視網(wǎng)膜感光細(xì)胞純化方法的研究
作者：羅燕 唐仕波 林少芬 楊斌 鄭湖玲
單位：510060 廣州，中山醫(yī)科大學(xué)中山眼科中心
關(guān)鍵詞：純感光細(xì)胞；準(zhǔn)分子激光；酶消化；視網(wǎng)膜移植
眼科研究000303 摘要 目的探討改進(jìn)獲取視網(wǎng)膜純感光細(xì)胞的方法。方法應(yīng)用改良的準(zhǔn)分子激光切削法和酶分層消化法來分離純化視網(wǎng)膜感光細(xì)胞層。結(jié)果由兩種方法獲取的視網(wǎng)膜組織片經(jīng)蘇木素-伊紅染色均證實(shí)為單一的純感光細(xì)胞層并保持生物活性。結(jié)論改良的準(zhǔn)分子激光切削法和酶分層消化法均能獲取視網(wǎng)膜純感光細(xì)胞，且對(duì)細(xì)胞損傷小，內(nèi)外節(jié)段保持完好，可為視網(wǎng)膜的移植創(chuàng)造條件。
分類號(hào) R774
A study on the purification of retinal photoreceptors
, 百拇醫(yī)藥
Luo Yan，Tang Shibo，Lin Shaofen
(Zhongshan Ophthalmic Center，Sun Yat-sen University of Medical
Sciences，Guangzhou 510060)
Abstract：Objective：To investigate methods for isolation of the pure retinal photoreceptors.MethodsModified excimer laser surgery，regular excimer laser surgery， and enzyme gradation digestion were used to isolate retinal photoreceptors.The resulting retinal tissues were stained with hematoxylin-eosin(HE).Results：The retinal sheets obtained by these three methods each demonstrated a layer of pure photoreceptors by HE staining.Modified and regular excimer laser surgery could both precisely ablate retina.Modified excimer laser ablation obtained photoreceptor sheets with perfect inner and outer segment，while regular excimer laser ablation got photoreceptor sheets with impaired inner and outer segment.Enzyme gradation digestion could also result in photoreceptor sheets with good inner and outer segments，although there was non-precise digestion.Conclusion：Modified excimer laser surgery and enzyme gradation digestion can be used to obtain a layer of pure photoreceptors with good tissue preservation；specially perfect inner and outer segment.These cells may be a source for retinal transplantation.
, 百拇醫(yī)藥
Key words pure photoreceptors laser surgery enzyme digestion retinal transplantation
近10年來，視網(wǎng)膜移植的研究已取得了長(zhǎng)足的進(jìn)步，其中研究較多的是色素上皮細(xì)胞和感光細(xì)胞的移植。對(duì)感光細(xì)胞變性的眼病，移植純的感光細(xì)胞則更有針對(duì)性，且更能正確對(duì)位移植，避免玫瑰花結(jié)構(gòu)的形成。但是目前分離純化和鑒定視網(wǎng)膜感光細(xì)胞仍存在一定的困難，獲取視網(wǎng)膜純感光細(xì)胞的方法主要有兩種：組織細(xì)胞震動(dòng)切削機(jī)切削法和準(zhǔn)分子激光切削法。本研究比較了不同眼球來源的感光細(xì)胞的取材并改良了獲取視網(wǎng)膜純感光細(xì)胞的方法，結(jié)果報(bào)告如下。
1 材料與方法
1.1 材料來源
材料來源包括角膜移植后的成人眼球、治療性引產(chǎn)的8～9個(gè)月胚胎人眼、屠宰場(chǎng)提供的豬眼、新西蘭兔眼、成年SD大鼠眼，以上均在死后24h以內(nèi)取材。
, 百拇醫(yī)藥
1.2 視網(wǎng)膜取材
在角鞏緣后4mm處平行角膜緣環(huán)行剪開眼球，去除眼前節(jié)部分，用鑷子將玻璃體剝除，鈍性分離視網(wǎng)膜神經(jīng)上皮層和色素上皮層，在視乳頭處剪斷，游離出完整的視網(wǎng)膜神經(jīng)上皮層，置于D-Hank’s液中漂洗干凈其上的色素及色素上皮細(xì)胞，按象限四分視網(wǎng)膜神經(jīng)上皮層(SD大鼠的視網(wǎng)膜除外)。
1.3 感光細(xì)胞的分離和純化
1.3.1 改良的準(zhǔn)分子激光切削法：經(jīng)過摸索，我們改進(jìn)了準(zhǔn)分子激光切削視網(wǎng)膜的過程，將人、兔、豬和鼠眼的視網(wǎng)膜神經(jīng)上皮層的感光細(xì)胞層朝下平鋪在35mm的塑料培養(yǎng)皿上，吸凈培養(yǎng)皿中和視網(wǎng)膜表面的D-Hank’s液。選用波長(zhǎng)為193nm的準(zhǔn)分子激光儀(Keracor217型，美國(guó)CHIRON公司)。將瞄準(zhǔn)指示光聚焦于所要切削的視網(wǎng)膜處，選調(diào)其工作參數(shù)：能量密度120mJ/cm2，頻率50Hz，激光發(fā)射采用光性治療性角膜切削術(shù)(phototherapeutic keratectomy，PTK)模式，切削直徑3mm，切削深度在視網(wǎng)膜后極部為63～65μm。為了對(duì)比，我們同時(shí)參照國(guó)內(nèi)外一些學(xué)者的方法[1，2]，即將視網(wǎng)膜平鋪在20%的明膠托上，滴5%的明膠液(35℃)于明膠托上使視網(wǎng)膜漂浮起來，然后在5%的明膠重新凝固前迅速將其吸出，靜置5min使視網(wǎng)膜牢固粘貼于20%的明膠托上，再用準(zhǔn)分子激光作同樣的切削。
, 百拇醫(yī)藥
1.3.2 酶分層消化法：即將視網(wǎng)膜神經(jīng)上皮的內(nèi)層用酶學(xué)方法消化去除，剩下純的感光細(xì)胞層。將備用的人、兔、豬眼的視網(wǎng)膜感光細(xì)胞層朝上平鋪在1mm×1mm孔徑的不銹鋼篩網(wǎng)上后，再放在玻璃培養(yǎng)皿中，靠近篩網(wǎng)加入含2.5%胰酶、0.4%EDTA和0.2%膠原酶的消化液剛好至篩網(wǎng)表面，利用篩網(wǎng)的蔓延作用使消化液全面接觸朝下的視網(wǎng)膜內(nèi)層，于37℃孵育約1h(胚眼組織則為45min)，其間在篩網(wǎng)下用消化液輕輕吹打視網(wǎng)膜內(nèi)層3次，最后用含10%的胎牛血清的培養(yǎng)液終止酶的消化作用，并在篩網(wǎng)下面輕柔反復(fù)地吹打已消化松脫的視網(wǎng)膜神經(jīng)上皮層的內(nèi)層組織，收取篩網(wǎng)上的純視網(wǎng)膜感光細(xì)胞層。
1.4 HE標(biāo)本制作
小心仔細(xì)地將上述方法所得的菲薄的視網(wǎng)膜組織片(有明膠固定的組織片連同明膠一起)置于10%的中性緩沖福爾馬林液固定、系列梯度酒精脫水、石蠟包埋、切片、蘇木素-伊紅染色(hematoxylin-eosin，HE)、光鏡下觀察。
, 百拇醫(yī)藥
2 結(jié)果
由改良的準(zhǔn)分子激光切削法和酶分層消化法獲取的視網(wǎng)膜組織片經(jīng)蘇木素-伊紅染色，并與正常的視網(wǎng)膜標(biāo)本進(jìn)行對(duì)照，結(jié)果均顯示為單一的純感光細(xì)胞層并具有內(nèi)外節(jié)段，可用于視網(wǎng)膜純感光細(xì)胞移植研究中。改良的準(zhǔn)分子激光切削法能精確地切削去除視網(wǎng)膜內(nèi)8層結(jié)構(gòu)，只剩下完整的外核層即感光細(xì)胞胞核所在(圖1)，且錐桿細(xì)胞的內(nèi)外節(jié)段保持良好(箭頭所示)。本研究發(fā)現(xiàn)人、兔、豬和鼠眼材料來源的視網(wǎng)膜所用的激光切削參數(shù)都相同，視網(wǎng)膜后極部血管分布區(qū)的切削深度為63～65μm，這與Dowling[3]報(bào)道的大多數(shù)脊椎動(dòng)物視網(wǎng)膜的結(jié)構(gòu)和厚度都基本一致的理論相符，切削參數(shù)的確定也極大方便日后進(jìn)行多種種屬視網(wǎng)膜感光細(xì)胞移植供體的取材。酶分層消化法雖不能精確地將視網(wǎng)膜消化至只剩完整的外核層，但也可得數(shù)量較多的感光細(xì)胞(圖2)，也仍具較好的內(nèi)外節(jié)段(箭頭所示)。各種材料來源的視網(wǎng)膜所用酶的濃度和作用時(shí)間也都相同，但胚眼組織消化時(shí)間則可短些，因?yàn)榕咛ソM織細(xì)胞間的連接較成年組織的疏松。而所用明膠粘貼固定的視網(wǎng)膜經(jīng)激光切削后同樣可獲得純感光細(xì)胞層(圖3)，但其內(nèi)外節(jié)段因接觸粘附在明膠中，已模糊不清，無法辨認(rèn)，明顯受損(箭頭所示)。(圖1～3見237頁(yè))
, 百拇醫(yī)藥
3 討論
分離出足夠數(shù)量和純的感光細(xì)胞以替代患眼功能不全或已遭破壞的感光細(xì)胞是視網(wǎng)膜感光細(xì)胞移植最關(guān)鍵的第一步。為使移植細(xì)胞能更好發(fā)育和存活，分離時(shí)應(yīng)盡可能減少對(duì)細(xì)胞的損傷。早在1988年Townes-Anderson等[4]就用酶分離的方法獲得兔視網(wǎng)膜的視桿細(xì)胞，但此法所得的是視網(wǎng)膜多種細(xì)胞的混懸液，且也破壞了感光細(xì)胞層的正常組織結(jié)構(gòu)和細(xì)胞極性，感光細(xì)胞活性差。
最近國(guó)內(nèi)外已有用準(zhǔn)分子激光更精確地切削視網(wǎng)膜，獲得成片純感光細(xì)胞的報(bào)道[1，2]，但他們都是用明膠作為包埋粘貼劑，移植時(shí)連同明膠一起移植到視網(wǎng)膜下腔，這樣獲取的感光細(xì)胞，從本文結(jié)果看內(nèi)外節(jié)段大多受損，而且妨礙了感光細(xì)胞和色素上皮細(xì)胞的盡快接觸，不利于感光細(xì)胞移植后的存活和功能恢復(fù)。
另外，還有人采用組織細(xì)胞震動(dòng)切削機(jī)切削法從視網(wǎng)膜上獲取純感光細(xì)胞層[5～7]。同樣利用兩種不同濃度的明膠來包埋粘貼固定待切削的外核層朝下的視網(wǎng)膜片，再用組織細(xì)胞震動(dòng)切削機(jī)以20～60μm的厚度切削視網(wǎng)膜，直至切下的組織用美藍(lán)染色后在顯微鏡下檢查證實(shí)剛達(dá)感光細(xì)胞層為止。此法除存在與常規(guī)準(zhǔn)分子激光切削用明膠作為包埋粘貼劑的缺點(diǎn)外，其操作繁瑣、耗時(shí)，且震蕩切削力對(duì)感光細(xì)胞也可能造成較嚴(yán)重的損傷[8]。
, 百拇醫(yī)藥
本研究中我們利用視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)層次分明的特點(diǎn)和不銹鋼篩網(wǎng)為視網(wǎng)膜薄片的支架，經(jīng)反復(fù)摸索酶的濃度和作用時(shí)間，首次提出了酶分層消化法可獲得純視網(wǎng)膜感光細(xì)胞。這種方法操作時(shí)間較長(zhǎng)，但對(duì)儀器設(shè)備要求不高，費(fèi)用低，在不具備準(zhǔn)分子激光儀的條件下值得推廣應(yīng)用。我們改良的準(zhǔn)分子激光切削法省略了明膠粘貼固定的復(fù)雜程序，并避免了明膠粘固對(duì)內(nèi)外節(jié)段的破壞，所得的視網(wǎng)膜感光細(xì)胞層植片具有完好的內(nèi)外節(jié)段，且沒有明膠粘附，植入到視網(wǎng)膜下腔后，可立即與色素上皮細(xì)胞正常接觸，便于移植感光細(xì)胞功能的恢復(fù)與發(fā)揮。改良的準(zhǔn)分子激光切削法在簡(jiǎn)化操作步驟、縮短操作時(shí)間及減少細(xì)胞的破壞等方面較常規(guī)的準(zhǔn)分子激光切削法有顯著的改善。
本研究?jī)煞N方法所獲得的視網(wǎng)膜感光細(xì)胞的內(nèi)外節(jié)段仍存在，提示其所受損傷較小，為視網(wǎng)膜的移植創(chuàng)造了條件，至于其進(jìn)一步的功能狀況及生物學(xué)活性，我們目前正在研究中。
, 百拇醫(yī)藥
圖1 改良的準(zhǔn)分子激光切削法獲取的感光細(xì)胞組織片，箭頭示完好的內(nèi)外節(jié)段(HE×400) 圖2 酶分層消化法獲取的感光細(xì)胞組織片，箭頭示較好的外節(jié)段(HE×400) 圖3 常規(guī)明膠粘固的視網(wǎng)膜經(jīng)激光切削后的感光細(xì)胞組織片，箭頭示受損的外節(jié)段(HE×400) Fig.1 Photoreceptor sheets ablated by modified excimer laser
surgery arrows indicate photoreceptors with perfect inner and outer segment(HE×400) Fig.2 Photoreceptor sheets obtained by enzyme gradation digestion
arrows indicate photoreceptors with good inner and outer segment(HE×400) Fig.3 Photoreceptor sheets ablated by regular excimer laser
, 百拇醫(yī)藥
surgery arrows indicate photoreceptors with impaired inner and outer segment(HE×400)
本課題獲國(guó)家自然科學(xué)基金基金編號(hào)：39770790及廣東省自然科學(xué)基金基金編號(hào)：950329資助
1，馬美云，王薇，陳越國(guó)，等.準(zhǔn)分子激光切削視網(wǎng)膜板層移植術(shù).中華眼底病雜志，1998，14(4)∶209
2，Huang JC，Ishida M，Hersh P，et al.Preparation and transplantation of photoreceptor sheets.Curr Eye Res，1998，17(6)∶573
3，Dowling JE，著.吳淼鑫，楊雄里，譯.視網(wǎng)膜.上海：上海醫(yī)科大學(xué)出版社，1989.8-14
, http://www.www.srpcoatings.com
4，Townes-Anderson E，Dacheux RF，Raviola E.Rod photoreceptors dissociated from the adult rabbit retina.J Neurosci，1988，8(1)∶320
5，Silverman MS，Hughes SE.Transplantation of retinal photo-receptors to light-damaged retina.Invest Ophthalmmol Vis Sci，1989，30∶1684
6，姜德詠，高玲.視網(wǎng)膜移植抗原性的初步研究.中華眼底病雜志，1997，13(4)∶234
7，Kaplan HJ，Tezel TH，Berger AS，et al.Human photoreceptor transplantation in retinitis pigmentosa.Arch Ophthalmol，1997，115∶1168
8，Tezel TH，Kaplan HJ.Harvest and storage of adult human photoreceptor cells：the vibratome compared to the excimer laser.Curr Eye Res，1998，17(7)∶748
(收稿：1999-12-21), 百拇醫(yī)藥
單位：510060 廣州，中山醫(yī)科大學(xué)中山眼科中心
關(guān)鍵詞：純感光細(xì)胞；準(zhǔn)分子激光；酶消化；視網(wǎng)膜移植
眼科研究000303 摘要 目的探討改進(jìn)獲取視網(wǎng)膜純感光細(xì)胞的方法。方法應(yīng)用改良的準(zhǔn)分子激光切削法和酶分層消化法來分離純化視網(wǎng)膜感光細(xì)胞層。結(jié)果由兩種方法獲取的視網(wǎng)膜組織片經(jīng)蘇木素-伊紅染色均證實(shí)為單一的純感光細(xì)胞層并保持生物活性。結(jié)論改良的準(zhǔn)分子激光切削法和酶分層消化法均能獲取視網(wǎng)膜純感光細(xì)胞，且對(duì)細(xì)胞損傷小，內(nèi)外節(jié)段保持完好，可為視網(wǎng)膜的移植創(chuàng)造條件。
分類號(hào) R774
A study on the purification of retinal photoreceptors
, 百拇醫(yī)藥
Luo Yan，Tang Shibo，Lin Shaofen
(Zhongshan Ophthalmic Center，Sun Yat-sen University of Medical
Sciences，Guangzhou 510060)
Abstract：Objective：To investigate methods for isolation of the pure retinal photoreceptors.MethodsModified excimer laser surgery，regular excimer laser surgery， and enzyme gradation digestion were used to isolate retinal photoreceptors.The resulting retinal tissues were stained with hematoxylin-eosin(HE).Results：The retinal sheets obtained by these three methods each demonstrated a layer of pure photoreceptors by HE staining.Modified and regular excimer laser surgery could both precisely ablate retina.Modified excimer laser ablation obtained photoreceptor sheets with perfect inner and outer segment，while regular excimer laser ablation got photoreceptor sheets with impaired inner and outer segment.Enzyme gradation digestion could also result in photoreceptor sheets with good inner and outer segments，although there was non-precise digestion.Conclusion：Modified excimer laser surgery and enzyme gradation digestion can be used to obtain a layer of pure photoreceptors with good tissue preservation；specially perfect inner and outer segment.These cells may be a source for retinal transplantation.
, 百拇醫(yī)藥
Key words pure photoreceptors laser surgery enzyme digestion retinal transplantation
近10年來，視網(wǎng)膜移植的研究已取得了長(zhǎng)足的進(jìn)步，其中研究較多的是色素上皮細(xì)胞和感光細(xì)胞的移植。對(duì)感光細(xì)胞變性的眼病，移植純的感光細(xì)胞則更有針對(duì)性，且更能正確對(duì)位移植，避免玫瑰花結(jié)構(gòu)的形成。但是目前分離純化和鑒定視網(wǎng)膜感光細(xì)胞仍存在一定的困難，獲取視網(wǎng)膜純感光細(xì)胞的方法主要有兩種：組織細(xì)胞震動(dòng)切削機(jī)切削法和準(zhǔn)分子激光切削法。本研究比較了不同眼球來源的感光細(xì)胞的取材并改良了獲取視網(wǎng)膜純感光細(xì)胞的方法，結(jié)果報(bào)告如下。
1 材料與方法
1.1 材料來源
材料來源包括角膜移植后的成人眼球、治療性引產(chǎn)的8～9個(gè)月胚胎人眼、屠宰場(chǎng)提供的豬眼、新西蘭兔眼、成年SD大鼠眼，以上均在死后24h以內(nèi)取材。
, 百拇醫(yī)藥
1.2 視網(wǎng)膜取材
在角鞏緣后4mm處平行角膜緣環(huán)行剪開眼球，去除眼前節(jié)部分，用鑷子將玻璃體剝除，鈍性分離視網(wǎng)膜神經(jīng)上皮層和色素上皮層，在視乳頭處剪斷，游離出完整的視網(wǎng)膜神經(jīng)上皮層，置于D-Hank’s液中漂洗干凈其上的色素及色素上皮細(xì)胞，按象限四分視網(wǎng)膜神經(jīng)上皮層(SD大鼠的視網(wǎng)膜除外)。
1.3 感光細(xì)胞的分離和純化
1.3.1 改良的準(zhǔn)分子激光切削法：經(jīng)過摸索，我們改進(jìn)了準(zhǔn)分子激光切削視網(wǎng)膜的過程，將人、兔、豬和鼠眼的視網(wǎng)膜神經(jīng)上皮層的感光細(xì)胞層朝下平鋪在35mm的塑料培養(yǎng)皿上，吸凈培養(yǎng)皿中和視網(wǎng)膜表面的D-Hank’s液。選用波長(zhǎng)為193nm的準(zhǔn)分子激光儀(Keracor217型，美國(guó)CHIRON公司)。將瞄準(zhǔn)指示光聚焦于所要切削的視網(wǎng)膜處，選調(diào)其工作參數(shù)：能量密度120mJ/cm2，頻率50Hz，激光發(fā)射采用光性治療性角膜切削術(shù)(phototherapeutic keratectomy，PTK)模式，切削直徑3mm，切削深度在視網(wǎng)膜后極部為63～65μm。為了對(duì)比，我們同時(shí)參照國(guó)內(nèi)外一些學(xué)者的方法[1，2]，即將視網(wǎng)膜平鋪在20%的明膠托上，滴5%的明膠液(35℃)于明膠托上使視網(wǎng)膜漂浮起來，然后在5%的明膠重新凝固前迅速將其吸出，靜置5min使視網(wǎng)膜牢固粘貼于20%的明膠托上，再用準(zhǔn)分子激光作同樣的切削。
, 百拇醫(yī)藥
1.3.2 酶分層消化法：即將視網(wǎng)膜神經(jīng)上皮的內(nèi)層用酶學(xué)方法消化去除，剩下純的感光細(xì)胞層。將備用的人、兔、豬眼的視網(wǎng)膜感光細(xì)胞層朝上平鋪在1mm×1mm孔徑的不銹鋼篩網(wǎng)上后，再放在玻璃培養(yǎng)皿中，靠近篩網(wǎng)加入含2.5%胰酶、0.4%EDTA和0.2%膠原酶的消化液剛好至篩網(wǎng)表面，利用篩網(wǎng)的蔓延作用使消化液全面接觸朝下的視網(wǎng)膜內(nèi)層，于37℃孵育約1h(胚眼組織則為45min)，其間在篩網(wǎng)下用消化液輕輕吹打視網(wǎng)膜內(nèi)層3次，最后用含10%的胎牛血清的培養(yǎng)液終止酶的消化作用，并在篩網(wǎng)下面輕柔反復(fù)地吹打已消化松脫的視網(wǎng)膜神經(jīng)上皮層的內(nèi)層組織，收取篩網(wǎng)上的純視網(wǎng)膜感光細(xì)胞層。
1.4 HE標(biāo)本制作
小心仔細(xì)地將上述方法所得的菲薄的視網(wǎng)膜組織片(有明膠固定的組織片連同明膠一起)置于10%的中性緩沖福爾馬林液固定、系列梯度酒精脫水、石蠟包埋、切片、蘇木素-伊紅染色(hematoxylin-eosin，HE)、光鏡下觀察。
, 百拇醫(yī)藥
2 結(jié)果
由改良的準(zhǔn)分子激光切削法和酶分層消化法獲取的視網(wǎng)膜組織片經(jīng)蘇木素-伊紅染色，并與正常的視網(wǎng)膜標(biāo)本進(jìn)行對(duì)照，結(jié)果均顯示為單一的純感光細(xì)胞層并具有內(nèi)外節(jié)段，可用于視網(wǎng)膜純感光細(xì)胞移植研究中。改良的準(zhǔn)分子激光切削法能精確地切削去除視網(wǎng)膜內(nèi)8層結(jié)構(gòu)，只剩下完整的外核層即感光細(xì)胞胞核所在(圖1)，且錐桿細(xì)胞的內(nèi)外節(jié)段保持良好(箭頭所示)。本研究發(fā)現(xiàn)人、兔、豬和鼠眼材料來源的視網(wǎng)膜所用的激光切削參數(shù)都相同，視網(wǎng)膜后極部血管分布區(qū)的切削深度為63～65μm，這與Dowling[3]報(bào)道的大多數(shù)脊椎動(dòng)物視網(wǎng)膜的結(jié)構(gòu)和厚度都基本一致的理論相符，切削參數(shù)的確定也極大方便日后進(jìn)行多種種屬視網(wǎng)膜感光細(xì)胞移植供體的取材。酶分層消化法雖不能精確地將視網(wǎng)膜消化至只剩完整的外核層，但也可得數(shù)量較多的感光細(xì)胞(圖2)，也仍具較好的內(nèi)外節(jié)段(箭頭所示)。各種材料來源的視網(wǎng)膜所用酶的濃度和作用時(shí)間也都相同，但胚眼組織消化時(shí)間則可短些，因?yàn)榕咛ソM織細(xì)胞間的連接較成年組織的疏松。而所用明膠粘貼固定的視網(wǎng)膜經(jīng)激光切削后同樣可獲得純感光細(xì)胞層(圖3)，但其內(nèi)外節(jié)段因接觸粘附在明膠中，已模糊不清，無法辨認(rèn)，明顯受損(箭頭所示)。(圖1～3見237頁(yè))
, 百拇醫(yī)藥
3 討論
分離出足夠數(shù)量和純的感光細(xì)胞以替代患眼功能不全或已遭破壞的感光細(xì)胞是視網(wǎng)膜感光細(xì)胞移植最關(guān)鍵的第一步。為使移植細(xì)胞能更好發(fā)育和存活，分離時(shí)應(yīng)盡可能減少對(duì)細(xì)胞的損傷。早在1988年Townes-Anderson等[4]就用酶分離的方法獲得兔視網(wǎng)膜的視桿細(xì)胞，但此法所得的是視網(wǎng)膜多種細(xì)胞的混懸液，且也破壞了感光細(xì)胞層的正常組織結(jié)構(gòu)和細(xì)胞極性，感光細(xì)胞活性差。
最近國(guó)內(nèi)外已有用準(zhǔn)分子激光更精確地切削視網(wǎng)膜，獲得成片純感光細(xì)胞的報(bào)道[1，2]，但他們都是用明膠作為包埋粘貼劑，移植時(shí)連同明膠一起移植到視網(wǎng)膜下腔，這樣獲取的感光細(xì)胞，從本文結(jié)果看內(nèi)外節(jié)段大多受損，而且妨礙了感光細(xì)胞和色素上皮細(xì)胞的盡快接觸，不利于感光細(xì)胞移植后的存活和功能恢復(fù)。
另外，還有人采用組織細(xì)胞震動(dòng)切削機(jī)切削法從視網(wǎng)膜上獲取純感光細(xì)胞層[5～7]。同樣利用兩種不同濃度的明膠來包埋粘貼固定待切削的外核層朝下的視網(wǎng)膜片，再用組織細(xì)胞震動(dòng)切削機(jī)以20～60μm的厚度切削視網(wǎng)膜，直至切下的組織用美藍(lán)染色后在顯微鏡下檢查證實(shí)剛達(dá)感光細(xì)胞層為止。此法除存在與常規(guī)準(zhǔn)分子激光切削用明膠作為包埋粘貼劑的缺點(diǎn)外，其操作繁瑣、耗時(shí)，且震蕩切削力對(duì)感光細(xì)胞也可能造成較嚴(yán)重的損傷[8]。
, 百拇醫(yī)藥
本研究中我們利用視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)層次分明的特點(diǎn)和不銹鋼篩網(wǎng)為視網(wǎng)膜薄片的支架，經(jīng)反復(fù)摸索酶的濃度和作用時(shí)間，首次提出了酶分層消化法可獲得純視網(wǎng)膜感光細(xì)胞。這種方法操作時(shí)間較長(zhǎng)，但對(duì)儀器設(shè)備要求不高，費(fèi)用低，在不具備準(zhǔn)分子激光儀的條件下值得推廣應(yīng)用。我們改良的準(zhǔn)分子激光切削法省略了明膠粘貼固定的復(fù)雜程序，并避免了明膠粘固對(duì)內(nèi)外節(jié)段的破壞，所得的視網(wǎng)膜感光細(xì)胞層植片具有完好的內(nèi)外節(jié)段，且沒有明膠粘附，植入到視網(wǎng)膜下腔后，可立即與色素上皮細(xì)胞正常接觸，便于移植感光細(xì)胞功能的恢復(fù)與發(fā)揮。改良的準(zhǔn)分子激光切削法在簡(jiǎn)化操作步驟、縮短操作時(shí)間及減少細(xì)胞的破壞等方面較常規(guī)的準(zhǔn)分子激光切削法有顯著的改善。
本研究?jī)煞N方法所獲得的視網(wǎng)膜感光細(xì)胞的內(nèi)外節(jié)段仍存在，提示其所受損傷較小，為視網(wǎng)膜的移植創(chuàng)造了條件，至于其進(jìn)一步的功能狀況及生物學(xué)活性，我們目前正在研究中。
, 百拇醫(yī)藥
圖1 改良的準(zhǔn)分子激光切削法獲取的感光細(xì)胞組織片，箭頭示完好的內(nèi)外節(jié)段(HE×400) 圖2 酶分層消化法獲取的感光細(xì)胞組織片，箭頭示較好的外節(jié)段(HE×400) 圖3 常規(guī)明膠粘固的視網(wǎng)膜經(jīng)激光切削后的感光細(xì)胞組織片，箭頭示受損的外節(jié)段(HE×400) Fig.1 Photoreceptor sheets ablated by modified excimer laser
surgery arrows indicate photoreceptors with perfect inner and outer segment(HE×400) Fig.2 Photoreceptor sheets obtained by enzyme gradation digestion
arrows indicate photoreceptors with good inner and outer segment(HE×400) Fig.3 Photoreceptor sheets ablated by regular excimer laser
, 百拇醫(yī)藥
surgery arrows indicate photoreceptors with impaired inner and outer segment(HE×400)
本課題獲國(guó)家自然科學(xué)基金基金編號(hào)：39770790及廣東省自然科學(xué)基金基金編號(hào)：950329資助
1，馬美云，王薇，陳越國(guó)，等.準(zhǔn)分子激光切削視網(wǎng)膜板層移植術(shù).中華眼底病雜志，1998，14(4)∶209
2，Huang JC，Ishida M，Hersh P，et al.Preparation and transplantation of photoreceptor sheets.Curr Eye Res，1998，17(6)∶573
3，Dowling JE，著.吳淼鑫，楊雄里，譯.視網(wǎng)膜.上海：上海醫(yī)科大學(xué)出版社，1989.8-14
, http://www.www.srpcoatings.com
4，Townes-Anderson E，Dacheux RF，Raviola E.Rod photoreceptors dissociated from the adult rabbit retina.J Neurosci，1988，8(1)∶320
5，Silverman MS，Hughes SE.Transplantation of retinal photo-receptors to light-damaged retina.Invest Ophthalmmol Vis Sci，1989，30∶1684
6，姜德詠，高玲.視網(wǎng)膜移植抗原性的初步研究.中華眼底病雜志，1997，13(4)∶234
7，Kaplan HJ，Tezel TH，Berger AS，et al.Human photoreceptor transplantation in retinitis pigmentosa.Arch Ophthalmol，1997，115∶1168
8，Tezel TH，Kaplan HJ.Harvest and storage of adult human photoreceptor cells：the vibratome compared to the excimer laser.Curr Eye Res，1998，17(7)∶748
(收稿：1999-12-21), 百拇醫(yī)藥