重組人粒細(xì)胞集落刺激因子肽譜分析方法初探
作者：鐘英 鄭勇軍
單位：鐘英 鄭勇軍(杭州九源基因工程有限公司 310018)
關(guān)鍵詞：重組人粒細(xì)胞集落刺激因子；反相高效液相色譜；毛細(xì)管區(qū)帶電泳；肽譜
藥物分析雜志000204 摘要 目的：建立檢測重組人粒細(xì)胞集落刺激因子(rhG-CSF)肽譜的方法。方法：采用RP-HPLC法及CZE法。結(jié)果：檢測rhG-CSF經(jīng)胰蛋白酶裂解后的肽段，發(fā)現(xiàn)九源公司生產(chǎn)的各批產(chǎn)品的一級結(jié)構(gòu)具有一致性。2種分析方法均具有靈敏度高，重現(xiàn)性好等優(yōu)點(diǎn)。結(jié)論：本法適用于基因工程藥物的肽譜分析。
Peptide Mapping of Recombinant Human Granulocyte
Colony Stimulating Factor by RP-HPLC or CZE
, http://www.www.srpcoatings.com
Zhong Ying and Zheng Yongjun
(Hangzhou Jiuyuan Gene Engineering Co. Ltd, 310018)
Abstract Objective：Establish the method for peptide mapping of rhG-CSF. Method:High-performance liquid chromatography and capillary zone electrophoresis (CZE). Results:Relative standard deviations of peak retention or migration times were less than 1% for RP-HPLC and less than 0.1% for CZE. Batch to batch consistency is required. Conclusions:The method was suitable for the peptide mapping of rhG-CSF.
, 百拇醫(yī)藥
Key words recombinant human granulocyte colony stimulating factor, peptide mapping, RP-HPLC, CZE
肽譜是檢測基因工程藥物質(zhì)量的重要指標(biāo)之一，對每一種蛋白來說，肽譜是特征的、專一的。通過肽譜分析，可以鑒別不同批次的產(chǎn)品其一級結(jié)構(gòu)的一致性。目前分析肽譜的常用方法為溴化氰裂解甲硫氨酸位點(diǎn)[1，2]，再利用SDS-PAGE方法分離降解的片段，但此法適用于溴化氰裂解的較大肽段的分析，小片段常易丟失。而反相高效液相色譜(RP-HPLC)法[3]是根據(jù)肽段疏水性大小來分離。毛細(xì)管區(qū)帶電泳(CZE)法[4]是根據(jù)溶質(zhì)荷質(zhì)比不同進(jìn)行分離，2種方法均可分離分子量較小的肽段。本文采用N-甲苯磺�；�-L-苯基丙氨酸氯甲基酮(N-Tosyl-L-Phenylalanine Chloromethyl Ketone, TPCK)處理的胰蛋白酶裂解rhG-CSF,再用RP-HPLC法或CZE法分析裂解片段，獲得滿意結(jié)果。
, 百拇醫(yī)藥
1 儀器、試劑及樣品
Beckman HPLC系統(tǒng)，包括125型泵，168型二級管陣列檢測器，System Gold數(shù)據(jù)處理軟件；Beckman P/ACE 5000型毛細(xì)管電泳儀。
色譜柱：Vydac C18(4.6 mm×150 mm)，5 μm；毛細(xì)管柱：Beckman Uncoated, 37 cm×75 μm。
TPCK處理的胰蛋白酶為Boehringer公司產(chǎn)品，序列級；三氟醋酸為Sigma公司產(chǎn)品；乙腈為Fisher公司產(chǎn)品；碳酸氫銨、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、硼砂、硼酸均為國產(chǎn)分析純。
重組人粒細(xì)胞集落刺激因子樣品來自九源公司。
2 胰蛋白酶酶切方法
, http://www.www.srpcoatings.com
取濃度為1 mg。mL-1的rhG-CSF樣品對0.1 mol。L-1碳酸氫銨透析過夜，以1∶50(w/w)加入TPCK處理的胰蛋白酶，37 ℃酶切20 h，放入-20 ℃冰箱備用，進(jìn)樣前離心去除不溶物。
3 RP-HPLC分析方法
色譜條件：流速0.5 mL。min-1，檢測波長214 nm，進(jìn)樣量50 μL，梯度洗脫程序見表1[流動相A：0.1%(w/v)三氟醋酸，流動相B：乙腈-水(9∶1)溶液，內(nèi)含0.1%(w/v)三氟醋酸]。
表1 梯度洗脫程序 時間/min
各流動相比例/%
A
, 百拇醫(yī)藥
B
0
95
5
40
15
85
42
95
5
60
95
5
4 RP-HPLC法肽譜結(jié)果分析
, 百拇醫(yī)藥
rhG-CSF含有175個氨基酸，分子量約為18 000，其分子中含有5個Arg，分別位于第23，147，148，167，170位上，4個Lys，分別位于第17，24，35，41位上。rhG-CSF用胰蛋白酶裂解，理論上有9個裂解位點(diǎn)和8個肽段以及2種單氨基酸。但酶解常不完善或在非Arg, Lys殘基上切斷，因此會產(chǎn)生更多的分離峰。實(shí)驗(yàn)用3批rhG-CSF樣品經(jīng)胰蛋白酶裂解后肽段用RP-HPLC分析，各批間肽圖一致(980203號樣品肽譜見圖1)。用此方法重復(fù)5次，結(jié)果完全一致。計算得同一樣品中8個主要肽段同一天內(nèi)出峰時間的RSD均小于1%(表2)。
圖1 rhG-CSF樣品RP-HPLC肽譜
T1～T8為肽段
表2 RP-HPLC肽譜中8個主要肽段出峰時間及日內(nèi)RSD 肽段
, 百拇醫(yī)藥
出峰時間/min
日內(nèi)RSD/%
T1
9.734
9.681
9.842
0.8
T2
11.934
11.948
11.943
0.1
, 百拇醫(yī)藥
T3
12.449
12.475
12.435
0.2
T4
12.847
12.872
12.880
0.1
T5
14.907
, http://www.www.srpcoatings.com
14.899
14.917
0.1
T6
20.608
20.559
20.527
0.2
T7
22.064
22.046
21.921
, http://www.www.srpcoatings.com
0.4
T8
22.909
22.897
22.715
0.5
5 CZE分析條件的選擇
5.1 緩沖液pH的影響 考察不同pH的0.05 mol。L-1磷酸緩沖液，在電壓12 kV，柱溫23 ℃，檢測波長214 nm等條件不變情況下對rhG-CSF酶切后肽段的分離情況。緩沖液pH 5.8以下，肽段基本上達(dá)到基線分離，而且基線相對穩(wěn)定，但pH 2.5時肽段分離時間比pH 5.8時長1倍。緩沖液pH大于6以上，分離效果均下降(圖2)。實(shí)驗(yàn)中選擇緩沖液pH 5.8。
, 百拇醫(yī)藥
圖2 不同pH下的CZE肽譜
A. pH 7.6 B. pH 6.6 C. pH 5.8 D. pH 2.5
T1～T8為肽段
5.2 磷酸緩沖液濃度的影響 實(shí)驗(yàn)表明硼酸-氫氧化鈉體系分離效果均不如磷酸緩沖液，并隨著磷酸緩沖液濃度增大，分離效果更好(圖3)，但由于增大緩沖液濃度，電流增大，熱效應(yīng)增加，基線不穩(wěn)，易產(chǎn)生小的氣泡尖峰，影響分離。實(shí)驗(yàn)中選擇緩沖液濃度為0.05 mol。L-1。
圖3 緩沖液濃度對遷移時間的影響
圖中曲線從下至上依次為
, 百拇醫(yī)藥
T1、T7、T8、T2、T4、T6、T3、T5 8個肽段
5.3 操作電壓的選擇 在其它實(shí)驗(yàn)條件不變情況下，改變操作電壓為5，8，12，15，20 kV，8個主要肽段的遷移時間隨電壓的增加而減小。在8 kV至20 kV之間，電壓對肽段的分離基本上沒有影響(圖4)。但隨著電壓的增加，電流增大，熱效應(yīng)增加，實(shí)驗(yàn)中選擇電壓為12 kV。
5.4 樣品鹽濃度和進(jìn)樣體積的影響 實(shí)驗(yàn)表明，0.1 mol。L-1碳酸氫銨不會影響分離，樣品無需處理即可分析。進(jìn)樣量若大于5 s，分離效果下降，有若干峰分不開。實(shí)驗(yàn)中選擇壓力進(jìn)樣2 s。
, 百拇醫(yī)藥
圖4 操作電壓對遷移時間的影響
圖中曲線從下至上依次為
T1、T7、T8、T2、T4、T6、T3、T5 8個肽段
6 CZE的分析方法
毛細(xì)管柱：37 cm×75 μm，有效長度30 cm；檢測波長214 nm；分離電壓12 kV；分離時間12 min；柱溫23 ℃；壓力進(jìn)樣2 s；緩沖液為0.05 mol。L-1磷酸鹽緩沖液，pH 5.8；每次運(yùn)行之前用1 mol。L-1鹽酸、0.1 mol。L-1氫氧化鈉、蒸餾水、緩沖液分別依次沖洗毛細(xì)管各3 min。
, 百拇醫(yī)藥
7 CZE肽譜的分析結(jié)果
3批rhG-CSF樣品經(jīng)胰蛋白酶酶切后肽段CZE分析，可得批間一致(980203號樣品肽譜見圖5)。同一酶切后的樣品重復(fù)進(jìn)樣，考察了8個肽段出峰時間的日內(nèi)RSD，均小于0.1%(表3)。
圖5 rhG-CSF樣品CZE肽譜
表3 CZE肽譜中8個主要肽段出峰時間及日內(nèi)RSD 肽段
出峰時間/min
日內(nèi)RSD/%
T1
4.469
, http://www.www.srpcoatings.com
4.470
4.467
0.03
T7
5.371
5.378
5.379
0.08
T8
5.545
5.550
5.552
, http://www.www.srpcoatings.com
0.06
T2
5.876
5.874
5.867
0.08
T4
6.362
6.365
6.355
0.08
T6
, 百拇醫(yī)藥
6.796
6.801
6.799
0.04
T3
7.285
7.279
7.291
0.08
T5
9.085
9.086
, 百拇醫(yī)藥
9.099
0.09
8 RP-HPLC肽譜與CZE肽譜比較
將RP-HPLC肽譜中8個肽段分別收集，凍干過夜，用蒸餾水溶解后做CZE分析，所出的峰分別與CZE肽譜比較，見表4。
表4 出峰時間比較(min) 峰號
HPLC
CZE
T1
9.7
4.5
T2
, http://www.www.srpcoatings.com
11.9
5.9
T3
12.4
7.3
T4
12.8
6.4
T5
14.9
9.1
T6
, 百拇醫(yī)藥
20.5
6.8
T7
21.9
5.4
T8
22.8
5.6
9 討論
本文建立了胰蛋白酶裂解rhG-CSF后，用RP-HPLC法或CZE法分離檢測肽段的方法。方法高度專一，具有重復(fù)性好，靈敏度高等特點(diǎn)。RP-HPLC肽譜中各肽段理論塔板數(shù)分別為12 173，12 639，13 750，14 646，16 135，15 745，29 926，38 383，缺點(diǎn)是主要肽段需在30 min全部出現(xiàn)，且多余未消化的胰蛋白酶在45 min左右出峰，這樣整個肽譜分析過程時間需60 min。而CZE法則克服了傳統(tǒng)電泳散熱效率不高的缺點(diǎn)，全面改善分離質(zhì)量。CZE法肽譜中各肽段理論塔板數(shù)分別為21 711， 22 754， 41 025， 38 922， 21 478， 26 589， 35 471， 38 752，分析只需ng級的樣品，分析時間只需12 min，加上鹽酸、氫氧化鈉等清洗毛細(xì)管，整個肽譜分析過程只需24 min，非常適用于rhG-CSF的肽譜分析。九源公司生產(chǎn)的3批rhG-CSF經(jīng)RP-HPLC和CZE 2種方法分析，批間均達(dá)到一致。推測本法也適用于其它基因工程蛋白質(zhì)的肽譜分析。
, 百拇醫(yī)藥
參考文獻(xiàn)
1，Vera Nikodem, Jacques R Fresco. Protein fingerprinting by SDS-gel electrophoesis after partial fragmrntation with CNBr. Anal Biochem, 1979, 97: 382
2，饒春明，趙燕平，張向明等.銀染SDS-PAGE微量肽圖法的改進(jìn).生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展.1989，16(3)：241
3，Kelly A, Milos Novotny. High-sensitivity peptide mapping by capillary zone electrophoresis and microcolumn liquid chromatography, using immobilized trypsin for protein digestion. Anal Chem, 1989, 61: 2226
4，McCormick R M. Capillary zone electrophoretic separation of peptides and proteins using low pH buffers in modified silica capillaries. Anal Chem, 1988, 60:2322
(本文于1999年3月15日修改回), 百拇醫(yī)藥
單位：鐘英 鄭勇軍(杭州九源基因工程有限公司 310018)
關(guān)鍵詞：重組人粒細(xì)胞集落刺激因子；反相高效液相色譜；毛細(xì)管區(qū)帶電泳；肽譜
藥物分析雜志000204 摘要 目的：建立檢測重組人粒細(xì)胞集落刺激因子(rhG-CSF)肽譜的方法。方法：采用RP-HPLC法及CZE法。結(jié)果：檢測rhG-CSF經(jīng)胰蛋白酶裂解后的肽段，發(fā)現(xiàn)九源公司生產(chǎn)的各批產(chǎn)品的一級結(jié)構(gòu)具有一致性。2種分析方法均具有靈敏度高，重現(xiàn)性好等優(yōu)點(diǎn)。結(jié)論：本法適用于基因工程藥物的肽譜分析。
Peptide Mapping of Recombinant Human Granulocyte
Colony Stimulating Factor by RP-HPLC or CZE
, http://www.www.srpcoatings.com
Zhong Ying and Zheng Yongjun
(Hangzhou Jiuyuan Gene Engineering Co. Ltd, 310018)
Abstract Objective：Establish the method for peptide mapping of rhG-CSF. Method:High-performance liquid chromatography and capillary zone electrophoresis (CZE). Results:Relative standard deviations of peak retention or migration times were less than 1% for RP-HPLC and less than 0.1% for CZE. Batch to batch consistency is required. Conclusions:The method was suitable for the peptide mapping of rhG-CSF.
, 百拇醫(yī)藥
Key words recombinant human granulocyte colony stimulating factor, peptide mapping, RP-HPLC, CZE
肽譜是檢測基因工程藥物質(zhì)量的重要指標(biāo)之一，對每一種蛋白來說，肽譜是特征的、專一的。通過肽譜分析，可以鑒別不同批次的產(chǎn)品其一級結(jié)構(gòu)的一致性。目前分析肽譜的常用方法為溴化氰裂解甲硫氨酸位點(diǎn)[1，2]，再利用SDS-PAGE方法分離降解的片段，但此法適用于溴化氰裂解的較大肽段的分析，小片段常易丟失。而反相高效液相色譜(RP-HPLC)法[3]是根據(jù)肽段疏水性大小來分離。毛細(xì)管區(qū)帶電泳(CZE)法[4]是根據(jù)溶質(zhì)荷質(zhì)比不同進(jìn)行分離，2種方法均可分離分子量較小的肽段。本文采用N-甲苯磺�；�-L-苯基丙氨酸氯甲基酮(N-Tosyl-L-Phenylalanine Chloromethyl Ketone, TPCK)處理的胰蛋白酶裂解rhG-CSF,再用RP-HPLC法或CZE法分析裂解片段，獲得滿意結(jié)果。
, 百拇醫(yī)藥
1 儀器、試劑及樣品
Beckman HPLC系統(tǒng)，包括125型泵，168型二級管陣列檢測器，System Gold數(shù)據(jù)處理軟件；Beckman P/ACE 5000型毛細(xì)管電泳儀。
色譜柱：Vydac C18(4.6 mm×150 mm)，5 μm；毛細(xì)管柱：Beckman Uncoated, 37 cm×75 μm。
TPCK處理的胰蛋白酶為Boehringer公司產(chǎn)品，序列級；三氟醋酸為Sigma公司產(chǎn)品；乙腈為Fisher公司產(chǎn)品；碳酸氫銨、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、硼砂、硼酸均為國產(chǎn)分析純。
重組人粒細(xì)胞集落刺激因子樣品來自九源公司。
2 胰蛋白酶酶切方法
, http://www.www.srpcoatings.com
取濃度為1 mg。mL-1的rhG-CSF樣品對0.1 mol。L-1碳酸氫銨透析過夜，以1∶50(w/w)加入TPCK處理的胰蛋白酶，37 ℃酶切20 h，放入-20 ℃冰箱備用，進(jìn)樣前離心去除不溶物。
3 RP-HPLC分析方法
色譜條件：流速0.5 mL。min-1，檢測波長214 nm，進(jìn)樣量50 μL，梯度洗脫程序見表1[流動相A：0.1%(w/v)三氟醋酸，流動相B：乙腈-水(9∶1)溶液，內(nèi)含0.1%(w/v)三氟醋酸]。
表1 梯度洗脫程序 時間/min
各流動相比例/%
A
, 百拇醫(yī)藥
B
0
95
5
40
15
85
42
95
5
60
95
5
4 RP-HPLC法肽譜結(jié)果分析
, 百拇醫(yī)藥
rhG-CSF含有175個氨基酸，分子量約為18 000，其分子中含有5個Arg，分別位于第23，147，148，167，170位上，4個Lys，分別位于第17，24，35，41位上。rhG-CSF用胰蛋白酶裂解，理論上有9個裂解位點(diǎn)和8個肽段以及2種單氨基酸。但酶解常不完善或在非Arg, Lys殘基上切斷，因此會產(chǎn)生更多的分離峰。實(shí)驗(yàn)用3批rhG-CSF樣品經(jīng)胰蛋白酶裂解后肽段用RP-HPLC分析，各批間肽圖一致(980203號樣品肽譜見圖1)。用此方法重復(fù)5次，結(jié)果完全一致。計算得同一樣品中8個主要肽段同一天內(nèi)出峰時間的RSD均小于1%(表2)。
圖1 rhG-CSF樣品RP-HPLC肽譜
T1～T8為肽段
表2 RP-HPLC肽譜中8個主要肽段出峰時間及日內(nèi)RSD 肽段
, 百拇醫(yī)藥
出峰時間/min
日內(nèi)RSD/%
T1
9.734
9.681
9.842
0.8
T2
11.934
11.948
11.943
0.1
, 百拇醫(yī)藥
T3
12.449
12.475
12.435
0.2
T4
12.847
12.872
12.880
0.1
T5
14.907
, http://www.www.srpcoatings.com
14.899
14.917
0.1
T6
20.608
20.559
20.527
0.2
T7
22.064
22.046
21.921
, http://www.www.srpcoatings.com
0.4
T8
22.909
22.897
22.715
0.5
5 CZE分析條件的選擇
5.1 緩沖液pH的影響 考察不同pH的0.05 mol。L-1磷酸緩沖液，在電壓12 kV，柱溫23 ℃，檢測波長214 nm等條件不變情況下對rhG-CSF酶切后肽段的分離情況。緩沖液pH 5.8以下，肽段基本上達(dá)到基線分離，而且基線相對穩(wěn)定，但pH 2.5時肽段分離時間比pH 5.8時長1倍。緩沖液pH大于6以上，分離效果均下降(圖2)。實(shí)驗(yàn)中選擇緩沖液pH 5.8。
, 百拇醫(yī)藥
圖2 不同pH下的CZE肽譜
A. pH 7.6 B. pH 6.6 C. pH 5.8 D. pH 2.5
T1～T8為肽段
5.2 磷酸緩沖液濃度的影響 實(shí)驗(yàn)表明硼酸-氫氧化鈉體系分離效果均不如磷酸緩沖液，并隨著磷酸緩沖液濃度增大，分離效果更好(圖3)，但由于增大緩沖液濃度，電流增大，熱效應(yīng)增加，基線不穩(wěn)，易產(chǎn)生小的氣泡尖峰，影響分離。實(shí)驗(yàn)中選擇緩沖液濃度為0.05 mol。L-1。
圖3 緩沖液濃度對遷移時間的影響
圖中曲線從下至上依次為
, 百拇醫(yī)藥
T1、T7、T8、T2、T4、T6、T3、T5 8個肽段
5.3 操作電壓的選擇 在其它實(shí)驗(yàn)條件不變情況下，改變操作電壓為5，8，12，15，20 kV，8個主要肽段的遷移時間隨電壓的增加而減小。在8 kV至20 kV之間，電壓對肽段的分離基本上沒有影響(圖4)。但隨著電壓的增加，電流增大，熱效應(yīng)增加，實(shí)驗(yàn)中選擇電壓為12 kV。
5.4 樣品鹽濃度和進(jìn)樣體積的影響 實(shí)驗(yàn)表明，0.1 mol。L-1碳酸氫銨不會影響分離，樣品無需處理即可分析。進(jìn)樣量若大于5 s，分離效果下降，有若干峰分不開。實(shí)驗(yàn)中選擇壓力進(jìn)樣2 s。
, 百拇醫(yī)藥
圖4 操作電壓對遷移時間的影響
圖中曲線從下至上依次為
T1、T7、T8、T2、T4、T6、T3、T5 8個肽段
6 CZE的分析方法
毛細(xì)管柱：37 cm×75 μm，有效長度30 cm；檢測波長214 nm；分離電壓12 kV；分離時間12 min；柱溫23 ℃；壓力進(jìn)樣2 s；緩沖液為0.05 mol。L-1磷酸鹽緩沖液，pH 5.8；每次運(yùn)行之前用1 mol。L-1鹽酸、0.1 mol。L-1氫氧化鈉、蒸餾水、緩沖液分別依次沖洗毛細(xì)管各3 min。
, 百拇醫(yī)藥
7 CZE肽譜的分析結(jié)果
3批rhG-CSF樣品經(jīng)胰蛋白酶酶切后肽段CZE分析，可得批間一致(980203號樣品肽譜見圖5)。同一酶切后的樣品重復(fù)進(jìn)樣，考察了8個肽段出峰時間的日內(nèi)RSD，均小于0.1%(表3)。
圖5 rhG-CSF樣品CZE肽譜
表3 CZE肽譜中8個主要肽段出峰時間及日內(nèi)RSD 肽段
出峰時間/min
日內(nèi)RSD/%
T1
4.469
, http://www.www.srpcoatings.com
4.470
4.467
0.03
T7
5.371
5.378
5.379
0.08
T8
5.545
5.550
5.552
, http://www.www.srpcoatings.com
0.06
T2
5.876
5.874
5.867
0.08
T4
6.362
6.365
6.355
0.08
T6
, 百拇醫(yī)藥
6.796
6.801
6.799
0.04
T3
7.285
7.279
7.291
0.08
T5
9.085
9.086
, 百拇醫(yī)藥
9.099
0.09
8 RP-HPLC肽譜與CZE肽譜比較
將RP-HPLC肽譜中8個肽段分別收集，凍干過夜，用蒸餾水溶解后做CZE分析，所出的峰分別與CZE肽譜比較，見表4。
表4 出峰時間比較(min) 峰號
HPLC
CZE
T1
9.7
4.5
T2
, http://www.www.srpcoatings.com
11.9
5.9
T3
12.4
7.3
T4
12.8
6.4
T5
14.9
9.1
T6
, 百拇醫(yī)藥
20.5
6.8
T7
21.9
5.4
T8
22.8
5.6
9 討論
本文建立了胰蛋白酶裂解rhG-CSF后，用RP-HPLC法或CZE法分離檢測肽段的方法。方法高度專一，具有重復(fù)性好，靈敏度高等特點(diǎn)。RP-HPLC肽譜中各肽段理論塔板數(shù)分別為12 173，12 639，13 750，14 646，16 135，15 745，29 926，38 383，缺點(diǎn)是主要肽段需在30 min全部出現(xiàn)，且多余未消化的胰蛋白酶在45 min左右出峰，這樣整個肽譜分析過程時間需60 min。而CZE法則克服了傳統(tǒng)電泳散熱效率不高的缺點(diǎn)，全面改善分離質(zhì)量。CZE法肽譜中各肽段理論塔板數(shù)分別為21 711， 22 754， 41 025， 38 922， 21 478， 26 589， 35 471， 38 752，分析只需ng級的樣品，分析時間只需12 min，加上鹽酸、氫氧化鈉等清洗毛細(xì)管，整個肽譜分析過程只需24 min，非常適用于rhG-CSF的肽譜分析。九源公司生產(chǎn)的3批rhG-CSF經(jīng)RP-HPLC和CZE 2種方法分析，批間均達(dá)到一致。推測本法也適用于其它基因工程蛋白質(zhì)的肽譜分析。
, 百拇醫(yī)藥
參考文獻(xiàn)
1，Vera Nikodem, Jacques R Fresco. Protein fingerprinting by SDS-gel electrophoesis after partial fragmrntation with CNBr. Anal Biochem, 1979, 97: 382
2，饒春明，趙燕平，張向明等.銀染SDS-PAGE微量肽圖法的改進(jìn).生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展.1989，16(3)：241
3，Kelly A, Milos Novotny. High-sensitivity peptide mapping by capillary zone electrophoresis and microcolumn liquid chromatography, using immobilized trypsin for protein digestion. Anal Chem, 1989, 61: 2226
4，McCormick R M. Capillary zone electrophoretic separation of peptides and proteins using low pH buffers in modified silica capillaries. Anal Chem, 1988, 60:2322
(本文于1999年3月15日修改回), 百拇醫(yī)藥