鈣拮抗劑尼卡地平的HPLC法分析及其在兔體內藥代動力學研究
作者：王嗣岑 賀浪沖
單位：王嗣岑 賀浪沖(西安醫(yī)科大學藥學院 710061)
關鍵詞：尼卡地平；鈣拮抗劑；藥動學；高效液相色譜
藥物分析雜志000306 摘要 目的：建立兔血漿中鈣拮抗劑尼卡地平的反相高效液相色譜分析方法，并對其在兔體內的藥代動力學進行研究。方法：血漿樣品在弱堿性條件下經環(huán)己烷-異丙醇(96∶4)提取，用LiChrosorb C18反相柱，甲醇-水(75∶25)為流動相，流速1.0 mL.min-1，檢測波長236 nm等條件下，分析測定。結果：方法平均回收率為98.27%～100.4%，RSD<5.0%，線性范圍：11～110 ng(r=0.998 1)，最低檢測限為10 ng。結論：本法操作簡便、準確靈敏、重現性好，可用于尼卡地平的藥動學研究。
, 百拇醫(yī)藥
Determination and Pharmacokinetic Study of Nicardipine
in Rabbit by High Performance Liquid Chromatography
Wang Sicen，He Langchong
(College of Pharmacy Xi′an Medical University，Xi′an 710061)
Abstract Objective：To establish HPLC method for determination and pharmacokinetic study of nicardipine in rabbit.Methods:The blood samples were diluted by 0.05 mol.L-1 Na2HPO4 buffer solution(pH=7.4) and extracted with cyclohexane-2-propanol(96∶4).The LiChrosorb C18 column(150 mm×4.6 mm，5 μm)was used as analytical column.The mobile phase consisted of methanol-water(75∶25).The flow rate was 1.0 mL.min-1 with UV detection at 236 nm.Results:The recovery of the method was 98.27%～100.4%，RSD<5.0%.The linear range was 11～110 ng(r=0.998 1) and determination limit was 10 ng.Conclusion:The method had a good selectivity、sensitivity and reproducibility and can be used for pharmacokinetic studies of nicardipine in rabbit plasma.
, 百拇醫(yī)藥
Key words nicardipine,calcium antagonists,pharmacokinetics,HPLC
尼卡地平(Nicardipine,NCD)屬1，4-二氫吡啶類鈣拮抗劑，為血管擴張型降壓藥。通過抑制細胞外Ca2+的內流、松弛血管平滑肌而起到降壓作用，主要用于低、中度高血壓病[1]。文獻報道有紫外法[2]、高效液相色譜法[3]等方法測定血漿中的NCD。在文獻的基礎上本文對NCD的提取方法及高效液相色譜條件進行了研究，建立了一種反相高效液相色譜(RP-HPLC)方法，用于對兔血漿中NCD的濃度進行分析測定，并對其在兔體內的藥代動力學進行研究。
1 試劑與儀器
NCD對照品(美國Sigma公司)，NCD原料藥(西北第二合成藥廠)。環(huán)己烷、異丙醇為分析純；甲醇為色譜純；水為三重蒸餾水。其余試劑均為分析純。
, 百拇醫(yī)藥
Shimadzu 10Avp高效液相色譜儀，配置SPD-10A vp型可調波長檢測器，LC10-A vp型溶劑輸送泵，HP3395A數據處理機；Herlme ZK401高速冷凍離心機；SK-1型快速混勻器。
2 實驗方法
2.1 色譜條件 色譜柱LiChrosorb C18柱(4.6 mm×150 mm，5 μm)；流動相為甲醇-水(75∶25)，使用前用0.45 μm濾膜減壓過濾，超聲除氣；檢測波長236 nm；流速1 mL.min-1。
2.2 NCD對照品溶液的配制 精密稱取NCD對照品適量，加甲醇溶解并定容至10 mL，即得濃度為0.22 mg.mL-1的對照品溶液。
2.3 樣品采集 取健康家兔5只，雌雄不限，體重(1.9±0.3)kg，由西安醫(yī)科大學實驗動物中心提供。另取NCD原料藥研磨成細粉，混懸于生理鹽水中，按每公斤體重40 mg的劑量灌胃給藥。于灌胃前及灌胃后0.5，1，1.5，2，2.5，3，4，6，8，10，24 h耳動脈采血2 mL，肝素抗凝，3 000 r.min-1離心制成血漿。
, http://www.www.srpcoatings.com
2.4 樣品預處理 取血漿1.0 mL，加0.05 mol.L-1的磷酸鹽緩沖溶液1 mL(pH=7.4)，混勻，再加入環(huán)己烷-異丙醇(96∶4)混合液5 mL，振蕩提取5 min。取上層提取液4.5 mL，氮氣吹干，殘渣加0.5 mL流動相溶解，振蕩3 min，15 000 r.min-1離心10 min。精密吸取上清液50 μL進樣分析，用外標法計算。
3 結果
3.1 方法專屬性 將空白血漿的色譜圖與血漿中加入NCD得到的色譜圖進行比較，證明血漿中的內源性物質不干擾NCD測定，見圖1，而在此色譜條件下，NCD的保留時間為15.3 min。
圖1 高效液相色譜測定NCD血藥濃度色譜圖
, 百拇醫(yī)藥
A.血漿樣品 B.NCD對照品 C.空白血漿
1.NCD
3.2 標準曲線和線性范圍 取空白血漿6份，每份1 mL，依次加入NCD對照品110，220，440，660，880，1100 ng，混勻后，照“樣品預處理”項下操作，依次測定NCD各濃度點的峰面積(A)，以NCD的峰面積(A)與進樣量m(ng)進行線性回歸，重復3次，得平均回歸方程為：
A=802.22m-369.03 r=0.998 1 n=3
NCD的線性范圍為11～110 ng，最低檢測限為10 ng(S/N≥3)。
3.3 回收率及精密度
取空白血漿2份，每份1 mL，各加入220 ng及440 ng的NCD對照品混勻后，照“樣品預處理”項下操作，按加樣回收率方法計算，重復3次，結果見表1。
, 百拇醫(yī)藥
表1 血漿中尼卡地平的方法回收率實驗結果表(n=5) 加入量/ng
平均回收率/%
RSD/%
220
98.27
3.72
440
100.4
4.38
取空白血漿1 mL，精密加入110，220，440 ng的NCD對照品混勻后，照“樣品預處理”項下操作，進行日內及日間(5 d)精密度考察。結果見表2。
, 百拇醫(yī)藥
3.4 藥代動力學研究 照“樣品采集”和“樣品預處理”項下操作，對健康家兔口服給藥(NCD原料藥)后的藥代動力學進行研究。所得藥-時數據經3P87程序軟件處理后，得各藥代動力學參數。家兔一次灌胃NCD(40 mg.kg-1)后主要藥動學參數Logt=(0.454±0.032)h，V/F=(0.242±0.015)mg.ng-1.mL，t1/2(Ke)=(5.339±0.754)h，t1/2(Ka)=(0.812±0.086)h，Tmax=(3.04±0.93)h，Cmax=(919.245±54.40)μg.L-1，AUC=(9932.85±515.92)μg.h.L-1,n=5，平均藥-時曲線見圖2。
表2 血漿中尼卡地平精密度測定結果 (n=5) 加入量/ng
, 百拇醫(yī)藥
日內RSD/%
日間RSD/%
110
2.67
2.13
220
3.85
4.62
440
4.37
3.61
圖2 家兔一次性灌胃NCD(40 mg.kg-1)后
, 百拇醫(yī)藥
平均血藥濃度-時間曲線
4 討論
4.1 NCD屬弱堿性藥物，采用液-液萃取法提取血漿中的NCD，應特別注意提取介質酸堿度的控制。酸性條件下NCD易成鹽不利于有機溶劑提取，而且血漿蛋白干擾嚴重，影響色譜分離。經反復試驗，本文采用中性偏堿的提取條件，用0.05 mol.L-1磷酸鹽緩沖溶液(pH=7.4)控制提取介質的pH，使大部分NCD以分子形式存在，保證提取效率的同時減少了血漿蛋白的干擾。
4.2 萃取劑分別考察了醋酸乙酯、乙醚、正己烷、環(huán)己烷、環(huán)己烷與異丙醇混合液，結果醋酸乙酯對NCD提取效率不高。環(huán)己烷與異丙醇混合液的提取效率較好，只是在震蕩提取時易乳化，故在提取時應加入適量NaCl。
4.3 由方法學考察可見本法準確、靈敏、專一，可滿足對血藥濃度分析的要求。利用本法對NCD在家兔體內的藥代動力學進行了研究，結果表明對家兔一次性灌胃NCD后血漿C-t曲線呈一室一級模型。從藥代動力學參數可以看出，NCD原料藥給家兔灌胃后吸收較慢，存在一滯后時間(Log t=0.454 h)，達峰時間(tmax)為3.04 h；且消除半衰期較長(t1/2(Ke))為5.339 h，因此在連續(xù)給藥時應考慮NCD在體內的蓄積。
, 百拇醫(yī)藥
國家自然科學基金資助課題(批準號 39770856)
參考文獻
1，騰天申節(jié)譯，曾昭瑞校.第二代二氫吡啶類鈣離子拮抗劑.國外藥學.合成藥生化藥制劑分冊，1998，9(6)：334
2，齊美玲，王雅雯，鄭俊民等.尼卡地平緩釋片的含量測定方法研究.沈陽藥科大學學報，1996，13(1)：50
3，李克，張昕，趙飛浪等.高效液相色譜法測定人血漿中尼卡地平及藥代動力學參數.中國藥理學報，1998，29：197
(本文于1999年12月13日收到), 百拇醫(yī)藥
單位：王嗣岑 賀浪沖(西安醫(yī)科大學藥學院 710061)
關鍵詞：尼卡地平；鈣拮抗劑；藥動學；高效液相色譜
藥物分析雜志000306 摘要 目的：建立兔血漿中鈣拮抗劑尼卡地平的反相高效液相色譜分析方法，并對其在兔體內的藥代動力學進行研究。方法：血漿樣品在弱堿性條件下經環(huán)己烷-異丙醇(96∶4)提取，用LiChrosorb C18反相柱，甲醇-水(75∶25)為流動相，流速1.0 mL.min-1，檢測波長236 nm等條件下，分析測定。結果：方法平均回收率為98.27%～100.4%，RSD<5.0%，線性范圍：11～110 ng(r=0.998 1)，最低檢測限為10 ng。結論：本法操作簡便、準確靈敏、重現性好，可用于尼卡地平的藥動學研究。
, 百拇醫(yī)藥
Determination and Pharmacokinetic Study of Nicardipine
in Rabbit by High Performance Liquid Chromatography
Wang Sicen，He Langchong
(College of Pharmacy Xi′an Medical University，Xi′an 710061)
Abstract Objective：To establish HPLC method for determination and pharmacokinetic study of nicardipine in rabbit.Methods:The blood samples were diluted by 0.05 mol.L-1 Na2HPO4 buffer solution(pH=7.4) and extracted with cyclohexane-2-propanol(96∶4).The LiChrosorb C18 column(150 mm×4.6 mm，5 μm)was used as analytical column.The mobile phase consisted of methanol-water(75∶25).The flow rate was 1.0 mL.min-1 with UV detection at 236 nm.Results:The recovery of the method was 98.27%～100.4%，RSD<5.0%.The linear range was 11～110 ng(r=0.998 1) and determination limit was 10 ng.Conclusion:The method had a good selectivity、sensitivity and reproducibility and can be used for pharmacokinetic studies of nicardipine in rabbit plasma.
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Key words nicardipine,calcium antagonists,pharmacokinetics,HPLC
尼卡地平(Nicardipine,NCD)屬1，4-二氫吡啶類鈣拮抗劑，為血管擴張型降壓藥。通過抑制細胞外Ca2+的內流、松弛血管平滑肌而起到降壓作用，主要用于低、中度高血壓病[1]。文獻報道有紫外法[2]、高效液相色譜法[3]等方法測定血漿中的NCD。在文獻的基礎上本文對NCD的提取方法及高效液相色譜條件進行了研究，建立了一種反相高效液相色譜(RP-HPLC)方法，用于對兔血漿中NCD的濃度進行分析測定，并對其在兔體內的藥代動力學進行研究。
1 試劑與儀器
NCD對照品(美國Sigma公司)，NCD原料藥(西北第二合成藥廠)。環(huán)己烷、異丙醇為分析純；甲醇為色譜純；水為三重蒸餾水。其余試劑均為分析純。
, 百拇醫(yī)藥
Shimadzu 10Avp高效液相色譜儀，配置SPD-10A vp型可調波長檢測器，LC10-A vp型溶劑輸送泵，HP3395A數據處理機；Herlme ZK401高速冷凍離心機；SK-1型快速混勻器。
2 實驗方法
2.1 色譜條件 色譜柱LiChrosorb C18柱(4.6 mm×150 mm，5 μm)；流動相為甲醇-水(75∶25)，使用前用0.45 μm濾膜減壓過濾，超聲除氣；檢測波長236 nm；流速1 mL.min-1。
2.2 NCD對照品溶液的配制 精密稱取NCD對照品適量，加甲醇溶解并定容至10 mL，即得濃度為0.22 mg.mL-1的對照品溶液。
2.3 樣品采集 取健康家兔5只，雌雄不限，體重(1.9±0.3)kg，由西安醫(yī)科大學實驗動物中心提供。另取NCD原料藥研磨成細粉，混懸于生理鹽水中，按每公斤體重40 mg的劑量灌胃給藥。于灌胃前及灌胃后0.5，1，1.5，2，2.5，3，4，6，8，10，24 h耳動脈采血2 mL，肝素抗凝，3 000 r.min-1離心制成血漿。
, http://www.www.srpcoatings.com
2.4 樣品預處理 取血漿1.0 mL，加0.05 mol.L-1的磷酸鹽緩沖溶液1 mL(pH=7.4)，混勻，再加入環(huán)己烷-異丙醇(96∶4)混合液5 mL，振蕩提取5 min。取上層提取液4.5 mL，氮氣吹干，殘渣加0.5 mL流動相溶解，振蕩3 min，15 000 r.min-1離心10 min。精密吸取上清液50 μL進樣分析，用外標法計算。
3 結果
3.1 方法專屬性 將空白血漿的色譜圖與血漿中加入NCD得到的色譜圖進行比較，證明血漿中的內源性物質不干擾NCD測定，見圖1，而在此色譜條件下，NCD的保留時間為15.3 min。
圖1 高效液相色譜測定NCD血藥濃度色譜圖
, 百拇醫(yī)藥
A.血漿樣品 B.NCD對照品 C.空白血漿
1.NCD
3.2 標準曲線和線性范圍 取空白血漿6份，每份1 mL，依次加入NCD對照品110，220，440，660，880，1100 ng，混勻后，照“樣品預處理”項下操作，依次測定NCD各濃度點的峰面積(A)，以NCD的峰面積(A)與進樣量m(ng)進行線性回歸，重復3次，得平均回歸方程為：
A=802.22m-369.03 r=0.998 1 n=3
NCD的線性范圍為11～110 ng，最低檢測限為10 ng(S/N≥3)。
3.3 回收率及精密度
取空白血漿2份，每份1 mL，各加入220 ng及440 ng的NCD對照品混勻后，照“樣品預處理”項下操作，按加樣回收率方法計算，重復3次，結果見表1。
, 百拇醫(yī)藥
表1 血漿中尼卡地平的方法回收率實驗結果表(n=5) 加入量/ng
平均回收率/%
RSD/%
220
98.27
3.72
440
100.4
4.38
取空白血漿1 mL，精密加入110，220，440 ng的NCD對照品混勻后，照“樣品預處理”項下操作，進行日內及日間(5 d)精密度考察。結果見表2。
, 百拇醫(yī)藥
3.4 藥代動力學研究 照“樣品采集”和“樣品預處理”項下操作，對健康家兔口服給藥(NCD原料藥)后的藥代動力學進行研究。所得藥-時數據經3P87程序軟件處理后，得各藥代動力學參數。家兔一次灌胃NCD(40 mg.kg-1)后主要藥動學參數Logt=(0.454±0.032)h，V/F=(0.242±0.015)mg.ng-1.mL，t1/2(Ke)=(5.339±0.754)h，t1/2(Ka)=(0.812±0.086)h，Tmax=(3.04±0.93)h，Cmax=(919.245±54.40)μg.L-1，AUC=(9932.85±515.92)μg.h.L-1,n=5，平均藥-時曲線見圖2。
表2 血漿中尼卡地平精密度測定結果 (n=5) 加入量/ng
, 百拇醫(yī)藥
日內RSD/%
日間RSD/%
110
2.67
2.13
220
3.85
4.62
440
4.37
3.61
圖2 家兔一次性灌胃NCD(40 mg.kg-1)后
, 百拇醫(yī)藥
平均血藥濃度-時間曲線
4 討論
4.1 NCD屬弱堿性藥物，采用液-液萃取法提取血漿中的NCD，應特別注意提取介質酸堿度的控制。酸性條件下NCD易成鹽不利于有機溶劑提取，而且血漿蛋白干擾嚴重，影響色譜分離。經反復試驗，本文采用中性偏堿的提取條件，用0.05 mol.L-1磷酸鹽緩沖溶液(pH=7.4)控制提取介質的pH，使大部分NCD以分子形式存在，保證提取效率的同時減少了血漿蛋白的干擾。
4.2 萃取劑分別考察了醋酸乙酯、乙醚、正己烷、環(huán)己烷、環(huán)己烷與異丙醇混合液，結果醋酸乙酯對NCD提取效率不高。環(huán)己烷與異丙醇混合液的提取效率較好，只是在震蕩提取時易乳化，故在提取時應加入適量NaCl。
4.3 由方法學考察可見本法準確、靈敏、專一，可滿足對血藥濃度分析的要求。利用本法對NCD在家兔體內的藥代動力學進行了研究，結果表明對家兔一次性灌胃NCD后血漿C-t曲線呈一室一級模型。從藥代動力學參數可以看出，NCD原料藥給家兔灌胃后吸收較慢，存在一滯后時間(Log t=0.454 h)，達峰時間(tmax)為3.04 h；且消除半衰期較長(t1/2(Ke))為5.339 h，因此在連續(xù)給藥時應考慮NCD在體內的蓄積。
, 百拇醫(yī)藥
國家自然科學基金資助課題(批準號 39770856)
參考文獻
1，騰天申節(jié)譯，曾昭瑞校.第二代二氫吡啶類鈣離子拮抗劑.國外藥學.合成藥生化藥制劑分冊，1998，9(6)：334
2，齊美玲，王雅雯，鄭俊民等.尼卡地平緩釋片的含量測定方法研究.沈陽藥科大學學報，1996，13(1)：50
3，李克，張昕，趙飛浪等.高效液相色譜法測定人血漿中尼卡地平及藥代動力學參數.中國藥理學報，1998，29：197
(本文于1999年12月13日收到), 百拇醫(yī)藥