人血漿中鹽酸氟桂利嗪的HPLC測定及藥代動力學研究
作者:何海霞 周遠大 姚高瓊 朱治本
單位:何海霞 周遠大 姚高瓊 朱治本(重慶醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院臨床藥理研究室 重慶 400016)
關鍵詞:鹽酸氟桂利嗪;HPLC法;血藥濃度;藥代動力學
藥物分析雜志000305 摘要 目的:建立血漿中鹽酸氟桂利嗪濃度的反相HPLC測定法,并用此方法研究鹽酸氟桂利嗪在人體內(nèi)的藥代動力學。方法:內(nèi)標安定為內(nèi)標,血漿經(jīng)戊烷-異丙醇、鹽酸溶液、二氯甲烷等多步提取后,采用C18分析柱,以甲醇-水(含0.02 mol.L-1四丁基溴化銨)(74∶26)為流動相,流速為0.8 mL.min-1;在紫外254 nm處檢測。所得數(shù)據(jù)用3p87藥代動力學程序處理,求出有關的參數(shù)。結果:鹽酸氟桂利嗪在2.34~150 ng.mL-1范圍內(nèi)線性關系良好(r=0.998 5),最低檢測濃度2 ng.mL-1;平均回收率99.94%。應用本法對單劑量口服鹽酸氟桂利嗪后的藥代動力學進行了初步探討。結果表明藥時曲線符合一室藥動學模型,藥動學的主要參數(shù)t1/2(Ka)=1.61 h、t1/2(Ke)=4.09 h、tp=2.82 h、Cmax=59.54 ng.mL-1。結論:本方法以安定為內(nèi)標,靈敏、可靠,回收率高,結果準確,適用于臨床血藥濃度監(jiān)測及藥代動力學研究。
, http://www.www.srpcoatings.com
Determination of Flunarizine Hydrochloride in Human Plasma
by HPLC and Its Pharmacokinetics
He Haixia,Zhou Yuanda,Yao Gaoqiong,Zhu Zhiben
(Department of Clinical Pharmacology,the First Affiliated Hospital of Chongqing University of Medical Sciences,Chongqing 400016)
Abstract Objective:To establish a HPLC method for the determination of flunarizine hydrochloride in human plasma and investigate its pharmacokinetic characteristics dichloromethane in healthy volunteers after a single oral dose.Methods:The drug and internal standard(Diazepam,DZP)were extracted from plasma with n-pentane—iso-propyl alcohol,1 mol.L-1 hydrochloric acid,and then detected by UV detector at 254 nm with the C18 column and methanol-water (containing 0.02 mol.L-1 tetrabutyl ammonium bromide)(74∶26) as mobile phase at a flow rate of 0.8 mL.min-1.The data obtained were fitted with 3p87 program on computer.Result:The calibration curve was linear in the range of 2.34 and 150 ng.mL-1 with a correlation coefficient of 0.998 5.The limit of detection of flunarizine hydrochloride in plasma was 2 ng.mL-1.The mean recovery of flunarizine hydrochloride was 99.94% in plasma.This assay procedure has been applied to pharmacokinetic study of flunarizine hydrochloride.The results showed that the drug concentration-time profile conformed to the one-compartment model.The pharmacokinetic parameters were estimated as follows:t1/2(Ka)=1.61 h,t1/2(Ke)=4.09 h,tp=2.82 h,Cmax=59.54 ng.mL-1.Conclusion:The method was sensitive,precise and reliable. It is suitable for the monitoring of blood drug concentration and its pharmacokinetic studies.
, 百拇醫(yī)藥
Key words flunarizine hydrochloride,HPLC,blood drug concentration,pharmacokinetics
氟桂利嗪(氟腦嗪,腦靈,F(xiàn)lunarizine),化學名(E)-1-[雙(4-氟苯基)甲基]-4(2-丙烯-3-苯基)哌嗪,是一種哌嗪類鈣離子拮抗劑,其藥理及應用與桂利嗪(腦益嗪)相似,有擴張血管作用,對注意力減弱、記憶力障礙、平衡功能障礙、眩暈等均有一定療效。目前,國內(nèi)外有關該藥的血藥濃度測定方法均為HPLC法。本文參閱文獻[1,2],加以改進,尋找出適宜的內(nèi)標,建立了靈敏、準確的反相HPLC法測定人血漿中的鹽酸氟桂利嗪,并對單劑口服該藥后的藥代動力學進行了初步研究。
1 儀器及試藥
Bio-Rad高效液相色譜儀:1350泵系統(tǒng),1306UV檢測器,HP3392A數(shù)據(jù)處理機。
, 百拇醫(yī)藥
鹽酸氟桂利嗪膠囊(簡稱FZ),5 mg每粒(均以氟桂利嗪計),批號971202;鹽酸氟桂利嗪對照品(純度99.21%)均由重慶制藥七廠提供。安定(簡稱DZP)由湖北制藥廠生產(chǎn)。甲醇、四丁基溴化銨、戊烷、異丙醇、二氯甲烷、硼砂、硼酸等均為AR級;三蒸水。
2 色譜條件
色譜柱:μBondapak C18,10 μm,250 mm×4.6 mm;C18預柱:10 μm,28 mm×7 mm(大連化學物理研究所);柱溫:室溫;50 μL固定進樣環(huán);流動相:甲醇-水(含0.02 mol.L-1四丁基溴化銨)(74∶26),流速0.8 mL.min-1;紫外檢測波長:254 nm。內(nèi)標:DZP。
3 樣品處理
, 百拇醫(yī)藥
參照文獻[2],取受試者血漿1 mL于具塞離心管中,加DZP內(nèi)標液(以甲醇配制成濃度為1.08 μg .mL-1)20 μL,混合,加0.012 5 mol .L-1硼酸緩沖液(pH 8.5,0.2 mol .L-1硼砂45 mL與0.2 mol .L-1硼酸55 mL混合)1 mL,混勻,用戊烷-異丙醇(98∶2)4 mL提取2次,合并有機相,加1 mol.L-1鹽酸6 mL,混旋2 min后,棄去有機相,水層加10 mol.L-1氫氧化鈉溶液0.7 mL,混勻,用二氯甲烷4 mL混旋1 min提取2次,合并有機相,在50 ℃水浴用氮氣揮干,殘渣用100 μL流動相復溶,進樣50 μL。
4 實驗結果
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4.1 色譜條件的研究
4.1.1 流動相 參照文獻[2],對流動相加以改進。FZ的色譜行為對流動相中甲醇比例最為敏感。當流速恒定,甲醇比例為65%時,F(xiàn)Z的tR為17.70 min,甲醇為74%時,F(xiàn)Z的tR為7.16 min,甲醇為80%時,F(xiàn)Z的tR為6.5 min。當甲醇比例達到74%以上,拖尾現(xiàn)象顯著改善,峰形良好。
4.1.2 內(nèi)標 在選定的色譜條件上篩選內(nèi)標,曾試用多種內(nèi)標物,有的分離效果尚可,但經(jīng)提取回收率不佳,僅DZP為內(nèi)標最佳,兩方面均能兼顧。10.80,21.60,43.20 ng.mL-13種濃度DZP的平均回收率(%)±SD分別為92.00±7.21,94.77±3.88,95.60±2.89(n=5),F(xiàn)Z與DZP的分離圖譜見圖1-C。
4.2 色譜行為 分別取空白血漿和含F(xiàn)Z血漿,按樣品處理項下操作,記錄色譜圖(見圖1)。血漿中FZ的tR為7.2 min;內(nèi)標的tR為9.4 min,分離度好(R>2)。
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圖1 空白血漿(A)、空白血漿加DZP(B)、含DZP的血漿
樣品(C)、不含DZP的血漿樣品(D)的色譜圖
1.FZ 2.DZP
注:給藥后2 h的血漿樣品
4.3 方法學研究
4.3.1 線性關系與最低檢測濃度 在空白血漿中分別添加FZ使血藥濃度相當于2.34,4.69,9.38,18.75,37.5,75.0,150.0 ng.mL-1,按樣品處理項下進行測定,所得數(shù)據(jù)經(jīng)回歸,得標準曲線方程。FZ與DZP峰高比R與FZ濃度C(ng .mL-1)的關系為:
R=6.668×10-3C-8.126×10-3 r=0.998 5
, 百拇醫(yī)藥
最低檢測濃度2 ng.mL-1(信噪比>2)。
4.3.2 回收率、日內(nèi)及日間精密度 按照“4.3.1”項下方法,采用高、中、低3個濃度,評價本法的回收率及日內(nèi)、日間FZ與DZP峰高比值的RSD,見表1。
表1 HPLC法測定血漿中FZ含量的
回收率(n=3)及精密度(n=5) 濃度/ng .mL-1
回收率
±RSD/%
RSD/%
日內(nèi)
日間
, http://www.www.srpcoatings.com
2.34
104.0±9.24
9.29
11.09
18.75
99.25±4.26
4.56
8.41
150.00
96.59±4.29
4.58
5.64
, http://www.www.srpcoatings.com 4.4 藥代動力學研究 健康男性志愿者12名,年齡(22.33±1.15)歲,體重(60.50±5.0)kg,受試前1周未服任何藥物,經(jīng)心、肝、腎功能檢查均屬正常。受試者禁食12 h后空腹一次口服FZ膠囊25 mg,于服藥前及服藥后0.5,1.0,2.0,3.0,4.0,6.0,8.0,12.0,24.0 h取血,分離血漿,按前述血樣處理方法操作,計算血藥濃度。每例受試者血藥濃度-時間數(shù)據(jù)采用微機3p87程序自動擬合,結果表明口服FZ的藥時數(shù)據(jù)符合一室藥動學模型,見圖2;求得有關藥動學參數(shù)見表2。
圖2 12名受試者單劑口服FZ膠囊25 mg后的平均藥時曲線
表2 12名受試者單劑口服FZ膠囊25 mg后的
平均藥動學參數(shù) 參 數(shù)
±S
, 百拇醫(yī)藥
tlag/h
0.17±0.14
t1/2(Ka)/h
1.16±0.63
t1/2(Ke)/h
4.09±1.32
tp/h
2.82±0.72
Cmax/ng .mL-1
59.54±4.75
, 百拇醫(yī)藥
AUC0~24 h/μg .h.L-1
597.79±159.21
5 討論
文獻[1,2]報道FZ的定量均用外標法,根據(jù)內(nèi)標物選擇原則,對多種藥物進行了試驗。僅DZP既能出峰,又與FZ分離良好,且回收率高,用DZP作為FZ測定的內(nèi)標,國內(nèi)外尚未見報道。
本實驗曾在堿性環(huán)境下單用正己烷或二氯甲烷提取血漿中的FZ,但效果均不理想,2種萃取劑提取過程中均易發(fā)生乳化現(xiàn)象,且FZ回收率低;通過實踐,采用文獻[2]方法雖較繁瑣,但方法靈敏可靠、重現(xiàn)性好、回收率高,仍不失為一種較好的提取方法。
對藥代動力學的初步研究表明,口服FZ后在體內(nèi)藥動學過程用一室藥動學模型擬合最佳。表明該藥物吸收后能迅速在體內(nèi)分布,未見明顯的分布相,與國內(nèi)文獻[1,2]報道一致。該藥滯后時間短,表明膠囊劑在體內(nèi)崩解、溶出快,而后迅速吸收,于3 h左右達到血藥濃度峰值,其消除半衰期(t1/2(Ke))平均為(4.09±1.32)h,與謝林等的報道[1]基本一致[平均為(5.07±0.52)h及(4.82±0.36)h],而與曲福軍等報道[2]的t1/2(Ke)僅(2.64±1.39)h,(2.19±0.86)h,(2.28±0.88)h相差較大,作者認為與該文給藥后的采血時間較短(8.5 h)有關。
參考文獻
1,謝林,劉曉東,高旭等.人血漿中鹽酸氟桂利嗪HPLC測定及其藥代動力學.中國藥科大學學報,1995,26(5):300
2,曲福軍,夏軍,姜禮紅等.用反相HPLC法測定鹽酸氟桂利嗪膠囊在人體中的相對生物利用度.中國藥房,1997,8(4):173
(本文于1999年4月12日收到), 百拇醫(yī)藥
單位:何海霞 周遠大 姚高瓊 朱治本(重慶醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院臨床藥理研究室 重慶 400016)
關鍵詞:鹽酸氟桂利嗪;HPLC法;血藥濃度;藥代動力學
藥物分析雜志000305 摘要 目的:建立血漿中鹽酸氟桂利嗪濃度的反相HPLC測定法,并用此方法研究鹽酸氟桂利嗪在人體內(nèi)的藥代動力學。方法:內(nèi)標安定為內(nèi)標,血漿經(jīng)戊烷-異丙醇、鹽酸溶液、二氯甲烷等多步提取后,采用C18分析柱,以甲醇-水(含0.02 mol.L-1四丁基溴化銨)(74∶26)為流動相,流速為0.8 mL.min-1;在紫外254 nm處檢測。所得數(shù)據(jù)用3p87藥代動力學程序處理,求出有關的參數(shù)。結果:鹽酸氟桂利嗪在2.34~150 ng.mL-1范圍內(nèi)線性關系良好(r=0.998 5),最低檢測濃度2 ng.mL-1;平均回收率99.94%。應用本法對單劑量口服鹽酸氟桂利嗪后的藥代動力學進行了初步探討。結果表明藥時曲線符合一室藥動學模型,藥動學的主要參數(shù)t1/2(Ka)=1.61 h、t1/2(Ke)=4.09 h、tp=2.82 h、Cmax=59.54 ng.mL-1。結論:本方法以安定為內(nèi)標,靈敏、可靠,回收率高,結果準確,適用于臨床血藥濃度監(jiān)測及藥代動力學研究。
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Determination of Flunarizine Hydrochloride in Human Plasma
by HPLC and Its Pharmacokinetics
He Haixia,Zhou Yuanda,Yao Gaoqiong,Zhu Zhiben
(Department of Clinical Pharmacology,the First Affiliated Hospital of Chongqing University of Medical Sciences,Chongqing 400016)
Abstract Objective:To establish a HPLC method for the determination of flunarizine hydrochloride in human plasma and investigate its pharmacokinetic characteristics dichloromethane in healthy volunteers after a single oral dose.Methods:The drug and internal standard(Diazepam,DZP)were extracted from plasma with n-pentane—iso-propyl alcohol,1 mol.L-1 hydrochloric acid,and then detected by UV detector at 254 nm with the C18 column and methanol-water (containing 0.02 mol.L-1 tetrabutyl ammonium bromide)(74∶26) as mobile phase at a flow rate of 0.8 mL.min-1.The data obtained were fitted with 3p87 program on computer.Result:The calibration curve was linear in the range of 2.34 and 150 ng.mL-1 with a correlation coefficient of 0.998 5.The limit of detection of flunarizine hydrochloride in plasma was 2 ng.mL-1.The mean recovery of flunarizine hydrochloride was 99.94% in plasma.This assay procedure has been applied to pharmacokinetic study of flunarizine hydrochloride.The results showed that the drug concentration-time profile conformed to the one-compartment model.The pharmacokinetic parameters were estimated as follows:t1/2(Ka)=1.61 h,t1/2(Ke)=4.09 h,tp=2.82 h,Cmax=59.54 ng.mL-1.Conclusion:The method was sensitive,precise and reliable. It is suitable for the monitoring of blood drug concentration and its pharmacokinetic studies.
, 百拇醫(yī)藥
Key words flunarizine hydrochloride,HPLC,blood drug concentration,pharmacokinetics
氟桂利嗪(氟腦嗪,腦靈,F(xiàn)lunarizine),化學名(E)-1-[雙(4-氟苯基)甲基]-4(2-丙烯-3-苯基)哌嗪,是一種哌嗪類鈣離子拮抗劑,其藥理及應用與桂利嗪(腦益嗪)相似,有擴張血管作用,對注意力減弱、記憶力障礙、平衡功能障礙、眩暈等均有一定療效。目前,國內(nèi)外有關該藥的血藥濃度測定方法均為HPLC法。本文參閱文獻[1,2],加以改進,尋找出適宜的內(nèi)標,建立了靈敏、準確的反相HPLC法測定人血漿中的鹽酸氟桂利嗪,并對單劑口服該藥后的藥代動力學進行了初步研究。
1 儀器及試藥
Bio-Rad高效液相色譜儀:1350泵系統(tǒng),1306UV檢測器,HP3392A數(shù)據(jù)處理機。
, 百拇醫(yī)藥
鹽酸氟桂利嗪膠囊(簡稱FZ),5 mg每粒(均以氟桂利嗪計),批號971202;鹽酸氟桂利嗪對照品(純度99.21%)均由重慶制藥七廠提供。安定(簡稱DZP)由湖北制藥廠生產(chǎn)。甲醇、四丁基溴化銨、戊烷、異丙醇、二氯甲烷、硼砂、硼酸等均為AR級;三蒸水。
2 色譜條件
色譜柱:μBondapak C18,10 μm,250 mm×4.6 mm;C18預柱:10 μm,28 mm×7 mm(大連化學物理研究所);柱溫:室溫;50 μL固定進樣環(huán);流動相:甲醇-水(含0.02 mol.L-1四丁基溴化銨)(74∶26),流速0.8 mL.min-1;紫外檢測波長:254 nm。內(nèi)標:DZP。
3 樣品處理
, 百拇醫(yī)藥
參照文獻[2],取受試者血漿1 mL于具塞離心管中,加DZP內(nèi)標液(以甲醇配制成濃度為1.08 μg .mL-1)20 μL,混合,加0.012 5 mol .L-1硼酸緩沖液(pH 8.5,0.2 mol .L-1硼砂45 mL與0.2 mol .L-1硼酸55 mL混合)1 mL,混勻,用戊烷-異丙醇(98∶2)4 mL提取2次,合并有機相,加1 mol.L-1鹽酸6 mL,混旋2 min后,棄去有機相,水層加10 mol.L-1氫氧化鈉溶液0.7 mL,混勻,用二氯甲烷4 mL混旋1 min提取2次,合并有機相,在50 ℃水浴用氮氣揮干,殘渣用100 μL流動相復溶,進樣50 μL。
4 實驗結果
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4.1 色譜條件的研究
4.1.1 流動相 參照文獻[2],對流動相加以改進。FZ的色譜行為對流動相中甲醇比例最為敏感。當流速恒定,甲醇比例為65%時,F(xiàn)Z的tR為17.70 min,甲醇為74%時,F(xiàn)Z的tR為7.16 min,甲醇為80%時,F(xiàn)Z的tR為6.5 min。當甲醇比例達到74%以上,拖尾現(xiàn)象顯著改善,峰形良好。
4.1.2 內(nèi)標 在選定的色譜條件上篩選內(nèi)標,曾試用多種內(nèi)標物,有的分離效果尚可,但經(jīng)提取回收率不佳,僅DZP為內(nèi)標最佳,兩方面均能兼顧。10.80,21.60,43.20 ng.mL-13種濃度DZP的平均回收率(%)±SD分別為92.00±7.21,94.77±3.88,95.60±2.89(n=5),F(xiàn)Z與DZP的分離圖譜見圖1-C。
4.2 色譜行為 分別取空白血漿和含F(xiàn)Z血漿,按樣品處理項下操作,記錄色譜圖(見圖1)。血漿中FZ的tR為7.2 min;內(nèi)標的tR為9.4 min,分離度好(R>2)。
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圖1 空白血漿(A)、空白血漿加DZP(B)、含DZP的血漿
樣品(C)、不含DZP的血漿樣品(D)的色譜圖
1.FZ 2.DZP
注:給藥后2 h的血漿樣品
4.3 方法學研究
4.3.1 線性關系與最低檢測濃度 在空白血漿中分別添加FZ使血藥濃度相當于2.34,4.69,9.38,18.75,37.5,75.0,150.0 ng.mL-1,按樣品處理項下進行測定,所得數(shù)據(jù)經(jīng)回歸,得標準曲線方程。FZ與DZP峰高比R與FZ濃度C(ng .mL-1)的關系為:
R=6.668×10-3C-8.126×10-3 r=0.998 5
, 百拇醫(yī)藥
最低檢測濃度2 ng.mL-1(信噪比>2)。
4.3.2 回收率、日內(nèi)及日間精密度 按照“4.3.1”項下方法,采用高、中、低3個濃度,評價本法的回收率及日內(nèi)、日間FZ與DZP峰高比值的RSD,見表1。
表1 HPLC法測定血漿中FZ含量的
回收率(n=3)及精密度(n=5) 濃度/ng .mL-1
回收率
±RSD/%
RSD/%
日內(nèi)
日間
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2.34
104.0±9.24
9.29
11.09
18.75
99.25±4.26
4.56
8.41
150.00
96.59±4.29
4.58
5.64
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圖2 12名受試者單劑口服FZ膠囊25 mg后的平均藥時曲線
表2 12名受試者單劑口服FZ膠囊25 mg后的
平均藥動學參數(shù) 參 數(shù)
, 百拇醫(yī)藥
tlag/h
0.17±0.14
t1/2(Ka)/h
1.16±0.63
t1/2(Ke)/h
4.09±1.32
tp/h
2.82±0.72
Cmax/ng .mL-1
59.54±4.75
, 百拇醫(yī)藥
AUC0~24 h/μg .h.L-1
597.79±159.21
5 討論
文獻[1,2]報道FZ的定量均用外標法,根據(jù)內(nèi)標物選擇原則,對多種藥物進行了試驗。僅DZP既能出峰,又與FZ分離良好,且回收率高,用DZP作為FZ測定的內(nèi)標,國內(nèi)外尚未見報道。
本實驗曾在堿性環(huán)境下單用正己烷或二氯甲烷提取血漿中的FZ,但效果均不理想,2種萃取劑提取過程中均易發(fā)生乳化現(xiàn)象,且FZ回收率低;通過實踐,采用文獻[2]方法雖較繁瑣,但方法靈敏可靠、重現(xiàn)性好、回收率高,仍不失為一種較好的提取方法。
對藥代動力學的初步研究表明,口服FZ后在體內(nèi)藥動學過程用一室藥動學模型擬合最佳。表明該藥物吸收后能迅速在體內(nèi)分布,未見明顯的分布相,與國內(nèi)文獻[1,2]報道一致。該藥滯后時間短,表明膠囊劑在體內(nèi)崩解、溶出快,而后迅速吸收,于3 h左右達到血藥濃度峰值,其消除半衰期(t1/2(Ke))平均為(4.09±1.32)h,與謝林等的報道[1]基本一致[平均為(5.07±0.52)h及(4.82±0.36)h],而與曲福軍等報道[2]的t1/2(Ke)僅(2.64±1.39)h,(2.19±0.86)h,(2.28±0.88)h相差較大,作者認為與該文給藥后的采血時間較短(8.5 h)有關。
參考文獻
1,謝林,劉曉東,高旭等.人血漿中鹽酸氟桂利嗪HPLC測定及其藥代動力學.中國藥科大學學報,1995,26(5):300
2,曲福軍,夏軍,姜禮紅等.用反相HPLC法測定鹽酸氟桂利嗪膠囊在人體中的相對生物利用度.中國藥房,1997,8(4):173
(本文于1999年4月12日收到), 百拇醫(yī)藥