抗血小板溶栓素的生物相容性及免疫毒性實驗研究
作者：王家驥 王取南 徐德祥 孫美芳 李兆羿 承新
單位：王家驥(廣州醫(yī)學院預防醫(yī)學教研室 (510182));王取南(安徽醫(yī)科大學衛(wèi)生毒理教研室);徐德祥(安徽醫(yī)科大學衛(wèi)生毒理教研室);孫美芳(安徽醫(yī)科大學衛(wèi)生毒理教研室);李兆羿(合肥兆峰科大藥業(yè)有限公司);承新(合肥兆峰科大藥業(yè)有限公司)
關(guān)鍵詞：
衛(wèi)生毒理學雜志000407 抗血小板溶栓素(Anti-Platelet Thrombolysin，簡稱抗栓素)是從皖南尖吻蝮蛇(Agkistrodon acutus)毒液中提純的具有抗凝、去纖、溶栓和抗血栓形成等療效的一類新藥[1]。已有研究報道不同種類、不同產(chǎn)地、不同的分離純化工藝純化的蛇毒制劑，其療效和毒性具有較大的差異[2]，且已有資料報導蝮蛇抗栓素可致過敏反應(yīng)[3]。為了解采用新的分離純化工藝純化制備的抗血小板溶栓素對機體有無局部刺激、降壓、致熱以及溶血等毒副作用，以及反復使用后對機體是否會產(chǎn)生明顯的速發(fā)型或遲發(fā)型致敏毒副作用及其最小致敏劑量，本研究采用多種不同種屬的動物(小鼠、大鼠、豚鼠、家兔和貓)對抗血小板溶栓素進行了局部刺激試驗、生物相容性以及免疫毒性實驗研究，以便為本藥的臨床安全應(yīng)用提供參考依據(jù)。
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1 材料與方法
1.1 材料
1.1.1 藥品 抗血小板溶栓素凍干粉針劑由合肥兆峰科大藥業(yè)有限公司從生長在安徽皖南山區(qū)的皖南尖吻蝮蛇毒液中提純制備(簡單工藝為：先經(jīng)DEAE-陰離子交換柱，進一步經(jīng)凝膠過濾層析和反相層析精細純化，所得組分純度在99%以上)。其效價以抗血小板活性單位(U)表示，批號941028(142.5U/支)和940505(247.5U/支)，臨用前用生理鹽水(NS)配制成所需濃度。
1.1.2 動物 白色家兔(體重2.1±0.5kg)，家貓(體重3.4±1.3kg)，豚鼠(體重265±13g)，SD大鼠(體重198±11g)，昆明小鼠(體重21±3g)均由安徽醫(yī)科大學實驗動物中心提供。
2 實驗方法
2.1 局部刺激試驗[4]
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2.1.1 皮內(nèi)注射刺激試驗 6只白色家兔脫毛備皮后隨機分成高(900U/ml)、低(300U/ml)兩組(n=3)。分別在每只家兔左側(cè)5個間隔2cm的等距點皮內(nèi)各注射0.1ml不同濃度的抗栓素，對側(cè)同法注射等量NS。分別于注射后1、6、24、48、72小時觀察并記錄注射部位皮膚及周圍組織有無局部紅腫等刺激反應(yīng)。
2.1.2 原發(fā)性皮膚刺激試驗 12只白色家兔脫毛備皮并在兩側(cè)各劃#形損傷傷口(面積約3cm×3cm)，隨機分成高(900U/ml)、低(300U/ml)實驗組和陽性對照組(3%甲醛)3組(n=4)。在家兔左側(cè)創(chuàng)面各自涂敷抗栓素或3%甲醛0.1ml，所有家兔右側(cè)傷口涂敷等量NS為陰性對照，用消毒紗布覆蓋，24小時后移去斑貼物，觀察并記錄受試物對家兔破損皮膚有無刺激作用以及移去斑貼物后1、24、48小時各組平均原發(fā)性刺激指數(shù)。
2.1.3 家兔眼刺激試驗 將8只白色家兔隨機分成高(900U/ml)、低(300U/ml)兩組(n=4)。在家兔左眼結(jié)膜囊內(nèi)分別滴入不同濃度的抗栓素NS稀釋液0.1ml，右眼滴入等量NS作為對照，滴藥后立即被動使家兔眼睛閉合10s，分別觀察并記錄滴入后15min，1、2、24小時、7、14天內(nèi)家兔有無流淚、充血及分泌物等眼部刺激癥狀，分別計算各組家兔眼刺激反應(yīng)積分。
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2.2 生物相容性研究[4]
2.2.1 家貓降壓物質(zhì)檢查試驗 將9只家貓隨機分成三組，即高(900U/kg體重)、中(90U/kg體重)、低(9U/kg體重)，每組3只。自耳緣靜脈注射2.5%硫噴妥鈉(25mg/kg)使家貓麻醉，分離氣管及右側(cè)頸動脈，插入氣管插管及動脈插管，連接動物測壓裝置。分離左側(cè)股靜脈，連接靜脈插管及注射器，分別自股靜脈依次注入組胺標準品(0.05、0.1、0.15μg/kg)，鑒定每只家貓降壓反應(yīng)靈敏合格后，分別依次(組胺標準溶液→抗栓素溶液→抗栓素溶液→組胺標準溶液)從股靜脈緩慢(1ml/min)注入相應(yīng)濃度的抗栓素溶液或組胺標準溶液(0.1μg/kg)。
2.2.2 家兔熱原試驗 將9只家兔隨機分成三組，即高(900U/kg)、低(225U/kg)實驗組和陰性對照組(注射等量NS)，每組3只。實驗前測家兔基礎(chǔ)體溫，按5ml/kg體重的容量自耳緣靜脈緩慢(1ml/min)注射抗栓素NS稀釋液，分別于注射后60、120、180min測量各兔體溫。
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2.2.3 溶血試驗 采用抗栓素NS稀釋液與2%兔血懸液直接接觸的方法進行體外溶血試驗。設(shè)實驗組若干組及陰、陽性對照組各一組，最高濃度組抗栓素終濃度為26.25U/ml，倍倍稀釋至最低濃度為0.0016U/ml。實驗組加入抗栓素NS稀釋液2ml，陰陽性對照組分別加入NS或蒸餾水2ml，每組設(shè)3個平行管。先將各管置37℃水浴30min，再加入2%兔血懸液2ml，混勻后，繼續(xù)置37℃水浴60min，750g離心5min，721型分光光度計545nm測定各管吸光度，并按溶血率=樣品吸光度-陰性對照吸光度/陽性對照吸光度×100%計算各管溶血率。
3.3 免疫毒性實驗[4]
3.3.1 速發(fā)型致敏實驗 32只豚鼠隨機分成加福氏完全佐劑的高劑量(致敏劑量99.9U/kg)A組和溶劑(NS)對照組、不加福氏完全佐劑的高劑量B組和低劑量組(11.1U/kg)；32只大鼠隨機分成不加福氏完全佐劑的高(99.9U/kg)、中(33.3U/kg)、低(11.1U/kg)三個劑量組和溶劑(NS)對照組，每組8只。60只小鼠隨機分成6組(各組均不加福氏完全佐劑，其致敏劑量分別為0、3.7、11.1、33.3、99.9、299.7U/kg)，每組10只。所有動物每天經(jīng)皮下注射相應(yīng)劑量的抗栓素溶液或溶劑各一次，連續(xù)注射3次；首次注射后3周，經(jīng)脛靜脈(豚鼠)或尾靜脈(大、小鼠)激發(fā)注射一次，觀察記錄動物出現(xiàn)的過敏反應(yīng)癥狀。
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3.3.2 遲發(fā)型致敏實驗 40只白色豚鼠隨機分成高(99.9U/0.2ml/點)、低(33.3U/0.2ml/點)實驗組和陽性(2.4-二硝基氯苯)、陰性(含福氏完全佐劑的NS)對照組，每組10只。各組分別于背部脫毛區(qū)皮內(nèi)注射含福氏完全佐劑的抗栓素稀釋液、0.5% 2.4-二硝基氯苯溶液或含福氏完全佐劑的NS，每鼠等距離間隔2cm注射3點，每點0.2ml，此后每隔一周局部斑貼一次，共2次，末次斑貼后第14天在對側(cè)皮膚作激發(fā)試驗，分別觀察1、24、48小時、7天時激發(fā)部位皮膚有無紅斑、水腫及硬塊等。
4 結(jié)果
4.1 局部刺激試驗
家兔皮內(nèi)注射刺激試驗結(jié)果顯示：各組家兔各觀察時點均未見皮膚出現(xiàn)明顯的紅斑、水腫等刺激癥狀，表明抗血小板溶栓素對家兔皮膚無刺激性。家兔原發(fā)性皮膚刺激試驗結(jié)果顯示：抗栓素高、低實驗組平均原發(fā)性刺激指數(shù)均為0，屬無刺激性物質(zhì)。家兔眼刺激試驗結(jié)果顯示：各試驗組家兔角膜未見混濁及損傷，虹膜正常，結(jié)膜無充血、水腫和分泌物，眼刺激反應(yīng)評分積分為0。根據(jù)眼刺激性評價標準判定抗血小板溶栓素對家兔眼無刺激性。
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4.2 生物相容性研究
4.2.1 家貓降壓物質(zhì)檢查試驗 不同濃度組胺標準溶液(0.05、0.1、0.15μg/kg)引起血壓下降值平均分別為7.09±3.54kPa；7.98±2.18kPa；9.44±2.42kPa；抗栓素高、中、低劑量組血壓下降值平均分別為1.02±0.73kPa；1.24±0.70kPa；0.96±0.54kPa；表明抗血小板溶栓素對血壓無明顯影響。
4.2.2 家兔熱原試驗 注射抗栓素后第60、120、180min各兔平均體溫變化分別為高劑量組0.57±0.23℃，-0.15±0.21℃，-0.13±0.12℃；低劑量組0.17±0.21℃，0.07±0.06℃，0.23±0.32℃；對照組0.17±0.21℃，0.07±0.06℃，0.23±0.32℃；3小時內(nèi)不同觀察時點各組家兔體溫變化均低于藥典規(guī)定的1.4℃標準。表明抗血小板溶栓素對家兔無致熱作用。
, 百拇醫(yī)藥 4.2.3 溶血試驗 抗血小板溶栓素各實驗管溶血率在0～5%范圍之間，均低于5%的標準[4]。表明抗血小板溶栓素對家兔血細胞無溶血作用。實驗過程中發(fā)現(xiàn)：抗血小板溶栓素濃度超過0.0064U/ml時出現(xiàn)紅細胞粘集現(xiàn)象。
4.3 兔疫毒性實驗
4.3.1 速發(fā)型致敏實驗 含福氏完全佐劑的抗栓素高劑量A組(99.9U/kg)豚鼠激發(fā)注射后立即出現(xiàn)聳毛、搔耳、抓臉等不安表現(xiàn)，隨即出現(xiàn)顫抖、呼吸急促，個別豚鼠出現(xiàn)打噴嚏等過敏癥狀，3min左右出現(xiàn)抽搐、側(cè)臥等，激發(fā)注射后5min內(nèi)豚鼠全部死亡。不加福氏完全佐劑的高劑量B組豚鼠激發(fā)注射后3min左右開始出現(xiàn)上述過敏癥狀，3/8只豚鼠出現(xiàn)明顯的全身肌肉痙攣、側(cè)臥等，7min后死亡；低劑量組(11.1U/kg)豚鼠激發(fā)注射后10min左右開始出現(xiàn)不安、顫抖、呼吸急促等輕度過敏癥狀，1只豚鼠于激發(fā)注射后20min死亡，其余豚鼠上述過敏癥狀于10小時內(nèi)基本恢復，未見其它嚴重過敏癥狀。對照組豚鼠未見上述過敏癥狀，無豚鼠死亡。根據(jù)全身性變態(tài)反應(yīng)強度分級標準：高劑量組加福氏完全佐劑反應(yīng)強度分級為4；不加福氏完全佐劑為2.25，低劑量組為1.375。表明抗栓素對豚鼠具有速發(fā)型致敏毒作用，其最小致死致敏劑量為11.1U/kg。
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高劑量組(99.9U/kg)大鼠激發(fā)注射后開始僅出現(xiàn)輕度興奮和不安癥狀，隨即出現(xiàn)明顯的紫紺、呼吸加深、抬頭深吸氣、全身肌無力、癱臥等癥狀；4/8大鼠于激發(fā)注射后1小時內(nèi)死亡，大鼠死亡前活動明顯減少，呼吸緩慢而微弱；病理檢查見腸壁充血、腹腔壁及全身肌肉發(fā)紅但未見明顯出血。中劑量組(33.3U/kg)出現(xiàn)的過敏癥狀與高劑量組相似，但癥狀稍輕微，3/8大鼠于激發(fā)注射后24小時內(nèi)死亡。低劑量組(11.1U/kg)僅出現(xiàn)輕度興奮、不安和呼吸困難等過敏癥狀，未見動物死亡。對照組大鼠未見上述過敏癥狀，無大鼠死亡。表明抗栓素對大鼠亦具有速發(fā)型致敏毒作用，其半數(shù)致死致敏劑量為60U/kg(1/128LD50)，最小致死致敏劑量為33.3U/kg(1/230LD50，按體重計相當于臨床人體用藥量的100倍)。
各劑量組小鼠于激發(fā)注射后立即出現(xiàn)不同程度的聳毛、快速搔耳、抓臉、雙前肢合抱立起、口舔后肢等不安表現(xiàn)，隨即出現(xiàn)呼吸加快，并見明顯的紫紺、口鼻發(fā)青等過敏癥狀；高劑量組小鼠大多在激發(fā)染毒后20min左右突然出現(xiàn)后肢強直性后蹬并立即死亡。各實驗組小鼠出現(xiàn)的過敏癥狀和死亡數(shù)存在明顯的劑量-反應(yīng)關(guān)系，死亡比分別為0/10、2/10、5/10、5/10、10/10；對照組小鼠未見上述過敏癥狀，無小鼠死亡。表明抗栓素對小鼠具有速發(fā)型致敏毒作用，其半數(shù)致死致敏劑量為47U/kg(1/85LD50)，最小致死致敏劑量為11.1U/kg(1/360LD50，按體重計相當于臨床人體用藥量的33倍。
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4.3.2 遲發(fā)型豚鼠皮膚致敏實驗 抗栓素各實驗組和對照組豚鼠未見致敏癥狀，反應(yīng)率均為0，而陽性對照組豚鼠激發(fā)部位皮膚出現(xiàn)明顯的紅斑、水腫及硬塊等致敏表現(xiàn)，反應(yīng)率為70%。表明抗栓素對豚鼠皮膚無遲發(fā)型致敏作用。
5 討論
隨著人口老齡化和不良飲食習慣等危險因素的增加，冠心病、心肌梗塞、腦血管意外等心腦血管疾病的發(fā)病逐年增多，已成為危害人類健康最嚴重的一類疾病，而這類疾病的發(fā)生和發(fā)展均與血栓形成有著密切的關(guān)系。近30多年來，國內(nèi)外采用多種分離純化手段從蛇毒蛋白組分中純化出具有抗凝、去纖、溶栓和抗血栓形成等作用的抗栓酶等制劑[1]。目前市售的蛇毒類抗栓酶主要是“蛇毒類凝血酶”，其藥理作用類似于凝血酶，通過降解纖維蛋白原，釋放纖維蛋白原的A肽，形成不穩(wěn)定的纖維蛋白單體，由于不激活凝血XⅡ因子，因此被體內(nèi)纖溶系統(tǒng)降解，從而達到降低纖維蛋白原、抗凝、抗栓的作用。而抗血小板溶栓素是采用新的層析工藝從皖南尖吻蝮蛇毒液中提純的一類新藥，藥效學實驗研究結(jié)果顯示：抗血小板溶栓素可直接將纖維蛋白原和纖維蛋白降解成更小的片段，并進一步抑制纖維蛋白原與血小板的結(jié)合，從而更有效地抑制血小板的聚集。因此，抗血小板溶栓素新藥的抗栓、抗再梗作用更有效，并同時具有部分直接溶栓作用。從作用機理上更優(yōu)于目前市售的蛇毒抗栓類產(chǎn)品。
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本研究發(fā)現(xiàn)：經(jīng)皮內(nèi)注射或皮膚表面涂敷或經(jīng)眼粘膜給予900U/ml的抗栓素對家兔皮膚以及眼粘膜刺激指數(shù)均為0，根據(jù)眼刺激性評價標準判定抗血小板溶栓素對家兔皮膚和眼結(jié)膜均無刺激性[4]，而這一劑量相當于臨床人體最大用藥量的600多倍；經(jīng)靜脈給予900U/kg體重的抗栓素(相當于臨床人體最大用藥量的1200多倍)各組家兔各觀察時點體溫變化均低于藥典規(guī)定的1.4℃標準，提示抗栓素對家兔無致熱作用；經(jīng)靜脈給予家貓900、90、9U/kg的抗栓素(最高劑量相當于臨床人體最大用藥量的800倍)各劑量組血壓下降值均小于組胺標準溶液(0.1μg/kg)的一半，表明不同濃度的抗栓素對家貓無降血壓作用；幾乎所有濃度的抗栓素對家兔血細胞均無溶血作用；給豚鼠相當于臨床人體最大用藥量3000多倍的抗栓素溶液多次多點注射，未見對豚鼠皮膚產(chǎn)生遲發(fā)型致敏作用。系列研究結(jié)果表明抗血小板溶栓素無局部刺激作用、無致熱作用、無降血壓作用、無遲發(fā)型致敏作用。但由于抗血小板溶栓素為蛋白質(zhì)類制劑，對豚鼠、小鼠、大鼠仍具有明顯的速發(fā)型致敏毒副作用，其最小致死致敏劑量分別為11.1U/kg和33.3U/kg(按體重計分別相當于臨床人體用藥量的33倍和100倍)。因此，在臨床試用階段或臨床上使用該制劑時應(yīng)密切關(guān)注其速發(fā)型致敏毒副作用，并應(yīng)做好必要的脫敏急救準備。本研究還進一步證實，不同種屬動物對血小板溶栓素蛋白類制劑引發(fā)速發(fā)型致敏毒副作用的敏感性以及致敏毒作用表現(xiàn)有較大的差異，其敏感順序為小鼠與豚鼠相近，而大鼠的敏感性較低。相同劑量的抗血小板溶栓素溶液加福氏完全佐劑引發(fā)的速發(fā)型致敏毒副作用明顯強于不加福氏完全佐劑，因此，為提高對血小板溶栓素蛋白類制劑(尤其是低蛋白類制劑)速發(fā)型致敏毒副作用的檢出率，建議用福氏完全佐劑配制為宜。
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參考文獻
1，朱中良，龔為民，牛立文，等.皖南尖吻蝮蛇毒出血毒素Ⅳ的純化與初步鑒定.生物化學雜志，1996，12(3)：357-9.
2，陳康德，楊梅蘭，楊渭川，等.蛇毒研究和應(yīng)用概述.蛇志，1997，9(4)：47-9.
3，黃連飛.218例蝮蛇抗栓素皮試結(jié)果及過敏反應(yīng)分析.右江民族醫(yī)學院學報，1996，18(2)：244-5.
4，裘雪友，孫定人，喻維新.藥師手冊.北京：人民軍醫(yī)出版社，第2版.1998.843-874.
(收稿：1999-04-12), 百拇醫(yī)藥
單位：王家驥(廣州醫(yī)學院預防醫(yī)學教研室 (510182));王取南(安徽醫(yī)科大學衛(wèi)生毒理教研室);徐德祥(安徽醫(yī)科大學衛(wèi)生毒理教研室);孫美芳(安徽醫(yī)科大學衛(wèi)生毒理教研室);李兆羿(合肥兆峰科大藥業(yè)有限公司);承新(合肥兆峰科大藥業(yè)有限公司)
關(guān)鍵詞：
衛(wèi)生毒理學雜志000407 抗血小板溶栓素(Anti-Platelet Thrombolysin，簡稱抗栓素)是從皖南尖吻蝮蛇(Agkistrodon acutus)毒液中提純的具有抗凝、去纖、溶栓和抗血栓形成等療效的一類新藥[1]。已有研究報道不同種類、不同產(chǎn)地、不同的分離純化工藝純化的蛇毒制劑，其療效和毒性具有較大的差異[2]，且已有資料報導蝮蛇抗栓素可致過敏反應(yīng)[3]。為了解采用新的分離純化工藝純化制備的抗血小板溶栓素對機體有無局部刺激、降壓、致熱以及溶血等毒副作用，以及反復使用后對機體是否會產(chǎn)生明顯的速發(fā)型或遲發(fā)型致敏毒副作用及其最小致敏劑量，本研究采用多種不同種屬的動物(小鼠、大鼠、豚鼠、家兔和貓)對抗血小板溶栓素進行了局部刺激試驗、生物相容性以及免疫毒性實驗研究，以便為本藥的臨床安全應(yīng)用提供參考依據(jù)。
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1 材料與方法
1.1 材料
1.1.1 藥品 抗血小板溶栓素凍干粉針劑由合肥兆峰科大藥業(yè)有限公司從生長在安徽皖南山區(qū)的皖南尖吻蝮蛇毒液中提純制備(簡單工藝為：先經(jīng)DEAE-陰離子交換柱，進一步經(jīng)凝膠過濾層析和反相層析精細純化，所得組分純度在99%以上)。其效價以抗血小板活性單位(U)表示，批號941028(142.5U/支)和940505(247.5U/支)，臨用前用生理鹽水(NS)配制成所需濃度。
1.1.2 動物 白色家兔(體重2.1±0.5kg)，家貓(體重3.4±1.3kg)，豚鼠(體重265±13g)，SD大鼠(體重198±11g)，昆明小鼠(體重21±3g)均由安徽醫(yī)科大學實驗動物中心提供。
2 實驗方法
2.1 局部刺激試驗[4]
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2.1.1 皮內(nèi)注射刺激試驗 6只白色家兔脫毛備皮后隨機分成高(900U/ml)、低(300U/ml)兩組(n=3)。分別在每只家兔左側(cè)5個間隔2cm的等距點皮內(nèi)各注射0.1ml不同濃度的抗栓素，對側(cè)同法注射等量NS。分別于注射后1、6、24、48、72小時觀察并記錄注射部位皮膚及周圍組織有無局部紅腫等刺激反應(yīng)。
2.1.2 原發(fā)性皮膚刺激試驗 12只白色家兔脫毛備皮并在兩側(cè)各劃#形損傷傷口(面積約3cm×3cm)，隨機分成高(900U/ml)、低(300U/ml)實驗組和陽性對照組(3%甲醛)3組(n=4)。在家兔左側(cè)創(chuàng)面各自涂敷抗栓素或3%甲醛0.1ml，所有家兔右側(cè)傷口涂敷等量NS為陰性對照，用消毒紗布覆蓋，24小時后移去斑貼物，觀察并記錄受試物對家兔破損皮膚有無刺激作用以及移去斑貼物后1、24、48小時各組平均原發(fā)性刺激指數(shù)。
2.1.3 家兔眼刺激試驗 將8只白色家兔隨機分成高(900U/ml)、低(300U/ml)兩組(n=4)。在家兔左眼結(jié)膜囊內(nèi)分別滴入不同濃度的抗栓素NS稀釋液0.1ml，右眼滴入等量NS作為對照，滴藥后立即被動使家兔眼睛閉合10s，分別觀察并記錄滴入后15min，1、2、24小時、7、14天內(nèi)家兔有無流淚、充血及分泌物等眼部刺激癥狀，分別計算各組家兔眼刺激反應(yīng)積分。
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2.2 生物相容性研究[4]
2.2.1 家貓降壓物質(zhì)檢查試驗 將9只家貓隨機分成三組，即高(900U/kg體重)、中(90U/kg體重)、低(9U/kg體重)，每組3只。自耳緣靜脈注射2.5%硫噴妥鈉(25mg/kg)使家貓麻醉，分離氣管及右側(cè)頸動脈，插入氣管插管及動脈插管，連接動物測壓裝置。分離左側(cè)股靜脈，連接靜脈插管及注射器，分別自股靜脈依次注入組胺標準品(0.05、0.1、0.15μg/kg)，鑒定每只家貓降壓反應(yīng)靈敏合格后，分別依次(組胺標準溶液→抗栓素溶液→抗栓素溶液→組胺標準溶液)從股靜脈緩慢(1ml/min)注入相應(yīng)濃度的抗栓素溶液或組胺標準溶液(0.1μg/kg)。
2.2.2 家兔熱原試驗 將9只家兔隨機分成三組，即高(900U/kg)、低(225U/kg)實驗組和陰性對照組(注射等量NS)，每組3只。實驗前測家兔基礎(chǔ)體溫，按5ml/kg體重的容量自耳緣靜脈緩慢(1ml/min)注射抗栓素NS稀釋液，分別于注射后60、120、180min測量各兔體溫。
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2.2.3 溶血試驗 采用抗栓素NS稀釋液與2%兔血懸液直接接觸的方法進行體外溶血試驗。設(shè)實驗組若干組及陰、陽性對照組各一組，最高濃度組抗栓素終濃度為26.25U/ml，倍倍稀釋至最低濃度為0.0016U/ml。實驗組加入抗栓素NS稀釋液2ml，陰陽性對照組分別加入NS或蒸餾水2ml，每組設(shè)3個平行管。先將各管置37℃水浴30min，再加入2%兔血懸液2ml，混勻后，繼續(xù)置37℃水浴60min，750g離心5min，721型分光光度計545nm測定各管吸光度，并按溶血率=樣品吸光度-陰性對照吸光度/陽性對照吸光度×100%計算各管溶血率。
3.3 免疫毒性實驗[4]
3.3.1 速發(fā)型致敏實驗 32只豚鼠隨機分成加福氏完全佐劑的高劑量(致敏劑量99.9U/kg)A組和溶劑(NS)對照組、不加福氏完全佐劑的高劑量B組和低劑量組(11.1U/kg)；32只大鼠隨機分成不加福氏完全佐劑的高(99.9U/kg)、中(33.3U/kg)、低(11.1U/kg)三個劑量組和溶劑(NS)對照組，每組8只。60只小鼠隨機分成6組(各組均不加福氏完全佐劑，其致敏劑量分別為0、3.7、11.1、33.3、99.9、299.7U/kg)，每組10只。所有動物每天經(jīng)皮下注射相應(yīng)劑量的抗栓素溶液或溶劑各一次，連續(xù)注射3次；首次注射后3周，經(jīng)脛靜脈(豚鼠)或尾靜脈(大、小鼠)激發(fā)注射一次，觀察記錄動物出現(xiàn)的過敏反應(yīng)癥狀。
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3.3.2 遲發(fā)型致敏實驗 40只白色豚鼠隨機分成高(99.9U/0.2ml/點)、低(33.3U/0.2ml/點)實驗組和陽性(2.4-二硝基氯苯)、陰性(含福氏完全佐劑的NS)對照組，每組10只。各組分別于背部脫毛區(qū)皮內(nèi)注射含福氏完全佐劑的抗栓素稀釋液、0.5% 2.4-二硝基氯苯溶液或含福氏完全佐劑的NS，每鼠等距離間隔2cm注射3點，每點0.2ml，此后每隔一周局部斑貼一次，共2次，末次斑貼后第14天在對側(cè)皮膚作激發(fā)試驗，分別觀察1、24、48小時、7天時激發(fā)部位皮膚有無紅斑、水腫及硬塊等。
4 結(jié)果
4.1 局部刺激試驗
家兔皮內(nèi)注射刺激試驗結(jié)果顯示：各組家兔各觀察時點均未見皮膚出現(xiàn)明顯的紅斑、水腫等刺激癥狀，表明抗血小板溶栓素對家兔皮膚無刺激性。家兔原發(fā)性皮膚刺激試驗結(jié)果顯示：抗栓素高、低實驗組平均原發(fā)性刺激指數(shù)均為0，屬無刺激性物質(zhì)。家兔眼刺激試驗結(jié)果顯示：各試驗組家兔角膜未見混濁及損傷，虹膜正常，結(jié)膜無充血、水腫和分泌物，眼刺激反應(yīng)評分積分為0。根據(jù)眼刺激性評價標準判定抗血小板溶栓素對家兔眼無刺激性。
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4.2 生物相容性研究
4.2.1 家貓降壓物質(zhì)檢查試驗 不同濃度組胺標準溶液(0.05、0.1、0.15μg/kg)引起血壓下降值平均分別為7.09±3.54kPa；7.98±2.18kPa；9.44±2.42kPa；抗栓素高、中、低劑量組血壓下降值平均分別為1.02±0.73kPa；1.24±0.70kPa；0.96±0.54kPa；表明抗血小板溶栓素對血壓無明顯影響。
4.2.2 家兔熱原試驗 注射抗栓素后第60、120、180min各兔平均體溫變化分別為高劑量組0.57±0.23℃，-0.15±0.21℃，-0.13±0.12℃；低劑量組0.17±0.21℃，0.07±0.06℃，0.23±0.32℃；對照組0.17±0.21℃，0.07±0.06℃，0.23±0.32℃；3小時內(nèi)不同觀察時點各組家兔體溫變化均低于藥典規(guī)定的1.4℃標準。表明抗血小板溶栓素對家兔無致熱作用。
, 百拇醫(yī)藥 4.2.3 溶血試驗 抗血小板溶栓素各實驗管溶血率在0～5%范圍之間，均低于5%的標準[4]。表明抗血小板溶栓素對家兔血細胞無溶血作用。實驗過程中發(fā)現(xiàn)：抗血小板溶栓素濃度超過0.0064U/ml時出現(xiàn)紅細胞粘集現(xiàn)象。
4.3 兔疫毒性實驗
4.3.1 速發(fā)型致敏實驗 含福氏完全佐劑的抗栓素高劑量A組(99.9U/kg)豚鼠激發(fā)注射后立即出現(xiàn)聳毛、搔耳、抓臉等不安表現(xiàn)，隨即出現(xiàn)顫抖、呼吸急促，個別豚鼠出現(xiàn)打噴嚏等過敏癥狀，3min左右出現(xiàn)抽搐、側(cè)臥等，激發(fā)注射后5min內(nèi)豚鼠全部死亡。不加福氏完全佐劑的高劑量B組豚鼠激發(fā)注射后3min左右開始出現(xiàn)上述過敏癥狀，3/8只豚鼠出現(xiàn)明顯的全身肌肉痙攣、側(cè)臥等，7min后死亡；低劑量組(11.1U/kg)豚鼠激發(fā)注射后10min左右開始出現(xiàn)不安、顫抖、呼吸急促等輕度過敏癥狀，1只豚鼠于激發(fā)注射后20min死亡，其余豚鼠上述過敏癥狀于10小時內(nèi)基本恢復，未見其它嚴重過敏癥狀。對照組豚鼠未見上述過敏癥狀，無豚鼠死亡。根據(jù)全身性變態(tài)反應(yīng)強度分級標準：高劑量組加福氏完全佐劑反應(yīng)強度分級為4；不加福氏完全佐劑為2.25，低劑量組為1.375。表明抗栓素對豚鼠具有速發(fā)型致敏毒作用，其最小致死致敏劑量為11.1U/kg。
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高劑量組(99.9U/kg)大鼠激發(fā)注射后開始僅出現(xiàn)輕度興奮和不安癥狀，隨即出現(xiàn)明顯的紫紺、呼吸加深、抬頭深吸氣、全身肌無力、癱臥等癥狀；4/8大鼠于激發(fā)注射后1小時內(nèi)死亡，大鼠死亡前活動明顯減少，呼吸緩慢而微弱；病理檢查見腸壁充血、腹腔壁及全身肌肉發(fā)紅但未見明顯出血。中劑量組(33.3U/kg)出現(xiàn)的過敏癥狀與高劑量組相似，但癥狀稍輕微，3/8大鼠于激發(fā)注射后24小時內(nèi)死亡。低劑量組(11.1U/kg)僅出現(xiàn)輕度興奮、不安和呼吸困難等過敏癥狀，未見動物死亡。對照組大鼠未見上述過敏癥狀，無大鼠死亡。表明抗栓素對大鼠亦具有速發(fā)型致敏毒作用，其半數(shù)致死致敏劑量為60U/kg(1/128LD50)，最小致死致敏劑量為33.3U/kg(1/230LD50，按體重計相當于臨床人體用藥量的100倍)。
各劑量組小鼠于激發(fā)注射后立即出現(xiàn)不同程度的聳毛、快速搔耳、抓臉、雙前肢合抱立起、口舔后肢等不安表現(xiàn)，隨即出現(xiàn)呼吸加快，并見明顯的紫紺、口鼻發(fā)青等過敏癥狀；高劑量組小鼠大多在激發(fā)染毒后20min左右突然出現(xiàn)后肢強直性后蹬并立即死亡。各實驗組小鼠出現(xiàn)的過敏癥狀和死亡數(shù)存在明顯的劑量-反應(yīng)關(guān)系，死亡比分別為0/10、2/10、5/10、5/10、10/10；對照組小鼠未見上述過敏癥狀，無小鼠死亡。表明抗栓素對小鼠具有速發(fā)型致敏毒作用，其半數(shù)致死致敏劑量為47U/kg(1/85LD50)，最小致死致敏劑量為11.1U/kg(1/360LD50，按體重計相當于臨床人體用藥量的33倍。
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4.3.2 遲發(fā)型豚鼠皮膚致敏實驗 抗栓素各實驗組和對照組豚鼠未見致敏癥狀，反應(yīng)率均為0，而陽性對照組豚鼠激發(fā)部位皮膚出現(xiàn)明顯的紅斑、水腫及硬塊等致敏表現(xiàn)，反應(yīng)率為70%。表明抗栓素對豚鼠皮膚無遲發(fā)型致敏作用。
5 討論
隨著人口老齡化和不良飲食習慣等危險因素的增加，冠心病、心肌梗塞、腦血管意外等心腦血管疾病的發(fā)病逐年增多，已成為危害人類健康最嚴重的一類疾病，而這類疾病的發(fā)生和發(fā)展均與血栓形成有著密切的關(guān)系。近30多年來，國內(nèi)外采用多種分離純化手段從蛇毒蛋白組分中純化出具有抗凝、去纖、溶栓和抗血栓形成等作用的抗栓酶等制劑[1]。目前市售的蛇毒類抗栓酶主要是“蛇毒類凝血酶”，其藥理作用類似于凝血酶，通過降解纖維蛋白原，釋放纖維蛋白原的A肽，形成不穩(wěn)定的纖維蛋白單體，由于不激活凝血XⅡ因子，因此被體內(nèi)纖溶系統(tǒng)降解，從而達到降低纖維蛋白原、抗凝、抗栓的作用。而抗血小板溶栓素是采用新的層析工藝從皖南尖吻蝮蛇毒液中提純的一類新藥，藥效學實驗研究結(jié)果顯示：抗血小板溶栓素可直接將纖維蛋白原和纖維蛋白降解成更小的片段，并進一步抑制纖維蛋白原與血小板的結(jié)合，從而更有效地抑制血小板的聚集。因此，抗血小板溶栓素新藥的抗栓、抗再梗作用更有效，并同時具有部分直接溶栓作用。從作用機理上更優(yōu)于目前市售的蛇毒抗栓類產(chǎn)品。
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本研究發(fā)現(xiàn)：經(jīng)皮內(nèi)注射或皮膚表面涂敷或經(jīng)眼粘膜給予900U/ml的抗栓素對家兔皮膚以及眼粘膜刺激指數(shù)均為0，根據(jù)眼刺激性評價標準判定抗血小板溶栓素對家兔皮膚和眼結(jié)膜均無刺激性[4]，而這一劑量相當于臨床人體最大用藥量的600多倍；經(jīng)靜脈給予900U/kg體重的抗栓素(相當于臨床人體最大用藥量的1200多倍)各組家兔各觀察時點體溫變化均低于藥典規(guī)定的1.4℃標準，提示抗栓素對家兔無致熱作用；經(jīng)靜脈給予家貓900、90、9U/kg的抗栓素(最高劑量相當于臨床人體最大用藥量的800倍)各劑量組血壓下降值均小于組胺標準溶液(0.1μg/kg)的一半，表明不同濃度的抗栓素對家貓無降血壓作用；幾乎所有濃度的抗栓素對家兔血細胞均無溶血作用；給豚鼠相當于臨床人體最大用藥量3000多倍的抗栓素溶液多次多點注射，未見對豚鼠皮膚產(chǎn)生遲發(fā)型致敏作用。系列研究結(jié)果表明抗血小板溶栓素無局部刺激作用、無致熱作用、無降血壓作用、無遲發(fā)型致敏作用。但由于抗血小板溶栓素為蛋白質(zhì)類制劑，對豚鼠、小鼠、大鼠仍具有明顯的速發(fā)型致敏毒副作用，其最小致死致敏劑量分別為11.1U/kg和33.3U/kg(按體重計分別相當于臨床人體用藥量的33倍和100倍)。因此，在臨床試用階段或臨床上使用該制劑時應(yīng)密切關(guān)注其速發(fā)型致敏毒副作用，并應(yīng)做好必要的脫敏急救準備。本研究還進一步證實，不同種屬動物對血小板溶栓素蛋白類制劑引發(fā)速發(fā)型致敏毒副作用的敏感性以及致敏毒作用表現(xiàn)有較大的差異，其敏感順序為小鼠與豚鼠相近，而大鼠的敏感性較低。相同劑量的抗血小板溶栓素溶液加福氏完全佐劑引發(fā)的速發(fā)型致敏毒副作用明顯強于不加福氏完全佐劑，因此，為提高對血小板溶栓素蛋白類制劑(尤其是低蛋白類制劑)速發(fā)型致敏毒副作用的檢出率，建議用福氏完全佐劑配制為宜。
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參考文獻
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4，裘雪友，孫定人，喻維新.藥師手冊.北京：人民軍醫(yī)出版社，第2版.1998.843-874.
(收稿：1999-04-12), 百拇醫(yī)藥