細(xì)胞內(nèi)抗體：抗病毒感染和腫瘤性疾病的新治療計(jì)劃
作者：郝連杰(譯)
單位：同濟(jì)醫(yī)科大學(xué)附屬同濟(jì)醫(yī)院
關(guān)鍵詞：
德國醫(yī)學(xué)000212Intrazelluläre Antikörper: Ein neues Therapiekonzept
gegen Virusinfektionen und Tumorerkrankungen
Hubert E.Blum
抗體(免疫球蛋白)是免疫系統(tǒng)的重要組成部分，長久以來由于它的特異性和高親和力被應(yīng)用于分離和純化靶抗原。近年研究指出，抗體還能在細(xì)胞內(nèi)結(jié)合其相應(yīng)抗原，在細(xì)胞內(nèi)以特殊的方式干擾重要的生物過程。因此，細(xì)胞內(nèi)抗體在理論上可能是針對病毒感染和腫瘤疾病的特異性治療方法。
, http://www.www.srpcoatings.com
抗體：結(jié)構(gòu)和功能
免疫球蛋白是B淋巴細(xì)胞形成的糖蛋白，是各種哺乳動(dòng)物體液免疫應(yīng)答的主要成分，能與誘導(dǎo)抗體形成的抗原特異性結(jié)合。各種抗體均由兩相同的“輕鏈”和相同的“重鏈”構(gòu)成，可被不同的蛋白酶裂解。木瓜蛋白酶(papain)蛋白酶水解獲得的Fab段由抗體的輕鏈以及重鏈的可變區(qū)(VH)和第一穩(wěn)定區(qū)(CH1)組成。合成的單鏈-FV-片段(sFv)僅是重鏈可變區(qū)(VH)和輕鏈可變區(qū)(VL)通過一短肽結(jié)合序列共價(jià)相連接而成。
抗體和其片段在醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)研究和疾病的診斷及治療中有極重要的意義。Khler 和Milstein 1975年報(bào)道從雜交瘤(漿細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞的雜交瘤)制備特異性單克隆抗體是制備高特異性抗體制劑的關(guān)鍵步驟。
細(xì)胞內(nèi)抗體：原理
, http://www.www.srpcoatings.com
現(xiàn)在可以用基因技術(shù)方法分離和鑒定編碼抗體分子多肽鏈的DNA序列。從雜交瘤細(xì)胞系分離細(xì)胞RNA后，首先用逆轉(zhuǎn)錄酶轉(zhuǎn)錄成cDNA，接著再用特異性寡脫氧核苷酸聚合酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增免疫球蛋白-cDNA(所謂RT-PCR)。所得到的PCR-產(chǎn)物直接作序列分析，鑒定可用基因技術(shù)制備某種抗體的基因。從骨髓瘤細(xì)胞、猴腎細(xì)胞(CHS)以及細(xì)菌、酵母、昆蟲細(xì)胞和植物中能成功地生產(chǎn)出單克隆抗體，說明許多來自微生物和細(xì)胞系統(tǒng)能合成有功能的免疫球蛋白分子，提示多種細(xì)胞類型可以制備出結(jié)構(gòu)正確有皺疊的抗體，為細(xì)胞內(nèi)抗體的廣泛應(yīng)用提供了先決條件。
正常情況抗體被細(xì)胞分泌到血清中或者細(xì)胞培養(yǎng)基中，很易純化。對抗體分泌具有重要意義的是長約20個(gè)氨基酸短肽序列(所謂信號(hào)系列)，它提供免疫球蛋白鏈的遺傳信息，介導(dǎo)合成蛋白細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)。在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的氧化環(huán)境內(nèi)，抗體重鏈和輕鏈相互結(jié)合成為異二聚體(Heterodimeren)。接著通過高爾基器分泌出矯正過有皺疊的抗體分子�？贵w的Fab-段或sFv-段在細(xì)胞內(nèi)應(yīng)用有其優(yōu)越性，F(xiàn)ab-段是二硫鍵結(jié)合的二蛋白鏈，在細(xì)胞漿的還原環(huán)境中構(gòu)成效率甚低。因此，F(xiàn)ab-段主要要求應(yīng)用于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。而非自然形成sFv-段最適宜細(xì)胞內(nèi)應(yīng)用，它的功能并不要求單個(gè)肽鏈間的二硫鍵結(jié)合。
, http://www.www.srpcoatings.com
用抗體修飾細(xì)胞內(nèi)某種蛋白質(zhì)的功能，首先需要確定出能結(jié)合這種蛋白質(zhì)的單克隆抗體，再用RT-PCR從雜交瘤細(xì)胞系分離、鑒定出這種抗體免疫球蛋白重鏈和輕鏈可變區(qū)的編碼序列。此外，也可以通過“噬菌體展現(xiàn)”(“phage-display”)步驟選擇恰當(dāng)?shù)目贵w片段和分離相應(yīng)的遺傳信息。含有編碼免疫球蛋白重鏈和輕鏈可變區(qū)序列的分離物可借助PCR技術(shù)，用一編碼短結(jié)合肽DNA序列相連接，構(gòu)成sFv片段。將最終的DNA匣(DNA-Kassette)插入DNA-載體，即可在靶細(xì)胞表達(dá)出抗體片段。因?yàn)檎＝閷?dǎo)抗體分泌的信號(hào)序列未與表達(dá)載體整合，新合成的抗體分子在胞漿內(nèi)，與其靶抗原蛋白相整合。通過引入細(xì)胞內(nèi)蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)到一定細(xì)胞部位的短肽序列信息，可以指導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)實(shí)驗(yàn)抗體片段，進(jìn)入根據(jù)需要與靶分子相互作用的部位，例如細(xì)胞核或者線粒體。如果仍然保留信號(hào)序列，抗體將被轉(zhuǎn)運(yùn)到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)按需要通過特異性肽滯留信號(hào)可抑制細(xì)胞繼續(xù)分泌。最后還可以分析抗體與靶抗原相互作用的效果，針對病毒感染作用的抗體可以分析抗體抑制病毒抗原的合成和復(fù)制作用；針對腫瘤的抗體可以分析抗體的細(xì)胞抑制或細(xì)胞毒性作用。
, 百拇醫(yī)藥
細(xì)胞內(nèi)抗體：試驗(yàn)性應(yīng)用
阻斷腫瘤蛋白 ras-原癌基因p21ras是一膜相關(guān)蛋白質(zhì)，在細(xì)胞生長和分化過程中具有關(guān)鍵性功能。多種腫瘤的形成中ras-蛋白突變起著病因性作用。用微注射將ras-特異性、編碼sFv的mRNA注射入爪蟾卵子內(nèi)，幾乎可以完全阻斷ras依賴減數(shù)分裂卵子細(xì)胞的成熟。在結(jié)腸和胰腺癌細(xì)胞系，用腺病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)帶有ras-特異性細(xì)胞內(nèi)抗體片段基因信息，可以明顯降低細(xì)胞分裂。在小鼠皮下移植相應(yīng)的細(xì)胞系后，腫瘤內(nèi)直接注入重組腺病毒，可以使腫瘤生長降低。細(xì)胞內(nèi)抗體片段也可在細(xì)胞核內(nèi)發(fā)揮作用，乳腺癌細(xì)胞系細(xì)胞核內(nèi)過度表達(dá)細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白Cyclin-D，通過Cyclin-D特異性sFv可明顯改變細(xì)胞的顯性型，并且能提高對順鉑(Cisplatin)的化學(xué)敏感性。
下調(diào)生長因子-受體 生長因子-受體往往在惡性變細(xì)胞表面表達(dá)，細(xì)胞內(nèi)抗體片段可降低其表達(dá)。人類白介素-2-受體α亞單位(IL-2Rα)主要在某些T-細(xì)胞白血病過度表達(dá)。從產(chǎn)生IL-2Rα細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)制備出的細(xì)胞內(nèi)抗體片段，可以完全抑制IL-2Rα的表達(dá)，從而使細(xì)胞不能再接受白介素-2的刺激。用“上皮生長因子受體”(EGRR)穩(wěn)定轉(zhuǎn)導(dǎo)的纖維母細(xì)胞也可得到同樣的結(jié)果。在這細(xì)胞內(nèi)通過給予EGF，誘導(dǎo)EGFR磷基化，可被細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)針對EGFR的細(xì)胞內(nèi)抗體 sFv顯著降低。此外還可降低細(xì)胞的生長。用逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)EGFR-特異性sFv基因轉(zhuǎn)移入人類腫瘤細(xì)胞系，可導(dǎo)致細(xì)胞克隆形成明顯減少。
, 百拇醫(yī)藥
erbB-2跨膜蛋白是在腫瘤細(xì)胞表面過度表達(dá)的酪氨酸激酶受體，通過細(xì)胞內(nèi)抗體在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)可使erbB-2的表面表達(dá)明顯降低，導(dǎo)致生長停滯和細(xì)胞向非轉(zhuǎn)化顯性型逆轉(zhuǎn)。通過給予用帶有erbB-2-特異性細(xì)胞內(nèi)抗體基因信息的腺病毒，也可使腹腔內(nèi)接種人類erbB-2過度表達(dá)的卵巢癌小鼠的存活期得到顯著延長，誘導(dǎo)程序性死亡(Apoptose，凋亡)在腫瘤細(xì)胞具有重要意義。這一體內(nèi)實(shí)驗(yàn)的初步成果是進(jìn)一步臨床試驗(yàn)性治療方案的依據(jù)。
抗病毒治療 細(xì)胞內(nèi)抗體的許多基礎(chǔ)性研究工作涉及試驗(yàn)性抗病毒治療，特別是人類免疫缺陷性病毒(HIV)感染的治療。最初的治療策略是試驗(yàn)性干預(yù)病毒外膜蛋白gp160，gp160經(jīng)過蛋白水解成為gp120和gp41。gp120是跨膜錨錠蛋白，而gp41為膜表面蛋白，二者形成復(fù)合物gp160。gp120是病毒與宿主細(xì)胞CD4受體相互作用的病毒蛋白。表面帶有g(shù)p120的感染細(xì)胞能形成合胞體，此對于受累細(xì)胞的毀滅起重要作用。從產(chǎn)生HIV的細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中制備出的gp160特異性sFv，可降低gp160 的蛋白水解，從而可減少合胞體的形成及該細(xì)胞產(chǎn)生的病毒顆粒的感染性。
, 百拇醫(yī)藥
HIV-Tat-蛋白是細(xì)胞內(nèi)抗體干預(yù)非常適合的目標(biāo)，Tat在感染細(xì)胞胞漿內(nèi)合成，轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞核內(nèi)發(fā)揮作用。在細(xì)胞核內(nèi)能使HIV-1啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄功能增加百倍以上。Tat-特異性sFv在轉(zhuǎn)化的細(xì)胞漿內(nèi)，可阻斷報(bào)導(dǎo)基因的Tat-依賴性轉(zhuǎn)錄和Tat的白細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)。推測對于轉(zhuǎn)運(yùn)的抑制起著決定性作用。穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的淋巴細(xì)胞因?yàn)門at-特異性sFv的表達(dá)，對HIV感染出現(xiàn)耐受現(xiàn)象，逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)的Tat-特異性sFv-陽性淋巴細(xì)胞顯示對病毒的阻斷作用顯著強(qiáng)于gp160-特異性sFv。現(xiàn)在正在進(jìn)行Tat-特異性sFv 轉(zhuǎn)導(dǎo)自身CD4陽性淋巴細(xì)胞，再輸入給無癥狀病人的Ⅰ期臨床研究，研究細(xì)胞內(nèi)抗體的安全性和基因轉(zhuǎn)導(dǎo)抗體的效果。
作用于轉(zhuǎn)錄后的調(diào)節(jié)蛋白R(shí)ev也可用做細(xì)胞內(nèi)抗體的靶目標(biāo)。與Tat-蛋白相似，Rev-特異性sFv可使病毒蛋白停滯在細(xì)胞漿內(nèi)，并阻止它向細(xì)胞核內(nèi)轉(zhuǎn)移。通過轉(zhuǎn)導(dǎo)Rev-特異性sFv基因信息給T淋巴細(xì)胞或肺泡巨噬細(xì)胞，可以使這些細(xì)胞獲得保護(hù)，不受HIV感染的侵犯。試驗(yàn)證實(shí)對于病毒復(fù)制和形態(tài)形成起作用的病毒蛋白質(zhì)還有逆轉(zhuǎn)錄酶、整合酶、基質(zhì)蛋白p17以及核衣殼蛋白p7。
, 百拇醫(yī)藥
應(yīng)用細(xì)胞內(nèi)抗體片段治療其它病毒性感染現(xiàn)今也在積極地研究。針對乙型肝炎病毒(HBV)膜蛋白(HBsAg)的sFv可以降低轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞的HBsAg分泌5%～10%。并可在細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)檢出sFv-抗原復(fù)合物。針對HBV-聚合酶、核蛋白、丙型肝炎病毒(HCV)以及16型人類乳突瘤病毒E7腫瘤蛋白的sFv復(fù)合物作為抗病毒治療策略也在進(jìn)行評(píng)價(jià)中。
總結(jié)和展望
針對病毒或腫瘤的細(xì)胞內(nèi)抗體是高度特異性基因治療策略，其生物學(xué)基礎(chǔ)研究日益增多，可以通過細(xì)胞內(nèi)抗體影響酶功能、蛋白質(zhì)的相互作用和定位。目前僅是對細(xì)胞內(nèi)抗體的初步臨床研究，常規(guī)應(yīng)用基因治療還有許多問題待解決，除轉(zhuǎn)基因的療效外，還有其間期、強(qiáng)度和免疫原性等問題。細(xì)胞內(nèi)抗體在臨床常規(guī)應(yīng)用尚有待時(shí)日。, 百拇醫(yī)藥
單位：同濟(jì)醫(yī)科大學(xué)附屬同濟(jì)醫(yī)院
關(guān)鍵詞：
德國醫(yī)學(xué)000212Intrazelluläre Antikörper: Ein neues Therapiekonzept
gegen Virusinfektionen und Tumorerkrankungen
Hubert E.Blum
抗體(免疫球蛋白)是免疫系統(tǒng)的重要組成部分，長久以來由于它的特異性和高親和力被應(yīng)用于分離和純化靶抗原。近年研究指出，抗體還能在細(xì)胞內(nèi)結(jié)合其相應(yīng)抗原，在細(xì)胞內(nèi)以特殊的方式干擾重要的生物過程。因此，細(xì)胞內(nèi)抗體在理論上可能是針對病毒感染和腫瘤疾病的特異性治療方法。
, http://www.www.srpcoatings.com
抗體：結(jié)構(gòu)和功能
免疫球蛋白是B淋巴細(xì)胞形成的糖蛋白，是各種哺乳動(dòng)物體液免疫應(yīng)答的主要成分，能與誘導(dǎo)抗體形成的抗原特異性結(jié)合。各種抗體均由兩相同的“輕鏈”和相同的“重鏈”構(gòu)成，可被不同的蛋白酶裂解。木瓜蛋白酶(papain)蛋白酶水解獲得的Fab段由抗體的輕鏈以及重鏈的可變區(qū)(VH)和第一穩(wěn)定區(qū)(CH1)組成。合成的單鏈-FV-片段(sFv)僅是重鏈可變區(qū)(VH)和輕鏈可變區(qū)(VL)通過一短肽結(jié)合序列共價(jià)相連接而成。
抗體和其片段在醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)研究和疾病的診斷及治療中有極重要的意義。Khler 和Milstein 1975年報(bào)道從雜交瘤(漿細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞的雜交瘤)制備特異性單克隆抗體是制備高特異性抗體制劑的關(guān)鍵步驟。
細(xì)胞內(nèi)抗體：原理
, http://www.www.srpcoatings.com
現(xiàn)在可以用基因技術(shù)方法分離和鑒定編碼抗體分子多肽鏈的DNA序列。從雜交瘤細(xì)胞系分離細(xì)胞RNA后，首先用逆轉(zhuǎn)錄酶轉(zhuǎn)錄成cDNA，接著再用特異性寡脫氧核苷酸聚合酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增免疫球蛋白-cDNA(所謂RT-PCR)。所得到的PCR-產(chǎn)物直接作序列分析，鑒定可用基因技術(shù)制備某種抗體的基因。從骨髓瘤細(xì)胞、猴腎細(xì)胞(CHS)以及細(xì)菌、酵母、昆蟲細(xì)胞和植物中能成功地生產(chǎn)出單克隆抗體，說明許多來自微生物和細(xì)胞系統(tǒng)能合成有功能的免疫球蛋白分子，提示多種細(xì)胞類型可以制備出結(jié)構(gòu)正確有皺疊的抗體，為細(xì)胞內(nèi)抗體的廣泛應(yīng)用提供了先決條件。
正常情況抗體被細(xì)胞分泌到血清中或者細(xì)胞培養(yǎng)基中，很易純化。對抗體分泌具有重要意義的是長約20個(gè)氨基酸短肽序列(所謂信號(hào)系列)，它提供免疫球蛋白鏈的遺傳信息，介導(dǎo)合成蛋白細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)。在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的氧化環(huán)境內(nèi)，抗體重鏈和輕鏈相互結(jié)合成為異二聚體(Heterodimeren)。接著通過高爾基器分泌出矯正過有皺疊的抗體分子�？贵w的Fab-段或sFv-段在細(xì)胞內(nèi)應(yīng)用有其優(yōu)越性，F(xiàn)ab-段是二硫鍵結(jié)合的二蛋白鏈，在細(xì)胞漿的還原環(huán)境中構(gòu)成效率甚低。因此，F(xiàn)ab-段主要要求應(yīng)用于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。而非自然形成sFv-段最適宜細(xì)胞內(nèi)應(yīng)用，它的功能并不要求單個(gè)肽鏈間的二硫鍵結(jié)合。
, http://www.www.srpcoatings.com
用抗體修飾細(xì)胞內(nèi)某種蛋白質(zhì)的功能，首先需要確定出能結(jié)合這種蛋白質(zhì)的單克隆抗體，再用RT-PCR從雜交瘤細(xì)胞系分離、鑒定出這種抗體免疫球蛋白重鏈和輕鏈可變區(qū)的編碼序列。此外，也可以通過“噬菌體展現(xiàn)”(“phage-display”)步驟選擇恰當(dāng)?shù)目贵w片段和分離相應(yīng)的遺傳信息。含有編碼免疫球蛋白重鏈和輕鏈可變區(qū)序列的分離物可借助PCR技術(shù)，用一編碼短結(jié)合肽DNA序列相連接，構(gòu)成sFv片段。將最終的DNA匣(DNA-Kassette)插入DNA-載體，即可在靶細(xì)胞表達(dá)出抗體片段。因?yàn)檎＝閷?dǎo)抗體分泌的信號(hào)序列未與表達(dá)載體整合，新合成的抗體分子在胞漿內(nèi)，與其靶抗原蛋白相整合。通過引入細(xì)胞內(nèi)蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)到一定細(xì)胞部位的短肽序列信息，可以指導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)實(shí)驗(yàn)抗體片段，進(jìn)入根據(jù)需要與靶分子相互作用的部位，例如細(xì)胞核或者線粒體。如果仍然保留信號(hào)序列，抗體將被轉(zhuǎn)運(yùn)到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)按需要通過特異性肽滯留信號(hào)可抑制細(xì)胞繼續(xù)分泌。最后還可以分析抗體與靶抗原相互作用的效果，針對病毒感染作用的抗體可以分析抗體抑制病毒抗原的合成和復(fù)制作用；針對腫瘤的抗體可以分析抗體的細(xì)胞抑制或細(xì)胞毒性作用。
, 百拇醫(yī)藥
細(xì)胞內(nèi)抗體：試驗(yàn)性應(yīng)用
阻斷腫瘤蛋白 ras-原癌基因p21ras是一膜相關(guān)蛋白質(zhì)，在細(xì)胞生長和分化過程中具有關(guān)鍵性功能。多種腫瘤的形成中ras-蛋白突變起著病因性作用。用微注射將ras-特異性、編碼sFv的mRNA注射入爪蟾卵子內(nèi)，幾乎可以完全阻斷ras依賴減數(shù)分裂卵子細(xì)胞的成熟。在結(jié)腸和胰腺癌細(xì)胞系，用腺病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)帶有ras-特異性細(xì)胞內(nèi)抗體片段基因信息，可以明顯降低細(xì)胞分裂。在小鼠皮下移植相應(yīng)的細(xì)胞系后，腫瘤內(nèi)直接注入重組腺病毒，可以使腫瘤生長降低。細(xì)胞內(nèi)抗體片段也可在細(xì)胞核內(nèi)發(fā)揮作用，乳腺癌細(xì)胞系細(xì)胞核內(nèi)過度表達(dá)細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白Cyclin-D，通過Cyclin-D特異性sFv可明顯改變細(xì)胞的顯性型，并且能提高對順鉑(Cisplatin)的化學(xué)敏感性。
下調(diào)生長因子-受體 生長因子-受體往往在惡性變細(xì)胞表面表達(dá)，細(xì)胞內(nèi)抗體片段可降低其表達(dá)。人類白介素-2-受體α亞單位(IL-2Rα)主要在某些T-細(xì)胞白血病過度表達(dá)。從產(chǎn)生IL-2Rα細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)制備出的細(xì)胞內(nèi)抗體片段，可以完全抑制IL-2Rα的表達(dá)，從而使細(xì)胞不能再接受白介素-2的刺激。用“上皮生長因子受體”(EGRR)穩(wěn)定轉(zhuǎn)導(dǎo)的纖維母細(xì)胞也可得到同樣的結(jié)果。在這細(xì)胞內(nèi)通過給予EGF，誘導(dǎo)EGFR磷基化，可被細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)針對EGFR的細(xì)胞內(nèi)抗體 sFv顯著降低。此外還可降低細(xì)胞的生長。用逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)EGFR-特異性sFv基因轉(zhuǎn)移入人類腫瘤細(xì)胞系，可導(dǎo)致細(xì)胞克隆形成明顯減少。
, 百拇醫(yī)藥
erbB-2跨膜蛋白是在腫瘤細(xì)胞表面過度表達(dá)的酪氨酸激酶受體，通過細(xì)胞內(nèi)抗體在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)可使erbB-2的表面表達(dá)明顯降低，導(dǎo)致生長停滯和細(xì)胞向非轉(zhuǎn)化顯性型逆轉(zhuǎn)。通過給予用帶有erbB-2-特異性細(xì)胞內(nèi)抗體基因信息的腺病毒，也可使腹腔內(nèi)接種人類erbB-2過度表達(dá)的卵巢癌小鼠的存活期得到顯著延長，誘導(dǎo)程序性死亡(Apoptose，凋亡)在腫瘤細(xì)胞具有重要意義。這一體內(nèi)實(shí)驗(yàn)的初步成果是進(jìn)一步臨床試驗(yàn)性治療方案的依據(jù)。
抗病毒治療 細(xì)胞內(nèi)抗體的許多基礎(chǔ)性研究工作涉及試驗(yàn)性抗病毒治療，特別是人類免疫缺陷性病毒(HIV)感染的治療。最初的治療策略是試驗(yàn)性干預(yù)病毒外膜蛋白gp160，gp160經(jīng)過蛋白水解成為gp120和gp41。gp120是跨膜錨錠蛋白，而gp41為膜表面蛋白，二者形成復(fù)合物gp160。gp120是病毒與宿主細(xì)胞CD4受體相互作用的病毒蛋白。表面帶有g(shù)p120的感染細(xì)胞能形成合胞體，此對于受累細(xì)胞的毀滅起重要作用。從產(chǎn)生HIV的細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中制備出的gp160特異性sFv，可降低gp160 的蛋白水解，從而可減少合胞體的形成及該細(xì)胞產(chǎn)生的病毒顆粒的感染性。
, 百拇醫(yī)藥
HIV-Tat-蛋白是細(xì)胞內(nèi)抗體干預(yù)非常適合的目標(biāo)，Tat在感染細(xì)胞胞漿內(nèi)合成，轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞核內(nèi)發(fā)揮作用。在細(xì)胞核內(nèi)能使HIV-1啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄功能增加百倍以上。Tat-特異性sFv在轉(zhuǎn)化的細(xì)胞漿內(nèi)，可阻斷報(bào)導(dǎo)基因的Tat-依賴性轉(zhuǎn)錄和Tat的白細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)。推測對于轉(zhuǎn)運(yùn)的抑制起著決定性作用。穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的淋巴細(xì)胞因?yàn)門at-特異性sFv的表達(dá)，對HIV感染出現(xiàn)耐受現(xiàn)象，逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)的Tat-特異性sFv-陽性淋巴細(xì)胞顯示對病毒的阻斷作用顯著強(qiáng)于gp160-特異性sFv。現(xiàn)在正在進(jìn)行Tat-特異性sFv 轉(zhuǎn)導(dǎo)自身CD4陽性淋巴細(xì)胞，再輸入給無癥狀病人的Ⅰ期臨床研究，研究細(xì)胞內(nèi)抗體的安全性和基因轉(zhuǎn)導(dǎo)抗體的效果。
作用于轉(zhuǎn)錄后的調(diào)節(jié)蛋白R(shí)ev也可用做細(xì)胞內(nèi)抗體的靶目標(biāo)。與Tat-蛋白相似，Rev-特異性sFv可使病毒蛋白停滯在細(xì)胞漿內(nèi)，并阻止它向細(xì)胞核內(nèi)轉(zhuǎn)移。通過轉(zhuǎn)導(dǎo)Rev-特異性sFv基因信息給T淋巴細(xì)胞或肺泡巨噬細(xì)胞，可以使這些細(xì)胞獲得保護(hù)，不受HIV感染的侵犯。試驗(yàn)證實(shí)對于病毒復(fù)制和形態(tài)形成起作用的病毒蛋白質(zhì)還有逆轉(zhuǎn)錄酶、整合酶、基質(zhì)蛋白p17以及核衣殼蛋白p7。
, 百拇醫(yī)藥
應(yīng)用細(xì)胞內(nèi)抗體片段治療其它病毒性感染現(xiàn)今也在積極地研究。針對乙型肝炎病毒(HBV)膜蛋白(HBsAg)的sFv可以降低轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞的HBsAg分泌5%～10%。并可在細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)檢出sFv-抗原復(fù)合物。針對HBV-聚合酶、核蛋白、丙型肝炎病毒(HCV)以及16型人類乳突瘤病毒E7腫瘤蛋白的sFv復(fù)合物作為抗病毒治療策略也在進(jìn)行評(píng)價(jià)中。
總結(jié)和展望
針對病毒或腫瘤的細(xì)胞內(nèi)抗體是高度特異性基因治療策略，其生物學(xué)基礎(chǔ)研究日益增多，可以通過細(xì)胞內(nèi)抗體影響酶功能、蛋白質(zhì)的相互作用和定位。目前僅是對細(xì)胞內(nèi)抗體的初步臨床研究，常規(guī)應(yīng)用基因治療還有許多問題待解決，除轉(zhuǎn)基因的療效外，還有其間期、強(qiáng)度和免疫原性等問題。細(xì)胞內(nèi)抗體在臨床常規(guī)應(yīng)用尚有待時(shí)日。, 百拇醫(yī)藥