氣相色譜-質(zhì)譜法測定川芎哚血藥濃度
作者：唐剛?cè)A 姜國輝 王世真 鄭連芳
單位：唐剛?cè)A(第一軍醫(yī)大學(xué)南方醫(yī)院南方PET中心 廣州 510515)；姜國輝 王世真 鄭連芳(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院-中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)北京協(xié)和醫(yī)院核醫(yī)學(xué)科 北京 100730)
關(guān)鍵詞：川芎哚；藥代動力學(xué)；氣相色譜-質(zhì)譜
藥物分析雜志000301 摘要 目的：建立測定大鼠血漿樣品中川芎哚濃度的氣相色譜-質(zhì)譜(GC-MS)定量分析方法。方法：血漿樣品經(jīng)乙醚-異丙醇(10∶1)提取、硅烷化處理后，選擇GC-MS選擇性離子和輔助定量離子監(jiān)測。結(jié)果：本法線性范圍為2～60 ng.mL-1，靈敏度為1 ng.mL-1，回收率達82%，日內(nèi)日間RSD均小于9.0%。結(jié)論：本法為川芎哚臨床藥代動力學(xué)研究提供了準(zhǔn)確、可靠的方法。
, 百拇醫(yī)藥
Determination of Perlolyrine in Rat Plasma by GC-MS
Tang Ganghua
(Nanfang PET Centre,Nanfang Hospital,The First Military Medical University,Guangzhou 510515)
Jiang Guohui，Wang Shihzhen，Zheng Lianfang
(Department of Nuclear Medicine,PUMC Hospital,CAMS and PUMC,Beijing 100730)
Abstract Objective：To develop a method for the determination of perlolyrine in rat plasma using GC-MS. Methods:Perlolyrine in plasma was extracted with ethyl ether—iso-propyl alcohol and determined by means of GC-MS with selected ion and qualifier ion monitoring.Results:The standard curve was linear between 2～60 ng.mL-1 and the minimum detection limit was 1 ng.mL-1.The recovery of perlolyrine in plasma was above 82% and the relative standard deviation (RSD) less than 9.0%.Conclusion:It provided an important method for the determination of clinical pharmacokinetics.
, 百拇醫(yī)藥
Key words perlolyrine,pharmacokinetics,GC-MS
川芎哚(川芎Ⅲ號堿，perlolyrine)是中藥川芎(Ligusticum wallichii Franch)中的一種有效活性生物堿，其化學(xué)結(jié)構(gòu)為1-(5-羥甲基-2-呋喃基)-9H-吡啶并[3，4-b]吲哚[1,2],藥理實驗證明川芎哚對冠心病有一定的療效作用[3]。為了探討川芎哚在動物體內(nèi)的代謝動力學(xué)，本文建立了靈敏度高，特異性好的GC-MS選擇離子(SIM)外標(biāo)方法，該方法由MS化學(xué)工作站監(jiān)測川芎哚的靶離子(Target Ion)和輔助定量離子(Qualifier Ion)[4]，其靈敏度可達1 ng.mL-1。該法適于川芎哚動物體內(nèi)藥代動力學(xué)參數(shù)的測定，同時也為川芎哚臨床藥代動力學(xué)研究提供了重要的方法。
1 儀器與試藥
, 百拇醫(yī)藥
1.1 儀器 HP-5890Ⅱ/5971A型氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(GC-MS)。
1.2 試藥 川芎哚、[2-15N]-1-(5-羥甲基-2-呋喃基)-9H-吡啶并[3,4-b]吲哚([2-15N]川芎哚)(自制)；N-甲基-N-(三甲基硅烷)三氟乙酰胺(MSTFA)(Gemany 產(chǎn)，分析純)；緩沖溶液：0.2 mol.mL-1碳酸鈉-0.2 mol.L-1硼酸(含0.2 mol.L-1氯化鉀)-水(57∶43∶100)，調(diào)pH=8～9；其它試劑均為國產(chǎn)分析純。
1.3 實驗動物 Wistar大鼠，雌雄兼用，體重(200±20)g(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物中心)。
2 方法與結(jié)果
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2.1 GC-MS分析條件 毛細管氣相色譜柱HP-1(12 m×0.22 mm×0.33 μm)，載氣：氦氣，流速1.0 mL.min-1，進樣口溫度：250 ℃，檢測器溫度：280 ℃，進樣方式：不分流進樣，柱升溫程序：起始溫度70 ℃，停留1 min后，以15 ℃.min-1速率升溫至300 ℃，保持15 min，進樣量為1 μL，電離方式為EI，電子轟擊能量為70 eV。
2.2 生物樣品的制備 從大鼠頸靜脈采血約3 mL，以肝素抗凝，離心分離血漿，取血漿1 mL，加入氯化鈉0.5 g及碳酸鈉-硼酸-氯化鉀緩沖液1 mL，振蕩1 min，加入抽提液乙醚-異丙醇(10∶1)1 mL，振蕩5 min，離心10 min，取上清液，氮氣吹干，用注射器加入MSTFA 20 μL，70 ℃反應(yīng)30 min，取1 μL進樣。GC-MS法對川芎哚有較好的分離鑒別效果，圖1為川芎哚質(zhì)譜圖，川芎哚TMS衍生物的分子離子峰為m/z 336，碎片基峰為m/z 247，為提高檢測靈敏度和準(zhǔn)確度，選擇m/z 247為靶離子和m/z 336為輔助定量離子。
, 百拇醫(yī)藥
圖1 川芎哚的質(zhì)譜圖
2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線制備 用大鼠空白血漿溶液配制濃度分別為2，5，10，20，30，60 ng.mL-1的川芎哚標(biāo)準(zhǔn)溶液，按生物樣品制備方法提取測定，制備標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果表明，川芎哚在2～60 ng.mL-1范圍內(nèi)，響應(yīng)值與濃度呈良好的線性關(guān)系，回歸方程：
Y=1.24×104X-8.32×102 r=0.996 0
信噪比S/N=3時，最低檢測濃度為1 ng.mL-1。
2.4 回收率試驗 取大鼠空白血漿溶液配制低、中、高3種濃度(2，10，30 ng.mL-1)各5管，按上法制備樣品進樣，以3個濃度不經(jīng)抽提為標(biāo)準(zhǔn)對照，計算回收率，得3種濃度的回收率(RSD)分別為82.52%(5.50%)；83.46%(3.69%)；87.18%(0.52%)。
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2.5 精密度
2.5.1 日內(nèi)重復(fù)性 取大鼠空白血漿溶液配制低、中、高3種濃度(2，10，30 ng.mL-1)，按上法制備樣品進樣，在1 d內(nèi)分別重復(fù)進樣5次，得3種濃度的日內(nèi)重復(fù)性(RSD)分別為1.94 ng.mL-1(7.22%)；9.82 ng.mL-1(6.21%)；30.12 ng.mL-1(2.36%)。
2.5.2 日間重復(fù)性 取空白血漿溶液配制低、中、高3種濃度(2，10，30 ng.mL-1)，按上法制備樣品進樣，在5 d內(nèi)分別每天1次重復(fù)進樣，得3種濃度的日間重復(fù)性RSD分別為1.92 ng.mL-1(8.85%)；9.91 ng.mL-1(6.86%)；29.98 ng.mL-1(7.61%)。
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2.6 川芎哚的血藥濃度測定 36只大鼠分為9組，每組為4只大鼠，分別灌胃給予川芎哚0.5 mg.kg-1后，于0.083，0.25，0.5，1，2，4，6，8，12 h時從頸靜脈采血3 mL，按生物樣品制備方法提取測定。大鼠灌胃后平均血藥濃度-時間曲線見圖2。
3 討論
川芎哚的揮發(fā)性和熱穩(wěn)定性較差，直接進樣由于低的揮發(fā)性和熱分解，重現(xiàn)性差，檢出靈敏度低。經(jīng)MSTFA衍生化后，川芎哚衍生物有一定的揮發(fā)性和穩(wěn)定性，能產(chǎn)生良好的色譜和質(zhì)譜圖，檢測受其它干擾少。
圖2 川芎哚的血藥濃度-時間曲線
川芎哚藥代動力學(xué)研究已有文獻報道[3]，但使用的是放射性同位素示蹤法，不適于臨床藥代動力學(xué)研究。本文建立的GC-MS選擇離子監(jiān)測，外標(biāo)定量方法，專一性好，靈敏度高，可以用于臨床藥代動力學(xué)研究，所以本研究為川芎哚臨床藥代動力學(xué)研究提供了可靠的方法。但本法提取回收率和重現(xiàn)性不是很理想，為保證方法有較好的重現(xiàn)性和準(zhǔn)確性，要不斷對標(biāo)準(zhǔn)曲線進行校正，在監(jiān)測靶離子(m/z 247)時，必須同時監(jiān)測輔助定量離子(m/z 336)，確定2者峰高的比例范圍[100∶(39.86～51.34)]，其目的是確保未知樣品的檢測分析在此比例范圍內(nèi)，從而保證結(jié)果的準(zhǔn)確性。本法測定結(jié)果與以[2-15N]川芎哚為內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)的內(nèi)標(biāo)法結(jié)果基本一致。
, http://www.www.srpcoatings.com
參考文獻
1，唐剛?cè)A，王世真，吳淑琴等.川芎哚的有機合成研究.中國藥學(xué)雜志，1998，33(8)：492
2，Tang Ganghua,Wang Shihzhen,Wu Shuqin,et al.Syntheses of dl-α-15N-tryptophan and 2-15N-perlolyrine.J Labelled Compd Radiopharm,1998，41(2):139
3，華英圣，馬桂華，劉麗波等.川芎Ⅲ號堿藥理作用的初步研究.中醫(yī)藥學(xué)報，1989，(2)：40
4，喬建忠，袁淑蘭，張振清.氣相色譜-質(zhì)譜法測定人血漿中丁螺環(huán)酮濃度.藥物分析雜志，1996，16(6)：370
(本文于1999年5月2日收到), 百拇醫(yī)藥
單位：唐剛?cè)A(第一軍醫(yī)大學(xué)南方醫(yī)院南方PET中心 廣州 510515)；姜國輝 王世真 鄭連芳(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院-中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)北京協(xié)和醫(yī)院核醫(yī)學(xué)科 北京 100730)
關(guān)鍵詞：川芎哚；藥代動力學(xué)；氣相色譜-質(zhì)譜
藥物分析雜志000301 摘要 目的：建立測定大鼠血漿樣品中川芎哚濃度的氣相色譜-質(zhì)譜(GC-MS)定量分析方法。方法：血漿樣品經(jīng)乙醚-異丙醇(10∶1)提取、硅烷化處理后，選擇GC-MS選擇性離子和輔助定量離子監(jiān)測。結(jié)果：本法線性范圍為2～60 ng.mL-1，靈敏度為1 ng.mL-1，回收率達82%，日內(nèi)日間RSD均小于9.0%。結(jié)論：本法為川芎哚臨床藥代動力學(xué)研究提供了準(zhǔn)確、可靠的方法。
, 百拇醫(yī)藥
Determination of Perlolyrine in Rat Plasma by GC-MS
Tang Ganghua
(Nanfang PET Centre,Nanfang Hospital,The First Military Medical University,Guangzhou 510515)
Jiang Guohui，Wang Shihzhen，Zheng Lianfang
(Department of Nuclear Medicine,PUMC Hospital,CAMS and PUMC,Beijing 100730)
Abstract Objective：To develop a method for the determination of perlolyrine in rat plasma using GC-MS. Methods:Perlolyrine in plasma was extracted with ethyl ether—iso-propyl alcohol and determined by means of GC-MS with selected ion and qualifier ion monitoring.Results:The standard curve was linear between 2～60 ng.mL-1 and the minimum detection limit was 1 ng.mL-1.The recovery of perlolyrine in plasma was above 82% and the relative standard deviation (RSD) less than 9.0%.Conclusion:It provided an important method for the determination of clinical pharmacokinetics.
, 百拇醫(yī)藥
Key words perlolyrine,pharmacokinetics,GC-MS
川芎哚(川芎Ⅲ號堿，perlolyrine)是中藥川芎(Ligusticum wallichii Franch)中的一種有效活性生物堿，其化學(xué)結(jié)構(gòu)為1-(5-羥甲基-2-呋喃基)-9H-吡啶并[3，4-b]吲哚[1,2],藥理實驗證明川芎哚對冠心病有一定的療效作用[3]。為了探討川芎哚在動物體內(nèi)的代謝動力學(xué)，本文建立了靈敏度高，特異性好的GC-MS選擇離子(SIM)外標(biāo)方法，該方法由MS化學(xué)工作站監(jiān)測川芎哚的靶離子(Target Ion)和輔助定量離子(Qualifier Ion)[4]，其靈敏度可達1 ng.mL-1。該法適于川芎哚動物體內(nèi)藥代動力學(xué)參數(shù)的測定，同時也為川芎哚臨床藥代動力學(xué)研究提供了重要的方法。
1 儀器與試藥
, 百拇醫(yī)藥
1.1 儀器 HP-5890Ⅱ/5971A型氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(GC-MS)。
1.2 試藥 川芎哚、[2-15N]-1-(5-羥甲基-2-呋喃基)-9H-吡啶并[3,4-b]吲哚([2-15N]川芎哚)(自制)；N-甲基-N-(三甲基硅烷)三氟乙酰胺(MSTFA)(Gemany 產(chǎn)，分析純)；緩沖溶液：0.2 mol.mL-1碳酸鈉-0.2 mol.L-1硼酸(含0.2 mol.L-1氯化鉀)-水(57∶43∶100)，調(diào)pH=8～9；其它試劑均為國產(chǎn)分析純。
1.3 實驗動物 Wistar大鼠，雌雄兼用，體重(200±20)g(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物中心)。
2 方法與結(jié)果
, http://www.www.srpcoatings.com
2.1 GC-MS分析條件 毛細管氣相色譜柱HP-1(12 m×0.22 mm×0.33 μm)，載氣：氦氣，流速1.0 mL.min-1，進樣口溫度：250 ℃，檢測器溫度：280 ℃，進樣方式：不分流進樣，柱升溫程序：起始溫度70 ℃，停留1 min后，以15 ℃.min-1速率升溫至300 ℃，保持15 min，進樣量為1 μL，電離方式為EI，電子轟擊能量為70 eV。
2.2 生物樣品的制備 從大鼠頸靜脈采血約3 mL，以肝素抗凝，離心分離血漿，取血漿1 mL，加入氯化鈉0.5 g及碳酸鈉-硼酸-氯化鉀緩沖液1 mL，振蕩1 min，加入抽提液乙醚-異丙醇(10∶1)1 mL，振蕩5 min，離心10 min，取上清液，氮氣吹干，用注射器加入MSTFA 20 μL，70 ℃反應(yīng)30 min，取1 μL進樣。GC-MS法對川芎哚有較好的分離鑒別效果，圖1為川芎哚質(zhì)譜圖，川芎哚TMS衍生物的分子離子峰為m/z 336，碎片基峰為m/z 247，為提高檢測靈敏度和準(zhǔn)確度，選擇m/z 247為靶離子和m/z 336為輔助定量離子。
, 百拇醫(yī)藥
圖1 川芎哚的質(zhì)譜圖
2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線制備 用大鼠空白血漿溶液配制濃度分別為2，5，10，20，30，60 ng.mL-1的川芎哚標(biāo)準(zhǔn)溶液，按生物樣品制備方法提取測定，制備標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果表明，川芎哚在2～60 ng.mL-1范圍內(nèi)，響應(yīng)值與濃度呈良好的線性關(guān)系，回歸方程：
Y=1.24×104X-8.32×102 r=0.996 0
信噪比S/N=3時，最低檢測濃度為1 ng.mL-1。
2.4 回收率試驗 取大鼠空白血漿溶液配制低、中、高3種濃度(2，10，30 ng.mL-1)各5管，按上法制備樣品進樣，以3個濃度不經(jīng)抽提為標(biāo)準(zhǔn)對照，計算回收率，得3種濃度的回收率(RSD)分別為82.52%(5.50%)；83.46%(3.69%)；87.18%(0.52%)。
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2.5 精密度
2.5.1 日內(nèi)重復(fù)性 取大鼠空白血漿溶液配制低、中、高3種濃度(2，10，30 ng.mL-1)，按上法制備樣品進樣，在1 d內(nèi)分別重復(fù)進樣5次，得3種濃度的日內(nèi)重復(fù)性(RSD)分別為1.94 ng.mL-1(7.22%)；9.82 ng.mL-1(6.21%)；30.12 ng.mL-1(2.36%)。
2.5.2 日間重復(fù)性 取空白血漿溶液配制低、中、高3種濃度(2，10，30 ng.mL-1)，按上法制備樣品進樣，在5 d內(nèi)分別每天1次重復(fù)進樣，得3種濃度的日間重復(fù)性RSD分別為1.92 ng.mL-1(8.85%)；9.91 ng.mL-1(6.86%)；29.98 ng.mL-1(7.61%)。
, http://www.www.srpcoatings.com
2.6 川芎哚的血藥濃度測定 36只大鼠分為9組，每組為4只大鼠，分別灌胃給予川芎哚0.5 mg.kg-1后，于0.083，0.25，0.5，1，2，4，6，8，12 h時從頸靜脈采血3 mL，按生物樣品制備方法提取測定。大鼠灌胃后平均血藥濃度-時間曲線見圖2。
3 討論
川芎哚的揮發(fā)性和熱穩(wěn)定性較差，直接進樣由于低的揮發(fā)性和熱分解，重現(xiàn)性差，檢出靈敏度低。經(jīng)MSTFA衍生化后，川芎哚衍生物有一定的揮發(fā)性和穩(wěn)定性，能產(chǎn)生良好的色譜和質(zhì)譜圖，檢測受其它干擾少。
圖2 川芎哚的血藥濃度-時間曲線
川芎哚藥代動力學(xué)研究已有文獻報道[3]，但使用的是放射性同位素示蹤法，不適于臨床藥代動力學(xué)研究。本文建立的GC-MS選擇離子監(jiān)測，外標(biāo)定量方法，專一性好，靈敏度高，可以用于臨床藥代動力學(xué)研究，所以本研究為川芎哚臨床藥代動力學(xué)研究提供了可靠的方法。但本法提取回收率和重現(xiàn)性不是很理想，為保證方法有較好的重現(xiàn)性和準(zhǔn)確性，要不斷對標(biāo)準(zhǔn)曲線進行校正，在監(jiān)測靶離子(m/z 247)時，必須同時監(jiān)測輔助定量離子(m/z 336)，確定2者峰高的比例范圍[100∶(39.86～51.34)]，其目的是確保未知樣品的檢測分析在此比例范圍內(nèi)，從而保證結(jié)果的準(zhǔn)確性。本法測定結(jié)果與以[2-15N]川芎哚為內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)的內(nèi)標(biāo)法結(jié)果基本一致。
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參考文獻
1，唐剛?cè)A，王世真，吳淑琴等.川芎哚的有機合成研究.中國藥學(xué)雜志，1998，33(8)：492
2，Tang Ganghua,Wang Shihzhen,Wu Shuqin,et al.Syntheses of dl-α-15N-tryptophan and 2-15N-perlolyrine.J Labelled Compd Radiopharm,1998，41(2):139
3，華英圣，馬桂華，劉麗波等.川芎Ⅲ號堿藥理作用的初步研究.中醫(yī)藥學(xué)報，1989，(2)：40
4，喬建忠，袁淑蘭，張振清.氣相色譜-質(zhì)譜法測定人血漿中丁螺環(huán)酮濃度.藥物分析雜志，1996，16(6)：370
(本文于1999年5月2日收到), 百拇醫(yī)藥