甲基汞對(duì)大鼠腦谷氨酸能神經(jīng)元的免疫組化影響
作者：陳學(xué)敏 祝衛(wèi)國(guó) 陳軍
單位：同濟(jì)醫(yī)科大學(xué)環(huán)境衛(wèi)生學(xué)教研室，武漢 430030
關(guān)鍵詞：甲基汞；谷氨酸能神經(jīng)元；免疫組織化學(xué)
衛(wèi)生毒理學(xué)雜志000401 摘要 【目的】 研究甲基汞亞急性染毒誘導(dǎo)大鼠腦內(nèi)谷氨酸能神經(jīng)元免疫組化改變，探討其毒性機(jī)制。【方法】 免疫組織化學(xué)方法�！窘Y(jié)果】 在低劑量組(2 mg.kg-1.d-1×7 d)大鼠腦內(nèi)谷氨酸免疫反應(yīng)陽(yáng)性細(xì)胞(Glu-IRPC)數(shù)目、積分光密度、陽(yáng)性面積比在給藥14 d時(shí)下降有顯著性意義(P<0.05)。在高劑量組(10 mg.kg-1.d-1×7 d)，各時(shí)點(diǎn)大鼠各腦區(qū)Glu-IRPC的數(shù)目下降，積分光密度降低，陽(yáng)性面積比下降均有顯著性意義(P<0.05)，且Glu-IRPC的分支突起明顯減少，有些細(xì)胞僅見(jiàn)胞體，未見(jiàn)突起�！窘Y(jié)論】 甲基汞亞急性染毒可使大鼠腦內(nèi)谷氨酸能神經(jīng)元中谷氨酸水平降低。
, 百拇醫(yī)藥
The immunohistochemical effects of methylmercury on the glutamatergic neurons in rat brain
CHEN Xue-min,ZHU Wei-guo,CHEN Jun
(Department of Environmental Health,Tongji Medical University,Wuhan 430030,China)
Abstract:【Objective】 This study was conducted to explore the effects of methylmercury subacute exposure on glutamatergic neurons in the rat brain as well as its toxic mechanism.【Methods】 Immunohistochemical technique was used.【Results】 The number of positive cell,the integrate optical density and the positive area ratio of glutamate immunoreactive positive cell (Glu-IRPC)decreased significantly in the rat brains in low dose group(2 mg.kg-1.d-1×7d)at the 14th day(P<0.05).Furthermore in the high dose group(10 mg.kg-1.d-1×7d),the number of positive cell,the integrate optical density and the positive area ratio of Glu-IRPC decreased significantly in the different parts of rat brains at all time points of observation (P<0.05).Meanwhile,the branch or process in some Glu-IRPC reduced obviously,and only the soma but no process could be seen in some cells.【Conclusion】 It is suggested that the methlymercury subacute intoxication resulted in the decrease of glutamate level in the glutamatergic neurons of rat brain.
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Key words：Methylmercury; Glutamatergic neurons; Immunohistochemistry
甲基汞是一種具有極強(qiáng)神經(jīng)毒作用的環(huán)境污染物，多年來(lái)各國(guó)學(xué)者一直致力于其神經(jīng)毒作用機(jī)制研究。有研究表明[1，2]，中樞谷氨酸能神經(jīng)元功能活動(dòng)的異�？赡芘c甲基汞的神經(jīng)毒作用機(jī)制有關(guān)，但這些研究采用的方法都是體外生化測(cè)定法。因此，本研究擬從另一個(gè)側(cè)面，即運(yùn)用體內(nèi)染毒免疫組織化學(xué)方法，去探討甲基汞對(duì)中樞谷氨酸能神經(jīng)元的影響，為進(jìn)一步闡明其神經(jīng)毒作用機(jī)制提供新的證據(jù)。
1 材料與方法
1.1 試劑和儀器 氯化甲基汞(Methylmercury chloride,MMC;含量≥質(zhì)量分?jǐn)?shù)為98%，Merck)，多聚甲醛(Paraformaldehyde,Merck)，戊二醛(體積分?jǐn)?shù)為25%，Merck)，Glutamate(Glu)鼠抗為Sigma公司產(chǎn)品；鼠PAP試劑盒，衛(wèi)生部武漢生物制品研究所；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。Vibratome1 000振動(dòng)切片機(jī)(Lancer,T.P.I公司，U.S.A),Nikon UFX-Ⅱ型顯微照相系統(tǒng)(Nikon 日本)。
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1.2 動(dòng)物分組及處理 取健康成年雄性SD大鼠35只，體重180～220 g，實(shí)驗(yàn)室檢疫1周后，隨機(jī)分成7組，即對(duì)照組、低劑量組(Ⅰ)、(Ⅱ)、(Ⅲ)和高劑量組(Ⅰ)、(Ⅱ)、(Ⅲ)，每組5只大鼠。MMC用雙蒸水配制，按下述方式染毒動(dòng)物。每日上午8∶30開(kāi)始灌胃，灌胃量0.5 ml/100 g 體重，以首次灌胃日作為第1天。對(duì)照組：雙蒸水，連續(xù)灌胃7 d,第14天處理動(dòng)物。低劑量組：MMC 2 mg.kg-1.d-1,連續(xù)灌胃7 d。高劑量組：MMC 10 mg.kg-1.d-1，連續(xù)灌胃7 d。(Ⅰ)、(Ⅱ)、(Ⅲ)組分別在第8、10、14天處理動(dòng)物。
1.3 腦組織的固定和振動(dòng)切片 大鼠經(jīng)過(guò)40 mg/kg戊巴比妥鈉溶液腹腔注射麻醉后，固定在手術(shù)板上，暴露胸腔，經(jīng)左心室升主動(dòng)脈插管，剪開(kāi)右心耳同時(shí)快速推注150 ml生理鹽水，然后滴注4 ℃的固定液(0.1 mol/LPB pH7.4，質(zhì)量濃度為2%的多聚甲醛，體積分?jǐn)?shù)為1%的戊二醛)500 ml。調(diào)節(jié)滴速，先快后慢，持續(xù)約1.5 h。滴注結(jié)束后，開(kāi)顱取出完整的大腦和小腦，將修整好的、已剔除腦膜的腦塊放入4%多聚甲醛固定液中4 ℃后固定4 h，然后用0.01 mol/LPBS沖洗干凈。用Vibratome1 000振動(dòng)切片機(jī)作連續(xù)額狀切片，含背側(cè)海馬最大截面的大腦切片厚40 μm，小腦切片厚30 μm。用PBS接片。
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1.4 Glu免疫組織化學(xué)法(雙PAP法)[3] (1)切片用PBS(0.01 mol/L，pH7.4)漂洗5 min×3；(2)體積分?jǐn)?shù)為0.2%的Triton X-100/PBS液浸泡切片，室溫30 min；(3)PBS漂洗5 min×3；(4)用體積分?jǐn)?shù)為0.3%H2O2和體積分?jǐn)?shù)為0.1%甲醇的PBS，室溫下滅活內(nèi)源性過(guò)氧化物酶30 min；(5)PBS漂洗5 min×3；(6)正常羊血清(1∶50)，37 ℃封閉1 h；(7)Glu鼠抗(1∶1 000),4 ℃反應(yīng)72 h，每天取出，37 ℃搖床中搖動(dòng)20 min；(8)PBS漂洗5 min×3；(9)抗鼠橋抗(1∶5)37 ℃×1 h；(10)PBS漂洗5 min×3；(11)單克隆鼠PAP(1∶5)，37 ℃×1h;(12)PBS漂洗5 min×3;(13)抗鼠橋抗(1∶5)37 ℃×30 min;(14)PBS漂洗5 min×3；(15)單克隆鼠PAP(1∶5)，37 ℃×30 min;(16)PBS漂洗5 min×3；(17)質(zhì)量濃度為0.05%的聯(lián)苯二胺(DAB)/體積分?jǐn)?shù)為0.01%的H2O2顯色3.5 min；(18)PBS終止顯色后，貼片，常規(guī)脫水，透明，封片。
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1.5 顯微照相、圖像分析及統(tǒng)計(jì)分析 (1)使用Nikon UFX-Ⅱ型自動(dòng)曝光顯微照相系統(tǒng)。選擇適當(dāng)部位，適當(dāng)倍數(shù)照相，底片為富士彩色膠卷(100°)；(2)圖像分析及統(tǒng)計(jì)分析：用MPIAS-500多媒體彩色病理圖文分析系統(tǒng)，對(duì)免疫組化反應(yīng)的切片進(jìn)行圖像分析。所有切片放大倍數(shù)均為100。每只動(dòng)物取2張切片，分別對(duì)頂葉大腦皮層，海馬CA3區(qū)和齒狀回DG、小腦進(jìn)行分析。每個(gè)部位取2個(gè)視野。測(cè)量窗面積為1 752 222.281 2 μm\+2，分別測(cè)定陽(yáng)性面積比[Aa(%)]，積分光密度(IOD)，平均陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)(n)并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，分析方法為F檢驗(yàn)和Student's檢驗(yàn)。陽(yáng)性面積比[Aa(%)]可綜合反映陽(yáng)性細(xì)胞的面積和數(shù)量，IOD反映著色深淺。
2 結(jié)果
2.1 正常情況下谷氨酸能神經(jīng)元在中樞各腦區(qū)的分布 在光鏡下觀察可見(jiàn)，正常對(duì)照組中，胞漿為棕褐色的Glu免疫反應(yīng)陽(yáng)性神經(jīng)細(xì)胞(Glu-IRPC)在大腦皮層散在分布，在海馬主要分布于海馬回(CA1,CA3)的錐體細(xì)胞層和齒狀回(DG)的顆粒細(xì)胞層，海馬CA\-3區(qū)細(xì)胞與大腦皮層細(xì)胞形態(tài)基本一致，僅細(xì)胞突起較短或稀少。Glu-IRPC在小腦主要分布于顆粒細(xì)胞，與文獻(xiàn)報(bào)道基本一致[4]。Glu-IRPC的胞漿呈棕褐色顆粒狀，細(xì)胞周?chē)�，胞體呈錐體形，圓形、橢圓形，有一個(gè)或多個(gè)突起，有些突起有分支。
, 百拇醫(yī)藥
2.2 甲基汞亞急性染毒后谷氨酸能神經(jīng)元在中樞各腦區(qū)的分布 甲基汞亞急性染毒后，高劑量組(10 mg.kg-1.d-1×7 d)同正常對(duì)照組相比，各時(shí)點(diǎn)第8、10、14天、各腦區(qū)Glu-IRPC的數(shù)目減少，著色減弱，陽(yáng)性面積比下降(表1，P<0.05)，且隨時(shí)間延長(zhǎng)，這種減少和下降愈來(lái)愈明顯，即第14天最明顯。從細(xì)胞形態(tài)上看，Glu-IRPC胞體皺縮，呈多邊形、三角形，突起分支減少且著色減弱。而低劑量組(2 mg.kg-1.d-1×7 d)在第10天開(kāi)始略有減少，但無(wú)顯著性，第14天各腦區(qū)Glu-IRPC的數(shù)目減少，著色減弱，陽(yáng)性面積比下降均有顯著性(P<0.05)，但減幅不大，見(jiàn)表1。
3 討論
3.1 Glu是哺乳動(dòng)物腦內(nèi)最重要的興奮性神經(jīng)遞質(zhì)，它負(fù)責(zé)腦內(nèi)大多數(shù)興奮性突觸活動(dòng)，廣泛地參與學(xué)習(xí)和記憶、感覺(jué)、心血管和神經(jīng)內(nèi)分泌控制及運(yùn)動(dòng)和其他生命功能活動(dòng)[5，6]。當(dāng)Glu能神經(jīng)元功能異常時(shí)可引起興奮性神經(jīng)毒性，而后者與癲閑發(fā)病以及化學(xué)毒物的神經(jīng)毒性作用有關(guān)[7]。有研究表明[1，2]，中樞谷氨酸能神經(jīng)元功能活動(dòng)的異�？赡芘c甲基汞的神經(jīng)毒作用機(jī)制有關(guān)，但目前對(duì)甲基汞中毒過(guò)程中腦內(nèi)Glu能神經(jīng)元功能改變的免疫組織化學(xué)研究報(bào)道極少。本實(shí)驗(yàn)利用免疫組織化學(xué)技術(shù)觀察到大鼠甲基汞亞急性染毒后，低劑量組大鼠腦內(nèi)Glu-IRPC的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)、積分光密度(反映著色強(qiáng)度)、陽(yáng)性面積比在第10天開(kāi)始略有下降，第14天下降有顯著性(P<0.05)，但降幅不大。而在高劑量組大鼠大腦皮層、海馬錐體細(xì)胞層和顆粒細(xì)胞層、小腦顆粒細(xì)胞層的Glu-IRPC的數(shù)目下降，著色強(qiáng)度減弱，陽(yáng)性面積比下降(P<0.05)，而且隨時(shí)間延長(zhǎng)愈來(lái)愈明顯，第14天降幅最大。同時(shí)還發(fā)現(xiàn)高劑量組Glu-IRPC的分支突起明顯減少，有些細(xì)胞僅見(jiàn)胞體，未見(jiàn)突起。提示甲基汞亞急性中毒與腦內(nèi)Glu能神經(jīng)元中Glu減少有關(guān)。
, 百拇醫(yī)藥
表1 甲基汞亞急性染毒大鼠腦內(nèi)Glu免疫反應(yīng)陽(yáng)性神經(jīng)細(xì)胞的圖像分析結(jié)果(
±s) 組別
d
大腦皮層
海馬DG
海馬CA3
小腦
Aa(%)
IOD
n
Aa(%)
IOD
, 百拇醫(yī)藥
n
Aa(%)
IOD
n
Aa(%)
IOD
n
甲基汞
(低劑量)
8
8.92±2.42
28.08±2.31
97±15
, 百拇醫(yī)藥
22.71±3.22
33.93±1.53
232±19
26.49±7.65
49.43±4.31
170±21
7.57±0.34
8.30±0.66
74±8
10
10.62±0.61
26.38±5.10
, 百拇醫(yī)藥
99±19
19.30±0.55
30.87±6.22
212±17
23.74±1.39
36.18±5.37
164±13
6.96±0.71
7.22±0.84
72±6
14
7.02±0.19
, http://www.www.srpcoatings.com
23.96±5.03
83±9*
21.09±3.99
22.89±2.05*
226±23
19.95±0.87
31.56±2.86**
142±8*
4.61±0.89
6.28±1.77
66±8
甲基汞
, http://www.www.srpcoatings.com
(高劑量)
8
6.12±1.87
24.61±3.20
78±10*
20.92±0.93
24.40±4.28**
218±28
28.13±0.93
18.94±2.49**
166±15
3.61±0.38
, 百拇醫(yī)藥
6.86±2.97
67±11
10
3.86±0.84**
19.88±2.50**
67±8
18.65±1.18
10.37±3.27**
203±15
22.92±1.09**
14.44±3.40**
152±8*
, http://www.www.srpcoatings.com
3.51±0.52
6.66±1.50**
59±6*
14
3.96±1.27
18.38±4.27**
50±11
14.47±2.93**
8.59±0.40**
196±12*
17.38±1.27**
9.38±0.38**
, 百拇醫(yī)藥
138±8*
2.83±0.11
4.77±0.25**
42±4**
對(duì)照組
14
9.11±0.87
28.92±3.61
109±14
19.30±1.29
36.42±4.78
220±22
, 百拇醫(yī)藥
29.92±1.98
44.04±3.16
171±12
7.59±0.28
11.07±1.77
79±10
與對(duì)照組比較，P<0.05，P<0.013.2 神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)Glu含量相當(dāng)豐富，但絕大多數(shù)與遞質(zhì)傳遞無(wú)關(guān)，是備用的Glu貯庫(kù)[8]。作為遞質(zhì)的Glu貯存在突觸囊胞中，并分布于神經(jīng)元細(xì)胞分支突起的末端。本研究觀察到甲基汞中毒時(shí)各腦區(qū)Glu-IRPC分支減少及著色強(qiáng)度減弱，這種變化較胞體減少減弱意義更大，這說(shuō)明甲基汞中毒時(shí)，神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)作為遞質(zhì)的Glu含量是降低的。
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3.3 正常情況下，神經(jīng)遞質(zhì)含量=凈合成量-釋放量+重?cái)z取量，其中后兩者與遞質(zhì)的突觸傳遞有關(guān)，對(duì)神經(jīng)遞質(zhì)含量的瞬間變化影響較大。因此甲基汞中毒時(shí)Glu-IRPC細(xì)胞數(shù)目減少，著色強(qiáng)度減弱等存在多種可能性，即凈合成量減少，釋放量增加，重?cái)z取量減少三者各自單獨(dú)或相互作用都可導(dǎo)致上述結(jié)果。但結(jié)合其他學(xué)者[1，2]和我們[9，10]的研究結(jié)果看，我們認(rèn)為上述結(jié)果主要與釋放量增加和重?cái)z取量減少有關(guān)，而與凈合成量減少關(guān)系不大。
綜上所述，免疫組織化學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，甲基汞亞急性中毒過(guò)程中大鼠腦內(nèi)Glu能神經(jīng)元數(shù)目下降，著色強(qiáng)度減弱，陽(yáng)性面積比下降，且這種改變與其釋放量增加，重?cái)z取量減少有關(guān)。
本研究為國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目的部分內(nèi)容(39470603)
參考文獻(xiàn)
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(收稿日期：1999-09-10), 百拇醫(yī)藥
單位：同濟(jì)醫(yī)科大學(xué)環(huán)境衛(wèi)生學(xué)教研室，武漢 430030
關(guān)鍵詞：甲基汞；谷氨酸能神經(jīng)元；免疫組織化學(xué)
衛(wèi)生毒理學(xué)雜志000401 摘要 【目的】 研究甲基汞亞急性染毒誘導(dǎo)大鼠腦內(nèi)谷氨酸能神經(jīng)元免疫組化改變，探討其毒性機(jī)制。【方法】 免疫組織化學(xué)方法�！窘Y(jié)果】 在低劑量組(2 mg.kg-1.d-1×7 d)大鼠腦內(nèi)谷氨酸免疫反應(yīng)陽(yáng)性細(xì)胞(Glu-IRPC)數(shù)目、積分光密度、陽(yáng)性面積比在給藥14 d時(shí)下降有顯著性意義(P<0.05)。在高劑量組(10 mg.kg-1.d-1×7 d)，各時(shí)點(diǎn)大鼠各腦區(qū)Glu-IRPC的數(shù)目下降，積分光密度降低，陽(yáng)性面積比下降均有顯著性意義(P<0.05)，且Glu-IRPC的分支突起明顯減少，有些細(xì)胞僅見(jiàn)胞體，未見(jiàn)突起�！窘Y(jié)論】 甲基汞亞急性染毒可使大鼠腦內(nèi)谷氨酸能神經(jīng)元中谷氨酸水平降低。
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The immunohistochemical effects of methylmercury on the glutamatergic neurons in rat brain
CHEN Xue-min,ZHU Wei-guo,CHEN Jun
(Department of Environmental Health,Tongji Medical University,Wuhan 430030,China)
Abstract:【Objective】 This study was conducted to explore the effects of methylmercury subacute exposure on glutamatergic neurons in the rat brain as well as its toxic mechanism.【Methods】 Immunohistochemical technique was used.【Results】 The number of positive cell,the integrate optical density and the positive area ratio of glutamate immunoreactive positive cell (Glu-IRPC)decreased significantly in the rat brains in low dose group(2 mg.kg-1.d-1×7d)at the 14th day(P<0.05).Furthermore in the high dose group(10 mg.kg-1.d-1×7d),the number of positive cell,the integrate optical density and the positive area ratio of Glu-IRPC decreased significantly in the different parts of rat brains at all time points of observation (P<0.05).Meanwhile,the branch or process in some Glu-IRPC reduced obviously,and only the soma but no process could be seen in some cells.【Conclusion】 It is suggested that the methlymercury subacute intoxication resulted in the decrease of glutamate level in the glutamatergic neurons of rat brain.
, 百拇醫(yī)藥
Key words：Methylmercury; Glutamatergic neurons; Immunohistochemistry
甲基汞是一種具有極強(qiáng)神經(jīng)毒作用的環(huán)境污染物，多年來(lái)各國(guó)學(xué)者一直致力于其神經(jīng)毒作用機(jī)制研究。有研究表明[1，2]，中樞谷氨酸能神經(jīng)元功能活動(dòng)的異�？赡芘c甲基汞的神經(jīng)毒作用機(jī)制有關(guān)，但這些研究采用的方法都是體外生化測(cè)定法。因此，本研究擬從另一個(gè)側(cè)面，即運(yùn)用體內(nèi)染毒免疫組織化學(xué)方法，去探討甲基汞對(duì)中樞谷氨酸能神經(jīng)元的影響，為進(jìn)一步闡明其神經(jīng)毒作用機(jī)制提供新的證據(jù)。
1 材料與方法
1.1 試劑和儀器 氯化甲基汞(Methylmercury chloride,MMC;含量≥質(zhì)量分?jǐn)?shù)為98%，Merck)，多聚甲醛(Paraformaldehyde,Merck)，戊二醛(體積分?jǐn)?shù)為25%，Merck)，Glutamate(Glu)鼠抗為Sigma公司產(chǎn)品；鼠PAP試劑盒，衛(wèi)生部武漢生物制品研究所；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。Vibratome1 000振動(dòng)切片機(jī)(Lancer,T.P.I公司，U.S.A),Nikon UFX-Ⅱ型顯微照相系統(tǒng)(Nikon 日本)。
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1.2 動(dòng)物分組及處理 取健康成年雄性SD大鼠35只，體重180～220 g，實(shí)驗(yàn)室檢疫1周后，隨機(jī)分成7組，即對(duì)照組、低劑量組(Ⅰ)、(Ⅱ)、(Ⅲ)和高劑量組(Ⅰ)、(Ⅱ)、(Ⅲ)，每組5只大鼠。MMC用雙蒸水配制，按下述方式染毒動(dòng)物。每日上午8∶30開(kāi)始灌胃，灌胃量0.5 ml/100 g 體重，以首次灌胃日作為第1天。對(duì)照組：雙蒸水，連續(xù)灌胃7 d,第14天處理動(dòng)物。低劑量組：MMC 2 mg.kg-1.d-1,連續(xù)灌胃7 d。高劑量組：MMC 10 mg.kg-1.d-1，連續(xù)灌胃7 d。(Ⅰ)、(Ⅱ)、(Ⅲ)組分別在第8、10、14天處理動(dòng)物。
1.3 腦組織的固定和振動(dòng)切片 大鼠經(jīng)過(guò)40 mg/kg戊巴比妥鈉溶液腹腔注射麻醉后，固定在手術(shù)板上，暴露胸腔，經(jīng)左心室升主動(dòng)脈插管，剪開(kāi)右心耳同時(shí)快速推注150 ml生理鹽水，然后滴注4 ℃的固定液(0.1 mol/LPB pH7.4，質(zhì)量濃度為2%的多聚甲醛，體積分?jǐn)?shù)為1%的戊二醛)500 ml。調(diào)節(jié)滴速，先快后慢，持續(xù)約1.5 h。滴注結(jié)束后，開(kāi)顱取出完整的大腦和小腦，將修整好的、已剔除腦膜的腦塊放入4%多聚甲醛固定液中4 ℃后固定4 h，然后用0.01 mol/LPBS沖洗干凈。用Vibratome1 000振動(dòng)切片機(jī)作連續(xù)額狀切片，含背側(cè)海馬最大截面的大腦切片厚40 μm，小腦切片厚30 μm。用PBS接片。
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1.4 Glu免疫組織化學(xué)法(雙PAP法)[3] (1)切片用PBS(0.01 mol/L，pH7.4)漂洗5 min×3；(2)體積分?jǐn)?shù)為0.2%的Triton X-100/PBS液浸泡切片，室溫30 min；(3)PBS漂洗5 min×3；(4)用體積分?jǐn)?shù)為0.3%H2O2和體積分?jǐn)?shù)為0.1%甲醇的PBS，室溫下滅活內(nèi)源性過(guò)氧化物酶30 min；(5)PBS漂洗5 min×3；(6)正常羊血清(1∶50)，37 ℃封閉1 h；(7)Glu鼠抗(1∶1 000),4 ℃反應(yīng)72 h，每天取出，37 ℃搖床中搖動(dòng)20 min；(8)PBS漂洗5 min×3；(9)抗鼠橋抗(1∶5)37 ℃×1 h；(10)PBS漂洗5 min×3；(11)單克隆鼠PAP(1∶5)，37 ℃×1h;(12)PBS漂洗5 min×3;(13)抗鼠橋抗(1∶5)37 ℃×30 min;(14)PBS漂洗5 min×3；(15)單克隆鼠PAP(1∶5)，37 ℃×30 min;(16)PBS漂洗5 min×3；(17)質(zhì)量濃度為0.05%的聯(lián)苯二胺(DAB)/體積分?jǐn)?shù)為0.01%的H2O2顯色3.5 min；(18)PBS終止顯色后，貼片，常規(guī)脫水，透明，封片。
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1.5 顯微照相、圖像分析及統(tǒng)計(jì)分析 (1)使用Nikon UFX-Ⅱ型自動(dòng)曝光顯微照相系統(tǒng)。選擇適當(dāng)部位，適當(dāng)倍數(shù)照相，底片為富士彩色膠卷(100°)；(2)圖像分析及統(tǒng)計(jì)分析：用MPIAS-500多媒體彩色病理圖文分析系統(tǒng)，對(duì)免疫組化反應(yīng)的切片進(jìn)行圖像分析。所有切片放大倍數(shù)均為100。每只動(dòng)物取2張切片，分別對(duì)頂葉大腦皮層，海馬CA3區(qū)和齒狀回DG、小腦進(jìn)行分析。每個(gè)部位取2個(gè)視野。測(cè)量窗面積為1 752 222.281 2 μm\+2，分別測(cè)定陽(yáng)性面積比[Aa(%)]，積分光密度(IOD)，平均陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)(n)并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，分析方法為F檢驗(yàn)和Student's檢驗(yàn)。陽(yáng)性面積比[Aa(%)]可綜合反映陽(yáng)性細(xì)胞的面積和數(shù)量，IOD反映著色深淺。
2 結(jié)果
2.1 正常情況下谷氨酸能神經(jīng)元在中樞各腦區(qū)的分布 在光鏡下觀察可見(jiàn)，正常對(duì)照組中，胞漿為棕褐色的Glu免疫反應(yīng)陽(yáng)性神經(jīng)細(xì)胞(Glu-IRPC)在大腦皮層散在分布，在海馬主要分布于海馬回(CA1,CA3)的錐體細(xì)胞層和齒狀回(DG)的顆粒細(xì)胞層，海馬CA\-3區(qū)細(xì)胞與大腦皮層細(xì)胞形態(tài)基本一致，僅細(xì)胞突起較短或稀少。Glu-IRPC在小腦主要分布于顆粒細(xì)胞，與文獻(xiàn)報(bào)道基本一致[4]。Glu-IRPC的胞漿呈棕褐色顆粒狀，細(xì)胞周?chē)�，胞體呈錐體形，圓形、橢圓形，有一個(gè)或多個(gè)突起，有些突起有分支。
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2.2 甲基汞亞急性染毒后谷氨酸能神經(jīng)元在中樞各腦區(qū)的分布 甲基汞亞急性染毒后，高劑量組(10 mg.kg-1.d-1×7 d)同正常對(duì)照組相比，各時(shí)點(diǎn)第8、10、14天、各腦區(qū)Glu-IRPC的數(shù)目減少，著色減弱，陽(yáng)性面積比下降(表1，P<0.05)，且隨時(shí)間延長(zhǎng)，這種減少和下降愈來(lái)愈明顯，即第14天最明顯。從細(xì)胞形態(tài)上看，Glu-IRPC胞體皺縮，呈多邊形、三角形，突起分支減少且著色減弱。而低劑量組(2 mg.kg-1.d-1×7 d)在第10天開(kāi)始略有減少，但無(wú)顯著性，第14天各腦區(qū)Glu-IRPC的數(shù)目減少，著色減弱，陽(yáng)性面積比下降均有顯著性(P<0.05)，但減幅不大，見(jiàn)表1。
3 討論
3.1 Glu是哺乳動(dòng)物腦內(nèi)最重要的興奮性神經(jīng)遞質(zhì)，它負(fù)責(zé)腦內(nèi)大多數(shù)興奮性突觸活動(dòng)，廣泛地參與學(xué)習(xí)和記憶、感覺(jué)、心血管和神經(jīng)內(nèi)分泌控制及運(yùn)動(dòng)和其他生命功能活動(dòng)[5，6]。當(dāng)Glu能神經(jīng)元功能異常時(shí)可引起興奮性神經(jīng)毒性，而后者與癲閑發(fā)病以及化學(xué)毒物的神經(jīng)毒性作用有關(guān)[7]。有研究表明[1，2]，中樞谷氨酸能神經(jīng)元功能活動(dòng)的異�？赡芘c甲基汞的神經(jīng)毒作用機(jī)制有關(guān)，但目前對(duì)甲基汞中毒過(guò)程中腦內(nèi)Glu能神經(jīng)元功能改變的免疫組織化學(xué)研究報(bào)道極少。本實(shí)驗(yàn)利用免疫組織化學(xué)技術(shù)觀察到大鼠甲基汞亞急性染毒后，低劑量組大鼠腦內(nèi)Glu-IRPC的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)、積分光密度(反映著色強(qiáng)度)、陽(yáng)性面積比在第10天開(kāi)始略有下降，第14天下降有顯著性(P<0.05)，但降幅不大。而在高劑量組大鼠大腦皮層、海馬錐體細(xì)胞層和顆粒細(xì)胞層、小腦顆粒細(xì)胞層的Glu-IRPC的數(shù)目下降，著色強(qiáng)度減弱，陽(yáng)性面積比下降(P<0.05)，而且隨時(shí)間延長(zhǎng)愈來(lái)愈明顯，第14天降幅最大。同時(shí)還發(fā)現(xiàn)高劑量組Glu-IRPC的分支突起明顯減少，有些細(xì)胞僅見(jiàn)胞體，未見(jiàn)突起。提示甲基汞亞急性中毒與腦內(nèi)Glu能神經(jīng)元中Glu減少有關(guān)。
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表1 甲基汞亞急性染毒大鼠腦內(nèi)Glu免疫反應(yīng)陽(yáng)性神經(jīng)細(xì)胞的圖像分析結(jié)果(
±s) 組別d
大腦皮層
海馬DG
海馬CA3
小腦
Aa(%)
IOD
n
Aa(%)
IOD
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n
Aa(%)
IOD
n
Aa(%)
IOD
n
甲基汞
(低劑量)
8
8.92±2.42
28.08±2.31
97±15
, 百拇醫(yī)藥
22.71±3.22
33.93±1.53
232±19
26.49±7.65
49.43±4.31
170±21
7.57±0.34
8.30±0.66
74±8
10
10.62±0.61
26.38±5.10
, 百拇醫(yī)藥
99±19
19.30±0.55
30.87±6.22
212±17
23.74±1.39
36.18±5.37
164±13
6.96±0.71
7.22±0.84
72±6
14
7.02±0.19
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23.96±5.03
83±9*
21.09±3.99
22.89±2.05*
226±23
19.95±0.87
31.56±2.86**
142±8*
4.61±0.89
6.28±1.77
66±8
甲基汞
, http://www.www.srpcoatings.com
(高劑量)
8
6.12±1.87
24.61±3.20
78±10*
20.92±0.93
24.40±4.28**
218±28
28.13±0.93
18.94±2.49**
166±15
3.61±0.38
, 百拇醫(yī)藥
6.86±2.97
67±11
10
3.86±0.84**
19.88±2.50**
67±8
18.65±1.18
10.37±3.27**
203±15
22.92±1.09**
14.44±3.40**
152±8*
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3.51±0.52
6.66±1.50**
59±6*
14
3.96±1.27
18.38±4.27**
50±11
14.47±2.93**
8.59±0.40**
196±12*
17.38±1.27**
9.38±0.38**
, 百拇醫(yī)藥
138±8*
2.83±0.11
4.77±0.25**
42±4**
對(duì)照組
14
9.11±0.87
28.92±3.61
109±14
19.30±1.29
36.42±4.78
220±22
, 百拇醫(yī)藥
29.92±1.98
44.04±3.16
171±12
7.59±0.28
11.07±1.77
79±10
與對(duì)照組比較，P<0.05，P<0.013.2 神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)Glu含量相當(dāng)豐富，但絕大多數(shù)與遞質(zhì)傳遞無(wú)關(guān)，是備用的Glu貯庫(kù)[8]。作為遞質(zhì)的Glu貯存在突觸囊胞中，并分布于神經(jīng)元細(xì)胞分支突起的末端。本研究觀察到甲基汞中毒時(shí)各腦區(qū)Glu-IRPC分支減少及著色強(qiáng)度減弱，這種變化較胞體減少減弱意義更大，這說(shuō)明甲基汞中毒時(shí)，神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)作為遞質(zhì)的Glu含量是降低的。
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3.3 正常情況下，神經(jīng)遞質(zhì)含量=凈合成量-釋放量+重?cái)z取量，其中后兩者與遞質(zhì)的突觸傳遞有關(guān)，對(duì)神經(jīng)遞質(zhì)含量的瞬間變化影響較大。因此甲基汞中毒時(shí)Glu-IRPC細(xì)胞數(shù)目減少，著色強(qiáng)度減弱等存在多種可能性，即凈合成量減少，釋放量增加，重?cái)z取量減少三者各自單獨(dú)或相互作用都可導(dǎo)致上述結(jié)果。但結(jié)合其他學(xué)者[1，2]和我們[9，10]的研究結(jié)果看，我們認(rèn)為上述結(jié)果主要與釋放量增加和重?cái)z取量減少有關(guān)，而與凈合成量減少關(guān)系不大。
綜上所述，免疫組織化學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，甲基汞亞急性中毒過(guò)程中大鼠腦內(nèi)Glu能神經(jīng)元數(shù)目下降，著色強(qiáng)度減弱，陽(yáng)性面積比下降，且這種改變與其釋放量增加，重?cái)z取量減少有關(guān)。
本研究為國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目的部分內(nèi)容(39470603)
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(收稿日期：1999-09-10), 百拇醫(yī)藥