二氧化氮對肺組織勻漿某些生化指標(biāo)的影響
作者:宋蔚忠 夏亞東 郭緒益 聞思真
單位:宋蔚忠(軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院毒物藥物研究所二室 (北京 100850));夏亞東(軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院毒物藥物研究所二室 (北京 100850));郭緒益(軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院毒物藥物研究所二室 (北京 100850));聞思真(軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院毒物藥物研究所二室 (北京 100850))
關(guān)鍵詞:
衛(wèi)生毒理學(xué)雜志000411 二氧化氮(NO2)是氮氧化物在空氣中的主要存在形式,是城市環(huán)境污染物的重要組成部分,可誘發(fā)肺組織損傷。但致肺損傷的機(jī)理尚不十分清楚。NO2本身是自由基,可能通過脂質(zhì)過氧化作用破壞肺組織細(xì)胞[1]。但在動物實(shí)驗(yàn),實(shí)驗(yàn)條件不同,結(jié)果也不一致。本實(shí)驗(yàn)在體外直接觀察NO2對肺勻漿某些生化指標(biāo)的影響。
, http://www.www.srpcoatings.com
1 材料與方法
1.1 肺勻漿制備
健康雄性Wistar大鼠,體重200±20g,股動脈放血處死,取肺組織,除去支氣管和大血管,在冰浴中制備10%肺勻漿。勻漿液為:0.9%生理鹽水+50mmol磷酸鹽緩沖液(pH7.4)+0.001mol EDTA。肺勻漿制備后,立即500r/min離心10min,取上層液3.0ml加入直徑為6.0cm的玻璃培養(yǎng)皿內(nèi),使勻漿液在培養(yǎng)皿底部均勻形成一薄層。
1.2 染毒
液態(tài)NO4由航天工業(yè)總公司第一研究院101所提供,純度大于99.5%,比重為1.45g/cm3,冰點(diǎn)-12.2℃,沸點(diǎn)21.1℃。四氧化二氮在空氣中迅速揮發(fā)分解,以NO2形式存在。
, 百拇醫(yī)藥 把裝有肺勻漿的培養(yǎng)皿放于染毒柜內(nèi),用微量注射器抽取一定體積的液態(tài)四氧化二氮注入染毒柜,風(fēng)扇混勻,用二氧化氮監(jiān)測儀(上海電光器件廠,2000系列2150型)監(jiān)測柜內(nèi)濃度。設(shè)43.0、88.8、127.9mg/m3三個染毒濃度組,各組染毒時(shí)間均為30min。
1.3 測定指標(biāo)及方法
丙二醛(MDA)測定采用硫代巴比妥酸法[2]。標(biāo)準(zhǔn)品為1,1,3,3-四乙氧基丙烷(Fluka公司)。谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)測定按TNB直接法[3]。GSH-Px比活力單位(u):規(guī)定為每0.1g組織每分鐘扣除非酶反應(yīng),使GSH濃度降低1u mol為一個酶活力單位。維生素E(VE)測定采用熒光法[4]。總巰基測定參見Ellman法[5]。
1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理
, http://www.www.srpcoatings.com
用t檢驗(yàn)。
2 結(jié)果
2.1 NO2對肺勻漿某些抗氧化指標(biāo)的影響
如表1所示,肺勻漿中GSH-Px,VE及總巰基的含量均顯著降低,且具有明顯的劑量-反應(yīng)關(guān)系,表現(xiàn)染毒濃度越高,下降越明顯。
表1 NO2對肺勻漿GSH-Px,VE及總巰基的影響(
±s)
NO2
(mg/m3)
, 百拇醫(yī)藥
n
GSH-Px
(u/g)
VE
(μg/g)
總巰基
(μmol/g)
對照組
4
388.5±12.0
6.9±0.2
9.5±0.3
, 百拇醫(yī)藥 43.0
4
260.0± 6.8**
5.3±0.6**
7.3±0.2**
88.8
4
208.8±11.7**
5.9±0.5*
5.5±0.4**
127.9
, 百拇醫(yī)藥
4
121.4±15.2**
5.6±0.7*
4.2±0.1**
與對照組比較,*P<0.05 * *P<0.01
2.2 NO2對肺勻漿MDA含量的影響
由表2可見,MDA含量顯著下降,且具有明顯的劑量-反應(yīng)關(guān)系,表現(xiàn)隨染毒劑量增加,降低更為明顯。
表2 NO2對肺勻漿MDA含量的影響(
±s)
, 百拇醫(yī)藥
NO2(mg/m3)
n
MDA(nmol/g)
對照組
3
109.6±3.0
43.0
3
103.0±1.2*
88.8
3
98.4±2.0**
, 百拇醫(yī)藥
127.9
3
93.8±2.3**
與對照組比較,*P<0.05 * *P<0.01
2.3 NO-2或NO-3對肺勻漿中MDA含量的影響
NO2在肺組織中最終產(chǎn)物為NO-2和NO-3,為探討NO2使肺勻漿MDA下降是否與其代謝產(chǎn)物有關(guān)及對MDA測定方法的影響,作了如下觀察。
在肺勻漿中加入NO-2或NO-3,對照組加入等量蒸餾水,測定MDA的含量,結(jié)果如表3所示,NO-2可使肺勻漿MDA含量降低,肺勻漿中NO-2濃度越高,MDA含量越低,NO-3對肺勻漿MDA含量無影響。
, 百拇醫(yī)藥
表3 NO-2和NO-3對肺勻漿MDA含量的影響(
±s)
組別
n
濃度(μmol)
MDA(nmol/g)
對照
3
0
109.6±3.0
, 百拇醫(yī)藥
NO-2
3
0.3
108.9±2.2
NO-2
3
0.75
102.3±2.0**
NO-2
3
1.5
, 百拇醫(yī)藥
94.5±2.0**
NO-2
3
3.0
87.3±1.2**
NO-3
3
0.75
110.2±9.0
NO-3
3
, 百拇醫(yī)藥
3.0
114.2±5.2
與對照組比較,* *P<0.01
測定生物樣品中MDA的原理是:過氧化脂質(zhì)的分解產(chǎn)物MDA與TBA反應(yīng),產(chǎn)生粉紅色呈色物,通過測定呈色物的量反應(yīng)MDA的量。因1,1,3,3-四乙氧基丙烷(TEP)與過氧化脂質(zhì)同樣分解產(chǎn)生MDA,因此用TEP作標(biāo)準(zhǔn)品定量。在本實(shí)驗(yàn)中把NO-2加入TEP溶液,觀察NO-2對MDA與TBA反應(yīng)的影響,結(jié)果如表4所示,加入NO-2對標(biāo)準(zhǔn)管的吸收率值無影響。
表4 NO2對TEP與TBA反應(yīng)吸光度的影響(
±s)
, 百拇醫(yī)藥
組 別
n
AD值
TEP
3
0.127±0.002
TEP+NO-2(0.75μmol)
3
0.126±0.002
TEP+NO-2(3.0μmol)
3
, http://www.www.srpcoatings.com
0.125±0.002
3 討論
自由基能攻擊膜的多不飽和脂肪酸,引發(fā)脂質(zhì)過氧化,影響膜的功能,導(dǎo)致線粒體和溶酶體膜受損,蛋白水解酶釋出。機(jī)體具有抗氧化防御系統(tǒng),使自由基的產(chǎn)生和清除保持平衡,使機(jī)體不致遭到損害。如果內(nèi)源性自由基生成過多或外源性自由基的參與,破壞了體內(nèi)自由基生成和清除之間的平衡,脂質(zhì)過氧化作用不能及時(shí)被終止,產(chǎn)物在體內(nèi)蓄積,就可造成組織細(xì)胞的損傷。
NO2本身是自由基,在體外化學(xué)反應(yīng)體系,它能與不飽和脂肪酸反應(yīng),啟動脂質(zhì)過氧化[6]。但在整體實(shí)驗(yàn),實(shí)驗(yàn)條件不同,結(jié)果也不一致。本文觀察在體外肺勻漿接觸NO2后脂質(zhì)過氧化的變化,排除了整體動物實(shí)驗(yàn)時(shí)機(jī)體復(fù)雜的防御系統(tǒng)及產(chǎn)物轉(zhuǎn)運(yùn)的影響,更直接的反應(yīng)了NO2的作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,肺勻漿接觸NO2后,抗氧化酶及抗氧化劑含量均顯著下降,表明NO2可直接損傷肺組織的抗氧化系統(tǒng),使其抗氧化能力下降,細(xì)胞易于受到自由基的攻擊,這在NO2致肺損傷中可能起一定作用。
, http://www.www.srpcoatings.com
本研究中,肺勻漿接觸NO2后,MDA含量明顯降低,這是一個較為反常的現(xiàn)象。Sagai等[7]也曾報(bào)道,大鼠NO2染毒后,肺組織MDA含量及呼出氣中乙烷含量均顯著降低。NO2與肺組織細(xì)胞成分反應(yīng),其轉(zhuǎn)化產(chǎn)物主要是NO-2和NO-3[8]。本實(shí)驗(yàn)中NO-2使肺勻漿MDA含量降低,但對MDA與TBA的反應(yīng)無影響,即NO-2使MDA下降不是由于測定方法的原因。
參考文獻(xiàn)
1,Mayorga MA.Overview of nitrogen dioxide effects on the lung with emphasis on military relevance.Toxicology,1994,89:176.
, 百拇醫(yī)藥
2,Ohkawa H, Ohishi N,Yagi K. Assay for lipid peroxides in animals tissues by thiobarbituric acid reaction.Analyt Biochem,1979,95:351-358.
3,夏奕明,朱蓮珍.血和組織中谷胱甘肽過氧化物酶活力的測定方法.衛(wèi)生研究,1987,16(4):29-33.
4,候少范,朱振源.生物材料中生育酚的熒光測定法.分析化學(xué),1982,10(9):535-539.
5,Ellman GL. Tissue sulfhydryl groups.Arch Biochem Biophys,1959,82:70.
6,Pryor WA and Lightsey JW. Mechnism of nitrgen dioxide reactions:intiation of lipid peroxidation and the production of nitrous acid.Science,1981,214:435-437.
, 百拇醫(yī)藥
7,Sagai M, lchinose T, Oda H, et al. Studies on biochemical effects of nitrogen dioxide.Ⅱ. Changes of the protective systems in rat lungs and of lipid peroxidation by acute exposure.J Toxicol Environ Health,1982,9:153-164.
8,Postlethwait EM, Bidani A. Pulmonary diposition of inhaled NO2-Nitrogen in isolated rat lungs.Toxixol Appl Pharmacol,1989,98:303-312.
(收稿:1999-01-04), 百拇醫(yī)藥
單位:宋蔚忠(軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院毒物藥物研究所二室 (北京 100850));夏亞東(軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院毒物藥物研究所二室 (北京 100850));郭緒益(軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院毒物藥物研究所二室 (北京 100850));聞思真(軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院毒物藥物研究所二室 (北京 100850))
關(guān)鍵詞:
衛(wèi)生毒理學(xué)雜志000411 二氧化氮(NO2)是氮氧化物在空氣中的主要存在形式,是城市環(huán)境污染物的重要組成部分,可誘發(fā)肺組織損傷。但致肺損傷的機(jī)理尚不十分清楚。NO2本身是自由基,可能通過脂質(zhì)過氧化作用破壞肺組織細(xì)胞[1]。但在動物實(shí)驗(yàn),實(shí)驗(yàn)條件不同,結(jié)果也不一致。本實(shí)驗(yàn)在體外直接觀察NO2對肺勻漿某些生化指標(biāo)的影響。
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1 材料與方法
1.1 肺勻漿制備
健康雄性Wistar大鼠,體重200±20g,股動脈放血處死,取肺組織,除去支氣管和大血管,在冰浴中制備10%肺勻漿。勻漿液為:0.9%生理鹽水+50mmol磷酸鹽緩沖液(pH7.4)+0.001mol EDTA。肺勻漿制備后,立即500r/min離心10min,取上層液3.0ml加入直徑為6.0cm的玻璃培養(yǎng)皿內(nèi),使勻漿液在培養(yǎng)皿底部均勻形成一薄層。
1.2 染毒
液態(tài)NO4由航天工業(yè)總公司第一研究院101所提供,純度大于99.5%,比重為1.45g/cm3,冰點(diǎn)-12.2℃,沸點(diǎn)21.1℃。四氧化二氮在空氣中迅速揮發(fā)分解,以NO2形式存在。
, 百拇醫(yī)藥 把裝有肺勻漿的培養(yǎng)皿放于染毒柜內(nèi),用微量注射器抽取一定體積的液態(tài)四氧化二氮注入染毒柜,風(fēng)扇混勻,用二氧化氮監(jiān)測儀(上海電光器件廠,2000系列2150型)監(jiān)測柜內(nèi)濃度。設(shè)43.0、88.8、127.9mg/m3三個染毒濃度組,各組染毒時(shí)間均為30min。
1.3 測定指標(biāo)及方法
丙二醛(MDA)測定采用硫代巴比妥酸法[2]。標(biāo)準(zhǔn)品為1,1,3,3-四乙氧基丙烷(Fluka公司)。谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)測定按TNB直接法[3]。GSH-Px比活力單位(u):規(guī)定為每0.1g組織每分鐘扣除非酶反應(yīng),使GSH濃度降低1u mol為一個酶活力單位。維生素E(VE)測定采用熒光法[4]。總巰基測定參見Ellman法[5]。
1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理
, http://www.www.srpcoatings.com
用t檢驗(yàn)。
2 結(jié)果
2.1 NO2對肺勻漿某些抗氧化指標(biāo)的影響
如表1所示,肺勻漿中GSH-Px,VE及總巰基的含量均顯著降低,且具有明顯的劑量-反應(yīng)關(guān)系,表現(xiàn)染毒濃度越高,下降越明顯。
表1 NO2對肺勻漿GSH-Px,VE及總巰基的影響(
NO2
(mg/m3)
, 百拇醫(yī)藥
n
GSH-Px
(u/g)
VE
(μg/g)
總巰基
(μmol/g)
對照組
4
388.5±12.0
6.9±0.2
9.5±0.3
, 百拇醫(yī)藥 43.0
4
260.0± 6.8**
5.3±0.6**
7.3±0.2**
88.8
4
208.8±11.7**
5.9±0.5*
5.5±0.4**
127.9
, 百拇醫(yī)藥
4
121.4±15.2**
5.6±0.7*
4.2±0.1**
與對照組比較,*P<0.05 * *P<0.01
2.2 NO2對肺勻漿MDA含量的影響
由表2可見,MDA含量顯著下降,且具有明顯的劑量-反應(yīng)關(guān)系,表現(xiàn)隨染毒劑量增加,降低更為明顯。
表2 NO2對肺勻漿MDA含量的影響(
, 百拇醫(yī)藥
NO2(mg/m3)
n
MDA(nmol/g)
對照組
3
109.6±3.0
43.0
3
103.0±1.2*
88.8
3
98.4±2.0**
, 百拇醫(yī)藥
127.9
3
93.8±2.3**
與對照組比較,*P<0.05 * *P<0.01
2.3 NO-2或NO-3對肺勻漿中MDA含量的影響
NO2在肺組織中最終產(chǎn)物為NO-2和NO-3,為探討NO2使肺勻漿MDA下降是否與其代謝產(chǎn)物有關(guān)及對MDA測定方法的影響,作了如下觀察。
在肺勻漿中加入NO-2或NO-3,對照組加入等量蒸餾水,測定MDA的含量,結(jié)果如表3所示,NO-2可使肺勻漿MDA含量降低,肺勻漿中NO-2濃度越高,MDA含量越低,NO-3對肺勻漿MDA含量無影響。
, 百拇醫(yī)藥
表3 NO-2和NO-3對肺勻漿MDA含量的影響(
組別
n
濃度(μmol)
MDA(nmol/g)
對照
3
0
109.6±3.0
, 百拇醫(yī)藥
NO-2
3
0.3
108.9±2.2
NO-2
3
0.75
102.3±2.0**
NO-2
3
1.5
, 百拇醫(yī)藥
94.5±2.0**
NO-2
3
3.0
87.3±1.2**
NO-3
3
0.75
110.2±9.0
NO-3
3
, 百拇醫(yī)藥
3.0
114.2±5.2
與對照組比較,* *P<0.01
測定生物樣品中MDA的原理是:過氧化脂質(zhì)的分解產(chǎn)物MDA與TBA反應(yīng),產(chǎn)生粉紅色呈色物,通過測定呈色物的量反應(yīng)MDA的量。因1,1,3,3-四乙氧基丙烷(TEP)與過氧化脂質(zhì)同樣分解產(chǎn)生MDA,因此用TEP作標(biāo)準(zhǔn)品定量。在本實(shí)驗(yàn)中把NO-2加入TEP溶液,觀察NO-2對MDA與TBA反應(yīng)的影響,結(jié)果如表4所示,加入NO-2對標(biāo)準(zhǔn)管的吸收率值無影響。
表4 NO2對TEP與TBA反應(yīng)吸光度的影響(
, 百拇醫(yī)藥
組 別
n
AD值
TEP
3
0.127±0.002
TEP+NO-2(0.75μmol)
3
0.126±0.002
TEP+NO-2(3.0μmol)
3
, http://www.www.srpcoatings.com
0.125±0.002
3 討論
自由基能攻擊膜的多不飽和脂肪酸,引發(fā)脂質(zhì)過氧化,影響膜的功能,導(dǎo)致線粒體和溶酶體膜受損,蛋白水解酶釋出。機(jī)體具有抗氧化防御系統(tǒng),使自由基的產(chǎn)生和清除保持平衡,使機(jī)體不致遭到損害。如果內(nèi)源性自由基生成過多或外源性自由基的參與,破壞了體內(nèi)自由基生成和清除之間的平衡,脂質(zhì)過氧化作用不能及時(shí)被終止,產(chǎn)物在體內(nèi)蓄積,就可造成組織細(xì)胞的損傷。
NO2本身是自由基,在體外化學(xué)反應(yīng)體系,它能與不飽和脂肪酸反應(yīng),啟動脂質(zhì)過氧化[6]。但在整體實(shí)驗(yàn),實(shí)驗(yàn)條件不同,結(jié)果也不一致。本文觀察在體外肺勻漿接觸NO2后脂質(zhì)過氧化的變化,排除了整體動物實(shí)驗(yàn)時(shí)機(jī)體復(fù)雜的防御系統(tǒng)及產(chǎn)物轉(zhuǎn)運(yùn)的影響,更直接的反應(yīng)了NO2的作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,肺勻漿接觸NO2后,抗氧化酶及抗氧化劑含量均顯著下降,表明NO2可直接損傷肺組織的抗氧化系統(tǒng),使其抗氧化能力下降,細(xì)胞易于受到自由基的攻擊,這在NO2致肺損傷中可能起一定作用。
, http://www.www.srpcoatings.com
本研究中,肺勻漿接觸NO2后,MDA含量明顯降低,這是一個較為反常的現(xiàn)象。Sagai等[7]也曾報(bào)道,大鼠NO2染毒后,肺組織MDA含量及呼出氣中乙烷含量均顯著降低。NO2與肺組織細(xì)胞成分反應(yīng),其轉(zhuǎn)化產(chǎn)物主要是NO-2和NO-3[8]。本實(shí)驗(yàn)中NO-2使肺勻漿MDA含量降低,但對MDA與TBA的反應(yīng)無影響,即NO-2使MDA下降不是由于測定方法的原因。
參考文獻(xiàn)
1,Mayorga MA.Overview of nitrogen dioxide effects on the lung with emphasis on military relevance.Toxicology,1994,89:176.
, 百拇醫(yī)藥
2,Ohkawa H, Ohishi N,Yagi K. Assay for lipid peroxides in animals tissues by thiobarbituric acid reaction.Analyt Biochem,1979,95:351-358.
3,夏奕明,朱蓮珍.血和組織中谷胱甘肽過氧化物酶活力的測定方法.衛(wèi)生研究,1987,16(4):29-33.
4,候少范,朱振源.生物材料中生育酚的熒光測定法.分析化學(xué),1982,10(9):535-539.
5,Ellman GL. Tissue sulfhydryl groups.Arch Biochem Biophys,1959,82:70.
6,Pryor WA and Lightsey JW. Mechnism of nitrgen dioxide reactions:intiation of lipid peroxidation and the production of nitrous acid.Science,1981,214:435-437.
, 百拇醫(yī)藥
7,Sagai M, lchinose T, Oda H, et al. Studies on biochemical effects of nitrogen dioxide.Ⅱ. Changes of the protective systems in rat lungs and of lipid peroxidation by acute exposure.J Toxicol Environ Health,1982,9:153-164.
8,Postlethwait EM, Bidani A. Pulmonary diposition of inhaled NO2-Nitrogen in isolated rat lungs.Toxixol Appl Pharmacol,1989,98:303-312.
(收稿:1999-01-04), 百拇醫(yī)藥