過40目篩,干燥至恒重,精密稱取約6 g,精密加入氨水適量使?jié)櫇,精密加入溶劑適量,密塞,放置一定時(shí)間(h)后過濾,精密量取續(xù)濾液(1/2溶劑加入量),揮干溶劑,殘?jiān)勇确露ㄈ葜? mL,以0.45 μm的微孔濾膜過濾后備用。以HPLC-ELSD法(用流動相A)測定不同提取條件下樣品中貝母甲素的含量,結(jié)果見表2。
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表2 不同提取條件的正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果 試驗(yàn)號
溶劑
溶劑用量/mL
浸提時(shí)間/h
氨水用量/mL
貝母甲素含量/μg.g-1
1
乙醚
30
16
1.2
73.67
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2
乙醚
45
24
1.8
133.93
3
乙醚
60
32
2.4
207.18
4
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30
24
2.4
227.42
5
氯仿
45
32
1.2
108.05
6
氯仿
60
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16
1.8
181.09
7
混合溶劑
30
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1.8
213.93
8
混合溶劑
45
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2.4
236.09
9
混合溶劑
60
24
1.2
80.83
K1
414.78
515.02
490.84
262.54
, 百拇醫(yī)藥
G=1462.18
K2
516.55
478.07
442.17
528.95
CT=237550.64
K3
530.85
469.10
529.16
670.69
, http://www.www.srpcoatings.com
Q
240221.35
237945.23
2388179.28
2661798.20
S
2670.71
394.91
1267.22
28628.64
由上述正交試驗(yàn)和方差結(jié)果分析可知,9種提取條件所測得的樣品中貝母甲素含量差異很大,最低73.67 μg.g-1,最高236.09 μg.g-1,說明不同提取條件對貝母甲素提取的影響是明顯的。其中以混合溶劑、溶劑用量30 mL、浸提時(shí)間32 h、氨水用量2.4 mL最優(yōu)。加入的氨水量為有顯著意義的因素,其次為溶劑種類、浸提時(shí)間,溶劑用量影響較小。綜合以上分析結(jié)果, 因混合溶劑提取雜質(zhì)較多;氯仿與混合溶劑提取的貝母甲素的含量無明顯差異,且浸提時(shí)間、溶劑用量對提取貝母甲素的影響很小,選用最低水平可以節(jié)省溶劑和時(shí)間。本文設(shè)計(jì)最佳提取方法為加入氨水2.4 mL使?jié)駶?加入氯仿30 mL,密塞,放置16 h后,將溶液過濾,精密量取續(xù)濾液15 mL,揮干溶劑,殘?jiān)勇确露ㄈ葜? mL,以0.45 μm的微孔濾膜過濾,備用。
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4 線性關(guān)系的考察
精密稱取貝母甲素對照品適量,加氯仿制成0.75 mg.mL-1的溶液,作為對照品貯備液。吸取貯備液250 μL至1 mL的容量瓶中,用氯仿稀釋至刻度,搖勻,取上述溶液4,8,10,12,16 μL依次進(jìn)樣,按上述色譜條件測定, 以對照品峰面積的自然對數(shù)值為縱坐標(biāo),以進(jìn)樣量(μg)的自然對數(shù)值為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸,貝母甲素的進(jìn)樣量在0.75~3.00 μg范圍內(nèi)與峰面積值呈線性關(guān)系,回歸方程為:
Y=12.587 9+1.251 6X r=0.999 9
對照品的色譜圖見圖1-A。
圖1 色譜圖(流動相A)
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A.貝母甲素 B.浙貝母
1.貝母甲素(17.74 min)
5 回收率的測定
準(zhǔn)確稱取已測知貝母甲素含量為0.268 mg.g-1的浙貝干粉3 g,加入1 mg.mL-1貝母甲素對照品貯備液1 mL,按“浙貝母藥材測定”項(xiàng)下方法提取,測定計(jì)算回收率,結(jié)果平均回收率為97.21%, RSD為1.58%,n=5。
6 精密度試驗(yàn)
取對照品溶液,重復(fù)進(jìn)樣5次,每次20 μL, 貝母甲素的峰面積積分值的RSD為1.01%。
7 重現(xiàn)性試驗(yàn)
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精密稱取同批浙貝母藥材粉約6 g,共取5份,按“3”項(xiàng)下方法提取,測定,結(jié)果該批浙貝母中貝母甲素的含量為0.027%,RSD為1.63%。實(shí)驗(yàn)表明,本法有較好的重現(xiàn)性。
8 浙貝母藥材的測定
按“3”項(xiàng)下所選方法提取,測定,色譜圖見圖1-B。根據(jù)峰面積和隨行對照品標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中貝母甲素含量。3批浙貝母藥材的分析結(jié)果(n=3)分別為0.027%, 0.026%, 0.028%。
9 5種商品貝母中生物堿成分的HPLC分析
取平貝母、伊貝母、梭砂貝母、暗紫貝母、浙貝母幾種藥材,按“3”項(xiàng)下所選方法提取制成供試品溶液,各溶液以流動相A進(jìn)行分析,結(jié)果見圖2-A;各溶液以流動相B進(jìn)行分析,結(jié)果見圖2-B。
定性結(jié)果分析表明:不同貝母藥材HPLC-ELSD圖譜有明顯的差別,其中只有平貝母、浙貝母含貝母甲、乙素,但平貝母中貝母甲、乙素含量明顯較浙貝母中低;只有伊貝母、梭砂貝母含西貝素,但2者含量差異較大;暗紫貝母不含有貝母甲、乙素和西貝素,圖2-B顯示暗紫貝母有其自身的特征峰;伊貝母、梭砂貝母、暗紫貝母均有一特征峰(出峰時(shí)間11.2 min),但含量差異較大。
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圖2 5種貝母藥材HPLC-ELSD色譜圖
A. 流動相A B.流動相B
1.貝母甲素(17.74 min) 2. 貝母乙素(12.66 min) 3. 西貝素(13.32 min) 4. 未知成分(11.74 min)
10 討論
10.1 正交試驗(yàn)結(jié)果表明:氨水用量顯著影響貝母甲素提取效果,用量為2.4 mL(0.4倍樣品量)最佳;這是因?yàn)樘崛∷幉闹猩飰A時(shí),氨水用量直接影響藥材中生物堿成分的游離,用量不足不利于生物堿成分的游離,用量超過0.4倍樣品量,樣品成團(tuán)也不利于提取。用本文設(shè)計(jì)的提取條件,待測樣品中的生物堿可提取完全。
10.2 目前貝母中單體生物堿含量測定的方法有不少報(bào)道,多采用薄層掃描法,也有用高效液相色譜法者,但或是需要衍生化,或是采用末端吸收檢測,存在前處理步驟多,排除干擾較困難等不足之處,本文采用的HPLC-ELSD法對浙貝母中貝母甲素進(jìn)行含量測定, 分離度好,樣品制備簡便,重現(xiàn)性佳,是一種良好的貝母甲素的測定方法,可用于貝母藥材的質(zhì)量監(jiān)控。
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10.3 5種商品貝母中生物堿成分的HPLC-ELSD圖譜顯示:生物堿成分在平貝母、浙貝母中與伊貝母、梭砂貝母、暗紫貝母中的存在狀態(tài)有一定規(guī)律可尋,前者藥材中不含西貝素,后者藥材中不含貝母甲、乙素。這一結(jié)果與余世春通過對貝母屬植物化學(xué)與系統(tǒng)學(xué)的研究發(fā)現(xiàn)[5~7], 已分離并確定結(jié)構(gòu)的貝母生物堿有100余種,其中的異甾體生物堿占75%,貝母屬植物中較富含的異甾體生物堿中5α-cevanine類是其特征性成分;并認(rèn)為該特征性成分在中國分布區(qū)內(nèi)該屬植物類群中的存在狀態(tài)有一定規(guī)律可尋,在高海拔地區(qū)如四川、甘肅等本屬植物種(川貝母、梭砂貝母、伊貝母等)中未檢出C13、C17雙氫反式構(gòu)型的5α-cevanine異甾類生物堿,只存在西貝素、川貝酮等C13、C17雙氫順式構(gòu)型者;而低海拔地區(qū)如浙江、安徽、湖北等本屬植物種(浙貝母、安徽貝母、鄂北貝母、平貝母等)均存在C13、C17雙氫反式構(gòu)型的5α-cevanine者如貝母甲素、貝母乙素,但未檢出C13、C17雙氫順式構(gòu)型類成分的報(bào)道一致。說明如對HPLC-ELSD定性分析方法加以系統(tǒng)研究和完善,可以成為一種新的貝母類藥材定性鑒別及品質(zhì)評價(jià)的方法。
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10.4 本文測定貝母甲素和貝母乙素,選用了2種不同的流動相,實(shí)驗(yàn)表明二乙胺的比例對貝母甲素和貝母乙素的出峰時(shí)間有很大影響,流動相B中二乙胺的比例較小,貝母乙素的出峰時(shí)間為12.66 min,而貝母甲素的出峰時(shí)間在30 min以后,且峰形變寬;調(diào)整二乙胺的比例,當(dāng)二乙胺的比例增大到1時(shí),貝母甲素的出峰時(shí)間提前到17.74 min,而貝母乙素的出峰時(shí)間大大提前,與貝母中其它成分混在一起,因缺少梯度洗脫的條件,本實(shí)驗(yàn)只能選用2種不同的流動相分別分析貝母甲、乙素。
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(本文于1999年7月8日收到), http://www.www.srpcoatings.com