高效液相色譜法蒸發(fā)光散射檢測器測定酸棗仁中酸棗仁皂苷A及B的含量
作者：李會軍 李萍
單位：李會軍 李萍(中國藥科大學(xué)生藥學(xué)教研室 南京 210038)
關(guān)鍵詞：酸棗仁；高效液相色譜法；蒸發(fā)光散射檢測器
藥物分析雜志000403 摘要 目的：建立酸棗仁中酸棗仁皂苷A及 B的含量測定方法 ，為該藥材 提供質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)。方法：應(yīng)用高效液相色譜法-蒸發(fā)光散射檢測器(HPLC-ELSD)，Allspere ODS-2(250 mm×4.6 mm , 5 μm)色譜柱 ，甲醇-水 -冰醋酸(70∶30∶1)為流動相 ，測定了酸棗仁中酸棗仁皂苷A及B的含量。結(jié)果：分析了11批商品藥材。酸棗仁皂苷A及B的平均回收率分別為92.4%(RSD=3.8%)和91.8% (RSD=3.9%) 。結(jié)論：方法快速簡便，重現(xiàn)性良好，可用于酸棗仁藥材的質(zhì)量控制 。
Determination of Jujuboside A and Jujuboside B
, 百拇醫(yī)藥
in Spine Date Seed by HPLC-ELSD
Li Huijun and Li Ping
(College of Chinese Meteria Medica, China Pharmaceutical University, Nanjing 210038)
Abstract Objective：To develop a method to determine the contents of jujuboside A and jujuboside B in Spine Date Seed so as to evaluate the quality of this herb drug.Methods:With the use of Evaporative Light Scattering Detector (ELSD), an Allspere ODS-2 (250 mm×4.6 mm , 5 μm ) column as analytical column and methanol-water-glacial acetic acid ( 70∶30∶1 ) as mobile phase, the quantities of jujuboside A and jujuboside B in Spine Date Seed were measured.Results:11 commercial crude drugs were analyzed. The mean recoveries of jujuboside A and jujuboside B were 92.4%(RSD=3.8%) and 91.8% (RSD=3.9%), respectively.Conclusion:This method is fast , simple and reproducible and can be used for the quality control of this Chinese herbal medicine.
, 百拇醫(yī)藥
Key words Spine Date Seed , HPLC , ELSD
酸棗仁為鼠李科植物酸棗Ziziphus jujuba var. spinosa (Bunge)Hu ex H.F.Chou 的干燥成熟種子,具有養(yǎng)心安神的功效，是較為常用的鎮(zhèn)靜催眠中藥。酸棗仁皂苷A及B為其鎮(zhèn)靜催眠的有效成分之一[1]，含量測定方法報(bào)道的有一階導(dǎo)數(shù)光譜法[2]及薄層掃描法[3]，本文首次采用高效液相色譜法利用蒸發(fā)光散射檢測器(ELSD)對酸棗仁皂苷A及B進(jìn)行了含量測定研究。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明該法靈敏度、穩(wěn)定性和重現(xiàn)性均能滿足要求，是一種檢測皂苷類成分的有效方法。
1 儀器與試劑
日本島津LC-10AD液相色譜儀；法國SEDEX55型蒸發(fā)光散射檢測器；HS色譜數(shù)據(jù)工作站(杭州英譜科技開發(fā)有限公司)；各地酸棗仁藥材樣品(見表1)均經(jīng)作者鑒定；酸棗仁皂苷A及B對照品由中國藥品生物制品檢定所提供，純度≥98.5% ；試驗(yàn)用水為上海獲特滿公司產(chǎn)純凈水 ；甲醇為淮陰化學(xué)試劑廠產(chǎn)色譜純 ； 其它試劑均為南京化學(xué)試劑廠產(chǎn)分析純。
, 百拇醫(yī)藥
2 色譜及檢測條件
色譜柱：Allspere ODS-2(250 mm×4.6 mm , 5 μm) ; 預(yù)柱： Pellicular C18 (7.5 mm×4.6 mm); 流動相：甲醇-水-冰醋酸(70∶30∶1); 流速：1mL。min-1。柱溫：20 ℃ ；ELSD氣化室溫度：75 ℃；氮?dú)鈮毫Γ?.21 MPa 。
3 溶液的制備
對照品溶液的制備：分別精密稱取對照品酸棗仁皂苷A 4.092 mg及 B 1.492 mg ，用甲醇溶解并定容至5 mL容量瓶，搖勻，即得。
供試品溶液的制備：按文獻(xiàn)[2]的提取純化方法，精密稱取干燥細(xì)粉(40目篩)約5 g ，置索氏提取器中用乙醚脫脂4 h ，棄去乙醚液，藥渣揮盡醚液，用甲醇回流提取12 h，甲醇液蒸干，殘?jiān)?5 mL水溶解并轉(zhuǎn)移至分液漏斗中，用水飽和的正丁醇萃取3 次，每次10 mL，合并正丁醇層，再用正丁醇飽和的氨水洗滌2次，每次10 mL，正丁醇層蒸干，殘?jiān)眉状既芙獠⒍ㄈ葜? mL ，即得 ，臨用前取部分溶液經(jīng)Millipore溶劑過濾系統(tǒng)過濾后進(jìn)樣。
, 百拇醫(yī)藥
4 線性關(guān)系考察
精密量取對照品溶液2，4，6，8，10，12 μL，分別進(jìn)樣，按色譜測定條件，測得酸棗仁皂苷A及B的峰面積，用最小二乘法以進(jìn)樣量X(μg)對峰面積對數(shù)(logY)進(jìn)行線性回歸，回歸方程分別為：
logY=5.197X- 5.264 r=0.999 4
logY=5.073X- 5.187 r=0.999 1
線性范圍分別為1.6～9.6 μg 和0.6～3.6 μg。
5 穩(wěn)定性試驗(yàn)
取酸棗仁藥材供試品溶液，進(jìn)行穩(wěn)定性試驗(yàn)，測定結(jié)果表明在24 h之內(nèi)穩(wěn)定。
6 精密度試驗(yàn)
, 百拇醫(yī)藥
取上述對照品溶液5 μL連續(xù)進(jìn)樣6次，測得各次峰面積，計(jì)算RSD，酸棗仁皂苷A及B的RSD分別為1.0% 和2.7%
7 重復(fù)性試驗(yàn)
取同一批樣品精密稱取5份，按上述測定方法，進(jìn)行5次平行實(shí)驗(yàn)測得酸棗仁皂苷A及B平均含量分別為0.080 3%和0.034 2%，酸棗仁皂苷A及B的RSD分別為3.4% 和3.6%。
8 回收率試驗(yàn)
精密稱取已測知含量的酸棗仁藥材樣品約2.5 g，定量加入上述對照品溶液2.5 mL , 按上述方法制備溶液、測定、計(jì)算，酸棗仁皂苷A及B的平均回收率分別為92.4%和91.8%, RSD分別為3.8%和3.9%, n=3。
9 樣品測定
取酸棗仁藥材供試品溶液在上述色譜條件下進(jìn)樣，每次5 μL或10 μL，按外標(biāo)兩點(diǎn)法對數(shù)方程計(jì)算 ，所得結(jié)果見表1 ，對照品和樣品色譜圖見圖1 。
, 百拇醫(yī)藥
表1 樣品測定結(jié)果(n=3) 產(chǎn)地
含量/%
酸棗仁皂苷A
酸棗仁皂苷B
河北安國(生)
0.0803
0.0335
河北安國(生)
0.0597
0.0368
山東泰安(生)
0.0753
, 百拇醫(yī)藥
0.0301
山東濟(jì)南(生)
0.0662
0.0447
山東濟(jì)南(炒)
0.0828
0.0511
河北 (生)
0.0643
0.0251
山東臨沂(炒)
0.0599
, 百拇醫(yī)藥
0.0413
山東臨沂(生)
0.0567
0.0415
山東棗莊(炒)
0.0620
0.0456
山東棗莊(生)
0.0396
0.0324
山東濟(jì)南(生)
0.0467
, 百拇醫(yī)藥
0.0374
圖1 高效液相色譜分離圖
A.對照品 B.供試品
1.酸棗仁皂苷A 2.酸棗仁皂苷B
10 討論
10.1 酸棗仁中所含的酸棗仁皂苷A及B為三萜皂苷類成分，紫外吸收差，不宜用UV檢測，而ELSD檢測器為質(zhì)量型通用檢測器，可檢測任何揮發(fā)性低于流動相的化合物，且化合物的響應(yīng)值接近，因而峰面積比例亦近乎各組分的質(zhì)量之比，同時(shí)靈敏度及穩(wěn)定性亦能符合含量測定的要求,正逐步成為分析無紫外吸收類成分的有力工具[4]。
10.2 霧化器氣體壓力(載氣流速)及漂移管溫度是ELSD檢測器的2個(gè)重要可調(diào)參數(shù)[5]。載氣流速太低，會產(chǎn)生大量微滴，從而導(dǎo)致噪音信號；而載氣流速太高時(shí)霧滴量下降導(dǎo)致信號降低。溫度過高，分析樣品部分揮發(fā)導(dǎo)致檢測器響應(yīng)下降；溫度降低，溶劑揮發(fā)不夠完全而導(dǎo)致基線不穩(wěn)。實(shí)驗(yàn)中需反復(fù)、仔細(xì)調(diào)節(jié)參數(shù)以便得到最優(yōu)信噪比及平穩(wěn)基線。
, http://www.www.srpcoatings.com
10.3 曾對甲醇-水(80∶20)、甲醇-水(70∶30)等不同流動相進(jìn)行研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)甲醇-水-冰醋酸(70∶30∶1)能得到較好的對稱峰和分離度。含量測定結(jié)果表明，酸棗仁藥材各主產(chǎn)區(qū)樣品中酸棗仁皂苷A及B含量有一定差異，且炒棗仁中含量普遍高于生棗仁，這與文獻(xiàn)[3]報(bào)道一致。
參考文獻(xiàn)
1，Watanabd I, Saito H, Takagi K. Pharmacological studies of Zizyphus seeds. Japan J Pharmacol, 1973 ，23(4) : 563
2，展雪峰. 一階導(dǎo)數(shù)紫外分光光度法測定酸棗仁中酸棗仁皂甙A的含量. 中草藥，1993，24(10): 525
3，王健，林曉. 生炒酸棗仁中酸棗仁皂甙A和B的含量比較. 中成藥，1994, 16 (10): 24
4，田南卉, 王頡 , 厲進(jìn)忠 . 高效液相色譜法蒸發(fā)光散射檢測器測定銀杏葉提取物中內(nèi)酯的含量. 藥物分析雜志 ，1997 ，17(4) : 282
5，馮埃生 , 鄒漢法，汪海林等. 影響高效液相色譜/揮發(fā)激光散射檢測器檢測性能基本因素的考察. 藥物分析雜志 , 1996 , 16(6) : 414
(本文于1999年5月14日收到), 百拇醫(yī)藥
單位：李會軍 李萍(中國藥科大學(xué)生藥學(xué)教研室 南京 210038)
關(guān)鍵詞：酸棗仁；高效液相色譜法；蒸發(fā)光散射檢測器
藥物分析雜志000403 摘要 目的：建立酸棗仁中酸棗仁皂苷A及 B的含量測定方法 ，為該藥材 提供質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)。方法：應(yīng)用高效液相色譜法-蒸發(fā)光散射檢測器(HPLC-ELSD)，Allspere ODS-2(250 mm×4.6 mm , 5 μm)色譜柱 ，甲醇-水 -冰醋酸(70∶30∶1)為流動相 ，測定了酸棗仁中酸棗仁皂苷A及B的含量。結(jié)果：分析了11批商品藥材。酸棗仁皂苷A及B的平均回收率分別為92.4%(RSD=3.8%)和91.8% (RSD=3.9%) 。結(jié)論：方法快速簡便，重現(xiàn)性良好，可用于酸棗仁藥材的質(zhì)量控制 。
Determination of Jujuboside A and Jujuboside B
, 百拇醫(yī)藥
in Spine Date Seed by HPLC-ELSD
Li Huijun and Li Ping
(College of Chinese Meteria Medica, China Pharmaceutical University, Nanjing 210038)
Abstract Objective：To develop a method to determine the contents of jujuboside A and jujuboside B in Spine Date Seed so as to evaluate the quality of this herb drug.Methods:With the use of Evaporative Light Scattering Detector (ELSD), an Allspere ODS-2 (250 mm×4.6 mm , 5 μm ) column as analytical column and methanol-water-glacial acetic acid ( 70∶30∶1 ) as mobile phase, the quantities of jujuboside A and jujuboside B in Spine Date Seed were measured.Results:11 commercial crude drugs were analyzed. The mean recoveries of jujuboside A and jujuboside B were 92.4%(RSD=3.8%) and 91.8% (RSD=3.9%), respectively.Conclusion:This method is fast , simple and reproducible and can be used for the quality control of this Chinese herbal medicine.
, 百拇醫(yī)藥
Key words Spine Date Seed , HPLC , ELSD
酸棗仁為鼠李科植物酸棗Ziziphus jujuba var. spinosa (Bunge)Hu ex H.F.Chou 的干燥成熟種子,具有養(yǎng)心安神的功效，是較為常用的鎮(zhèn)靜催眠中藥。酸棗仁皂苷A及B為其鎮(zhèn)靜催眠的有效成分之一[1]，含量測定方法報(bào)道的有一階導(dǎo)數(shù)光譜法[2]及薄層掃描法[3]，本文首次采用高效液相色譜法利用蒸發(fā)光散射檢測器(ELSD)對酸棗仁皂苷A及B進(jìn)行了含量測定研究。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明該法靈敏度、穩(wěn)定性和重現(xiàn)性均能滿足要求，是一種檢測皂苷類成分的有效方法。
1 儀器與試劑
日本島津LC-10AD液相色譜儀；法國SEDEX55型蒸發(fā)光散射檢測器；HS色譜數(shù)據(jù)工作站(杭州英譜科技開發(fā)有限公司)；各地酸棗仁藥材樣品(見表1)均經(jīng)作者鑒定；酸棗仁皂苷A及B對照品由中國藥品生物制品檢定所提供，純度≥98.5% ；試驗(yàn)用水為上海獲特滿公司產(chǎn)純凈水 ；甲醇為淮陰化學(xué)試劑廠產(chǎn)色譜純 ； 其它試劑均為南京化學(xué)試劑廠產(chǎn)分析純。
, 百拇醫(yī)藥
2 色譜及檢測條件
色譜柱：Allspere ODS-2(250 mm×4.6 mm , 5 μm) ; 預(yù)柱： Pellicular C18 (7.5 mm×4.6 mm); 流動相：甲醇-水-冰醋酸(70∶30∶1); 流速：1mL。min-1。柱溫：20 ℃ ；ELSD氣化室溫度：75 ℃；氮?dú)鈮毫Γ?.21 MPa 。
3 溶液的制備
對照品溶液的制備：分別精密稱取對照品酸棗仁皂苷A 4.092 mg及 B 1.492 mg ，用甲醇溶解并定容至5 mL容量瓶，搖勻，即得。
供試品溶液的制備：按文獻(xiàn)[2]的提取純化方法，精密稱取干燥細(xì)粉(40目篩)約5 g ，置索氏提取器中用乙醚脫脂4 h ，棄去乙醚液，藥渣揮盡醚液，用甲醇回流提取12 h，甲醇液蒸干，殘?jiān)?5 mL水溶解并轉(zhuǎn)移至分液漏斗中，用水飽和的正丁醇萃取3 次，每次10 mL，合并正丁醇層，再用正丁醇飽和的氨水洗滌2次，每次10 mL，正丁醇層蒸干，殘?jiān)眉状既芙獠⒍ㄈ葜? mL ，即得 ，臨用前取部分溶液經(jīng)Millipore溶劑過濾系統(tǒng)過濾后進(jìn)樣。
, 百拇醫(yī)藥
4 線性關(guān)系考察
精密量取對照品溶液2，4，6，8，10，12 μL，分別進(jìn)樣，按色譜測定條件，測得酸棗仁皂苷A及B的峰面積，用最小二乘法以進(jìn)樣量X(μg)對峰面積對數(shù)(logY)進(jìn)行線性回歸，回歸方程分別為：
logY=5.197X- 5.264 r=0.999 4
logY=5.073X- 5.187 r=0.999 1
線性范圍分別為1.6～9.6 μg 和0.6～3.6 μg。
5 穩(wěn)定性試驗(yàn)
取酸棗仁藥材供試品溶液，進(jìn)行穩(wěn)定性試驗(yàn)，測定結(jié)果表明在24 h之內(nèi)穩(wěn)定。
6 精密度試驗(yàn)
, 百拇醫(yī)藥
取上述對照品溶液5 μL連續(xù)進(jìn)樣6次，測得各次峰面積，計(jì)算RSD，酸棗仁皂苷A及B的RSD分別為1.0% 和2.7%
7 重復(fù)性試驗(yàn)
取同一批樣品精密稱取5份，按上述測定方法，進(jìn)行5次平行實(shí)驗(yàn)測得酸棗仁皂苷A及B平均含量分別為0.080 3%和0.034 2%，酸棗仁皂苷A及B的RSD分別為3.4% 和3.6%。
8 回收率試驗(yàn)
精密稱取已測知含量的酸棗仁藥材樣品約2.5 g，定量加入上述對照品溶液2.5 mL , 按上述方法制備溶液、測定、計(jì)算，酸棗仁皂苷A及B的平均回收率分別為92.4%和91.8%, RSD分別為3.8%和3.9%, n=3。
9 樣品測定
取酸棗仁藥材供試品溶液在上述色譜條件下進(jìn)樣，每次5 μL或10 μL，按外標(biāo)兩點(diǎn)法對數(shù)方程計(jì)算 ，所得結(jié)果見表1 ，對照品和樣品色譜圖見圖1 。
, 百拇醫(yī)藥
表1 樣品測定結(jié)果(n=3) 產(chǎn)地
含量/%
酸棗仁皂苷A
酸棗仁皂苷B
河北安國(生)
0.0803
0.0335
河北安國(生)
0.0597
0.0368
山東泰安(生)
0.0753
, 百拇醫(yī)藥
0.0301
山東濟(jì)南(生)
0.0662
0.0447
山東濟(jì)南(炒)
0.0828
0.0511
河北 (生)
0.0643
0.0251
山東臨沂(炒)
0.0599
, 百拇醫(yī)藥
0.0413
山東臨沂(生)
0.0567
0.0415
山東棗莊(炒)
0.0620
0.0456
山東棗莊(生)
0.0396
0.0324
山東濟(jì)南(生)
0.0467
, 百拇醫(yī)藥
0.0374
圖1 高效液相色譜分離圖
A.對照品 B.供試品
1.酸棗仁皂苷A 2.酸棗仁皂苷B
10 討論
10.1 酸棗仁中所含的酸棗仁皂苷A及B為三萜皂苷類成分，紫外吸收差，不宜用UV檢測，而ELSD檢測器為質(zhì)量型通用檢測器，可檢測任何揮發(fā)性低于流動相的化合物，且化合物的響應(yīng)值接近，因而峰面積比例亦近乎各組分的質(zhì)量之比，同時(shí)靈敏度及穩(wěn)定性亦能符合含量測定的要求,正逐步成為分析無紫外吸收類成分的有力工具[4]。
10.2 霧化器氣體壓力(載氣流速)及漂移管溫度是ELSD檢測器的2個(gè)重要可調(diào)參數(shù)[5]。載氣流速太低，會產(chǎn)生大量微滴，從而導(dǎo)致噪音信號；而載氣流速太高時(shí)霧滴量下降導(dǎo)致信號降低。溫度過高，分析樣品部分揮發(fā)導(dǎo)致檢測器響應(yīng)下降；溫度降低，溶劑揮發(fā)不夠完全而導(dǎo)致基線不穩(wěn)。實(shí)驗(yàn)中需反復(fù)、仔細(xì)調(diào)節(jié)參數(shù)以便得到最優(yōu)信噪比及平穩(wěn)基線。
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10.3 曾對甲醇-水(80∶20)、甲醇-水(70∶30)等不同流動相進(jìn)行研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)甲醇-水-冰醋酸(70∶30∶1)能得到較好的對稱峰和分離度。含量測定結(jié)果表明，酸棗仁藥材各主產(chǎn)區(qū)樣品中酸棗仁皂苷A及B含量有一定差異，且炒棗仁中含量普遍高于生棗仁，這與文獻(xiàn)[3]報(bào)道一致。
參考文獻(xiàn)
1，Watanabd I, Saito H, Takagi K. Pharmacological studies of Zizyphus seeds. Japan J Pharmacol, 1973 ，23(4) : 563
2，展雪峰. 一階導(dǎo)數(shù)紫外分光光度法測定酸棗仁中酸棗仁皂甙A的含量. 中草藥，1993，24(10): 525
3，王健，林曉. 生炒酸棗仁中酸棗仁皂甙A和B的含量比較. 中成藥，1994, 16 (10): 24
4，田南卉, 王頡 , 厲進(jìn)忠 . 高效液相色譜法蒸發(fā)光散射檢測器測定銀杏葉提取物中內(nèi)酯的含量. 藥物分析雜志 ，1997 ，17(4) : 282
5，馮埃生 , 鄒漢法，汪海林等. 影響高效液相色譜/揮發(fā)激光散射檢測器檢測性能基本因素的考察. 藥物分析雜志 , 1996 , 16(6) : 414
(本文于1999年5月14日收到), 百拇醫(yī)藥