國產(chǎn)氯沙坦鉀片的生物等效性研究
作者：韋陽 黃慧芳 邵慶翔 張美云 孫東升 王恪申 郝轉(zhuǎn)業(yè) 陳建新 桑國衛(wèi)
單位：韋陽 邵慶翔 張美云 王恪申 郝轉(zhuǎn)業(yè) 桑國衛(wèi)(浙江省醫(yī)學科學院，杭州 310013)；黃慧芳 孫東升(浙江省人民醫(yī)院，杭州，310014)；陳建新(杭州默沙東制藥股份有限公司，杭州，310006)
關(guān)鍵詞：氯沙坦鉀；E-3174
中國臨床藥理學雜志000208摘 要 18名健康男性志愿者交叉單劑量口服杭州默沙東產(chǎn)50mg氯沙坦鉀片和英國默克產(chǎn)50mg氯沙坦鉀片，以HPLC-UV法測定血漿中氯沙坦鉀及其活性代謝產(chǎn)物E-3174的濃度，并對兩種制劑進行生物等效性評價。試驗結(jié)果表明：口服杭州產(chǎn)及默克產(chǎn)氯沙坦鉀，氯沙坦鉀Cmax分別為352.20± 196.09和291.20± 124.41m g.L-1， Tmax分別為0.91± 0.38和1.33± 0.69h，AUC0-∞分別為547.44± 226.77和499.52± 157.31 m g.h.L-1，t1/2分別為1.89± 0.49和1.80± 0.51h；E-3174 Cmax分別為545.07± 150.49和534.02± 142.88m g.L-1， Tmax分別為3.15± 1.07和3.37± 0.66h，AUC0-¥ 分別為3641.57± 637.17和3631.72± 687.94 m g.h.L-1，t1/2分別為8.33± 2.05和7.74± 1.22h。統(tǒng)計分析表明，兩制劑間氯沙坦鉀的Cmax、Tmax有顯著差異，而氯沙坦鉀的AUC0-∞、E-3174的Cmax、Tmax 和AUC0-∞ 無顯著差異。
, 百拇醫(yī)藥
RELATIVE BIOAVAILABILITY OF LOSARTAN TABLET IN HEALTHY VOLUNTEERS
WEI Yang, SHAO Qing-Xiang, ZHANG Mei-Yun,WANG Ke-Sheng, HAO Zhuan-Ye, SANG Guo-Wei
(Zhejiang Academy of Medical Sciences, Hangzhou 310013)
HUANG Hui-Fang，SUN Dong-Sheng
(The People’s Hospital of Zhejiang Province)
CHEN Jian-Xin2
, 百拇醫(yī)藥
(Hangzhou MSD Pharmaceutical Co., Ltd.)
Abstract This is an open randomized, two-period crossover study in 18 healthy male volunteers. Subjects receive a single oral dose of 50mg losartan tablet produced by Hangzhou–MSD and by U.K-MERCK .The plasma concentrations of unchanged losartan and its active metabolite, E-3174 are determined by using HPLC method. The main pharmacokinetic parameters are as follows: Cmax of losartan (Hangzhou-MSD) and losartan (U.K.-MERCK) are 352.20± 196.09 and 291.20 ± 124.41mg.L-1, Tmax are 0.91± 0.38 and 1.33± 0.69h, AUC0-∞ are 547.44± 226.77 and 499.52± 157.31 m g.h.L-1, t1/2 are 1.89± 0.49 and 1.80± 0.51h, respectively；Cmax of E-3174 (Hangzhou-MSD) and E-3174(U.K.-MERCK) are 545.07± 150.49 and 534.02 ± 142.88mg.L-1, Tmax are 3.15± 1.07 and 3.37± 0.66h，AUC0-∞are 3641.57± 637.17 and 3631.72± 687.94 mg.h.L-1，t1/2 are 8.33± 2.05 and 7.74± 1.22h,respectively. According to statistic study , the differences of two parameters,Cmax and Tmax of unchanged losartan between two formulations are significant,but AUC0-∞of unchanged losartan and three parameters,Cmax,Tmaxand AUC0-∞of E-3174 show no significant difference between two formulations.
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Key words losartan; E-3174; metabolite
氯沙坦鉀，2 -丁基 - 4 - 氯-1-[[2'-(1H - 四唑-5-基)[1,1'-聯(lián)苯] -4- 基]甲基]-1H-咪唑-5-甲醇單鉀鹽，是一種口服有效的非多肽類血管緊張素Ⅱ受體(AT1亞型受體)拮抗劑，為一類新型抗高血壓藥物。本研究采用標準雙周期交叉研究評價單次口服杭州默沙東產(chǎn)氯沙坦鉀片和英國默克產(chǎn)氯沙坦鉀片后母體化合物氯沙坦鉀及其活性代謝產(chǎn)物2 -丁基 - 4 - 氯-1-[[2'-(1H - 四唑-5-基)[1,1'-聯(lián)苯] -4- 基]甲基]-1H-咪唑-5-羧酸(E-3174)的生物等效性。
材料與方法
1. 藥品與試劑
受試制劑氯沙坦鉀片，杭州默沙東產(chǎn)，規(guī)格每片50mg，批號8442-002；對照制劑氯沙坦鉀片，英國默克公司產(chǎn)，每片50mg，批號9810770。
, 百拇醫(yī)藥
氯沙坦鉀標準品，批號005H069，純度99.7%；E-3174標準品，批號002X008，純度99.1%；內(nèi)標L-158,854標準品，批號000F004，均由杭州默沙東制藥有限公司提供。
乙腈、甲醇、甲基-叔-丁基醚，HPLC級；雙重蒸餾水，自制；磷酸二氫鈉、氫氧化鈉、檸檬酸鈉、檸檬酸、正己烷、異丙醇、磷酸(85%)，AR級。
2. 儀器
HPLC系統(tǒng)：島津LC -10A雙泵、 SPD-10A檢測器、CTO-10A柱溫箱、DGA -10A脫氣儀；7125手動進樣閥；MN公司Nuclesil 100-5CN柱(250×4.6mm)；杭州英譜公司HS色譜數(shù)據(jù)工作站(3.5版)。
3. 受試對象
本研究對象為18名健康男性志愿者，平均年齡20.9± 1.6歲，體重為62.6± 6.1kg。所有受試者在試驗前簽署了知情同意書，并經(jīng)浙江省醫(yī)學科學院醫(yī)學倫理委員會批準進入本試驗。
, 百拇醫(yī)藥
4. 試驗方案
本研究為一隨機、開放、雙周期交叉研究。所有參試對象按隨機表分別先后口服兩種片劑，每次50mg，兩次服藥的間隔洗凈期為14 d。
每次服藥前12h至服藥后36h受試對象在心血管內(nèi)科病房住院觀察，進食統(tǒng)一標準餐；服藥前8h至服藥后3h禁食。受試對象在上午8:00左右以250ml溫開水送服氯沙坦鉀1片。給藥前及給藥后0.33，0.67，1，1.33，1.67，2，3，4，5，6，8，10，12，18，24，36h分別于上肢靜脈取血7ml，離心后得血漿約3ml，-20oC保存待分析。
服藥前1h內(nèi)及服藥后1，2，4，6，8，12，24，36h記錄一次坐位心率/血壓。在整個研究過程中對各種不良反應(yīng)與事件進行監(jiān)測。
5. 分析方法
5.1 色譜條件
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檢測波長：254nm; 柱溫:40oC；靈敏度: 0.001 AUFS；流動相：磷酸鹽緩沖溶液(pH=2.9):乙腈(74:26, v/v)，流速:1.0ml.min-1。
5.2 血漿樣品的預處理方法
15ml圓底試管編號并加入內(nèi)標工作液100m l(1.0 mg.L-1)，用氮氣將甲醇吹干。冷凍血漿在室溫下融化，渦旋20s后于3000r.min-1離心5min，取1.0ml上層血漿至上述試管中，渦旋30s使內(nèi)標溶解，在各試管中加125m l 1.0M H3PO4，渦旋20s，再加甲基-叔-丁基醚(MTBE)8ml，渦旋2min，3000r.min-1條件下離心10min，將試管置于-70oC低溫冰箱中10min使水層凍結(jié)。將有機層傾入預先加有200m l 0.05mol.L-1NaOH的15 ml聚丙烯尖底試管中，渦旋2min，3000r·min-1條件下離心5min，將試管于-70oC放置 7min使水層凍結(jié)，棄去有機相，將殘余MTBE用氮氣吹干，在尖底試管中加入75m l 0.5M pH=4.3的檸檬酸緩沖溶液，渦旋混勻；加入6ml正己烷，渦旋2min，3000r.min-1條件下離心5min，將試管置于-70oC 7min使水層凍結(jié)，棄去正己烷，殘余正己烷用氮氣吹干。加入20 μl 1.0 mol.L-1H3PO4和50m l異丙醇，渦旋混勻，取100m l進樣。
, 百拇醫(yī)藥
5.3 標準曲線的繪制
配制氯沙坦鉀與E-3174濃度均為1000，700，300，100，70，30，10和5m g.L-1的系列標準血漿溶液，按血漿處理方法處理測定，以樣品的色譜峰面積為定量依據(jù)，以待測樣品峰面積與內(nèi)標峰面積的比值(Y)對樣品濃度(X)進行線性回歸得標準曲線方程。
6. 數(shù)據(jù)處理
取可檢測到藥物的最后3個時間點濃度C的自然對數(shù)值lnC對相應(yīng)時間t進行線性回歸分別求得氯沙坦鉀和E-3174在人體內(nèi)的末端相消除速率常數(shù)l ； 用梯形法求算藥時曲線下面積AUC0-t值；計算AUC0-¥ =AUC0-t+l /tn。血漿峰濃度Cmax和達峰時間Tmax取觀測值。
, 百拇醫(yī)藥
AUC和Cmax分別作對數(shù)轉(zhuǎn)換，Tmax不作轉(zhuǎn)換。采用適用于標準2´ 2交叉試驗的方差分析方法分析lnAUC、lnCmax和Tmax。根據(jù)方差分析得出的均方差，參照t-分布計算均值比率或差的90%可信區(qū)間，用方差分析求得均方誤差后按Schuirmann標準雙單側(cè)檢驗程序進行評價，統(tǒng)計軟件SAS。
結(jié) 果
1. 血藥濃度測定方法的評價
在選定的分析條件下，氯沙坦鉀和E-3174的線性范圍均為5～1000m g.L-1，氯沙坦鉀的工作曲線為Y= 0.0078X-0.0084 (r2=0.9992)，E-3174的工作曲線為Y = 0.0146X + 0.0033 (r2=0.9996)。
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在線性范圍內(nèi)，測定各濃度氯沙坦鉀和E-3174的回收率均接近100%，天內(nèi)變異系數(shù)均<5%(表1)。對高(800m g.L-1)、中(200m g.L-1)、低(30m g.L-1)三種濃度的血漿樣品在不同日期共進行12次測定，氯沙坦鉀和E-3174的回收率均接近100%，天間變異系數(shù)均<5%(表2)。
Table 1. Intra-day precision and recovery of plasma standard curves(n=6)
Nominal
concentration (m g.L-1)
Losartan
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E-3174
Found
mean± SD
Recovery
(%)
CV
(%)
Found
mean± SD
Recovery
(%)
CV
(%)
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5
4.82± 0.22
96.40
4.58
5.54± 0.18
110.80
3.23
10
9.47± 0.39
94.70
4.16
10.57± 0.44
, 百拇醫(yī)藥 105.70
4.15
30
28.72± 0.89
95.73
3.10
30.25± 1.58
100.83
5.22
70
69.93± 1.32
99.00
1.88
, 百拇醫(yī)藥
71.40± 2.03
102.00
2.84
100
97.10± 0.96
97.10
0.99
103.69± 4.66
103.69
4.49
300
305.75± 9.92
, 百拇醫(yī)藥
101.92
3.24
294.37± 4.76
98.12
1.62
700
713.98± 17.61
102.00
2.47
696.72± 15.78
99.53
2.26
, 百拇醫(yī)藥
1000
998.09± 18.43
99.81
1.85
1006.21± 9.90
100.62
0.98
Table 2. Inter-day precision and recovery of qualify control samples (n=12)
Nominal
Concentration (mg.L-1)
, 百拇醫(yī)藥
Losartan
E-3174
Found
mean± SD
Recovery
(%)
CV
(%)
Found
mean± SD
Recovery
(%)
CV
, http://www.www.srpcoatings.com
(%)
30
28.83± 0.85
96.09
2.95
29.69± 1.32
98.98
4.45
200
195.88± 4.40
97.94
2.25
, http://www.www.srpcoatings.com 196.11± 7.99
98.06
4.07
800
826.93± 37.20
103.37
4.50
811.11± 34.15
101.39
4.20
在線性范圍內(nèi)比較各濃度經(jīng)提取過程和未經(jīng)提取過程的樣品峰面積，可得各濃度氯沙坦鉀和E-3174的絕對提取回收率分別為96.21%和98.82%。本文所建立的方法對氯沙坦鉀和E-3174的最低檢測限均為5m g.L-1。
, 百拇醫(yī)藥
血漿中雜質(zhì)對測定無明顯干擾， 標準血漿樣品的色譜圖見圖1。
Fig 1. Representative chromatograms of 1 (internal standard), 2 (losartan) and 3 (E-3174).
A: Blank plasma; B: Control plasma spiked with 100ng losartan and E-3174
C: 1h sample from a subject given a single dose of 50mg losartan.
2. 藥代動力學參數(shù)
18名受試對象單劑量口服杭州默沙東產(chǎn)氯沙坦鉀片和英國默克產(chǎn)氯沙坦鉀片后平均藥物濃度-時間曲線見圖2、3。氯沙坦鉀和E-3174在人體內(nèi)的藥代動力學過程均較好地符合二室模型、一級
, 百拇醫(yī)藥
吸收過程。
Fig 2. Mean plasma concentration of losartan following oral administration of 50mg losartan tablet
(t :Hangzhou tablet · : Merck tablet)
Fig 3. Mean plasma concentration of E-3174 following oral administration of
50mg losartan tablet
, 百拇醫(yī)藥
(t :Hangzhou tablet · : Merck tablet)
口服兩種50 mg氯沙坦鉀片劑后氯沙坦鉀和E-3174的Cmax、Tmax、AUC0-t、AUC0-¥ 、l 和t1/2等參數(shù)列于表3。
Table 3. Pharmacokinetic parameters of losartan and E-3174 following
oral administation of losartan tablet(n=18)
Losartan
E-3174
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Parameters
Hangzhou tablet
Merk tablet
Hangzhou tablet
Merk tablet
Cmax(mg.L-1)(mg.L-1)
352.20± 196.09
291.33± 124.41
545.07± 150.49
, 百拇醫(yī)藥
534.02± 142.88
Tmax(h)(h)
0.91± 0.38
1.33± 0.69
3.15± 1.07
3.37± 0.66
AUC0-t(m g.h.L -1)(m g.h.L -1)
, 百拇醫(yī)藥 533.44± 226.10
484.09± 155.38
3566.12± 627.45
3561.93± 688.19
AUC0-∞(mg.h.L -1)(mg.h.L -1)
547.44± 226.77
499.52± 157.31
, 百拇醫(yī)藥
3641.57± 637.17
3631.72± 687.94
l (h-1)
0.39± 0.10
0.41± 0.11
0.09± 0.03
0.09± 0.02
t1/2(h)(h)
1.89± 0.49
1.80± 0.51
8.33± 2.05
, 百拇醫(yī)藥
7.74± 1.22
3. 生物等效性分析
3.1 母體化合物氯沙坦鉀
單劑量口服兩種制劑后，氯沙坦鉀AUC0-¥ 的幾何均值分別為505.2和477.5m g.h.L-1，比率為1.06，90%可信限為(0.97，1.15)在0.8-1.25范圍內(nèi)，表明兩者的生物利用度相仿。Cmax的幾何均值分別為298.6和264.5 m g.L-1，比率為1.13，90%可信限為(0.89，1.42)，表明受試片的Cmax高于對照片。Tmax分別為0.91和1.33 h，差值-0.42h，差值的90%可信限為(-0.69，-0.16)，表示口服受試片后峰值出現(xiàn)較早。
, 百拇醫(yī)藥
3.2 代謝物E-3174
單劑量口服兩種制劑后，氯沙坦鉀代謝產(chǎn)物E-3174 AUC0-¥ 幾何均值分別為3587.5和3570.6 m g.h.L -1，比率為1.00，90%可信限為(0.96，1.06)；Cmax的幾何均值分別為527.9和516.3m g·L-1，比率為1.02，90%可信限為(0.94，1.12)。Tmax分別為3.15和3.37 h，差值為-0.22 h，90%可信限為(-0.62，0.18)。雙單側(cè)檢驗表明，口服兩種制劑后， E-3174的AUC、Cmax和Tmax均具有生物等效性。
Table 4. Bioequivalence Evaluation
, 百拇醫(yī)藥
Compound
Parameter
N
Geometric Mean
Geometric
Mean Ratio
MSE
90%
Confidence
Interval
Two One-sided Test
Hangzhou Tablet
, 百拇醫(yī)藥
Merck Tablet
t1
t2
Losartan
AUC0-∞
(mg.h.L-1)
(mg.h.L-1)
18
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505.2
477.5
1.06
0.0212
(0.97, 1.15)
5.762
3.438
Cmax
(mg.L-1)
(mg.L-1)
, 百拇醫(yī)藥
18
298.6
264.5
1.13
0.1576
(0.89, 1.42)
2.602
0.770
E-3174
AUC0-∞
(m g.h.L -1) (m g.h.L -1)
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18
3587.5
3570.6
1.00
0.0048
(0.96, 1.05)
9.867
9.462
Cmax
(mg.L-1)
18
, http://www.www.srpcoatings.com
527.9
516.3
1.02
0.0228
(0.94, 1.12)
4.874
3.992
Compound
Parameter
N
Arithmetic Mean
Arithmetic
, 百拇醫(yī)藥
Mean
difference
MSE
90%
Confidence
Interval
Two One-sided Test
Hangzhou Tablet
Merck Tablet
t1
t2
, 百拇醫(yī)藥
Losartan
Tmax(h)(h)
18
0.91
1.33
-0.42
0.2128
(-0.69,-0.16)
1.028
4.498
E-3174
Tmax(h)(h)
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18
3.15
3.37
-0.22
0.4722
(-0.62,0.18)
1.973
3.913
4. 安全性
所有參加試驗的18名志愿者均列入安全性評價范圍，但沒有一位志愿者主訴感覺不適。其它安全性測試，包括生命體征、體檢和心電圖沒有發(fā)現(xiàn)有臨床意義的異常。
討 論
, 百拇醫(yī)藥
氯沙坦鉀是一種血管緊張素II受體拮抗劑，是一類新型抗高血壓藥物系列的首創(chuàng)藥物。治療高血壓的起始和維持劑量對一般病人為50mg，每天服藥一次。
根據(jù)以前進行的氯沙坦鉀生物等效性研究中資料，氯沙坦鉀AUC的幾何均值之比為0.97，均方誤差(MSE)為0.0188。據(jù)此估算，招募18例對象可足以有90%的把握及90%的概率觀測到兩種產(chǎn)品的AUC幾何均值比率落在等效區(qū)間(0.8，1.25)以內(nèi)。
本研究結(jié)果表明，氯沙坦鉀片劑的血藥濃度時間過程有很大的個體差異。以默沙東50mg片劑為例，母體藥物氯沙坦鉀的Cmax的范圍為127.35 - 733.92 m g.L-1，Tmax從20min到約2h，AUC0-¥ ?范圍為238.11 - 1136.39 m g.h.L -1。
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多項研究報道表明，口服氯沙坦鉀后的羧基化代謝產(chǎn)物E-3174對血管緊張素Ⅱ受體的抑制作用比氯沙坦鉀強得多[1-3]。E-3174在很大程度上決定了氯沙坦鉀片對人體的抗高血壓作用，它使后者的藥效一直持續(xù)至服藥后24h之后[3]。本研究表明，氯沙坦鉀血漿濃度達到峰值后，下降很快，10h內(nèi)降至檢測限以下；E-3174血漿濃度在氯沙坦鉀之后2h左右達到峰值，其高濃度狀態(tài)持續(xù)時間較長，消除較慢。
本研究結(jié)果顯示，單劑量口服杭州默沙東產(chǎn)50 mg氯沙坦鉀片劑后，氯沙坦鉀的平均Tmax較小，平均Cmax較高，推測可能與兩種制劑的崩解時速差異有關(guān)。但作為生物等效的主要判斷指標AUC0-¥ ?幾何均值比率的90%可信限為(0.97，1.15)，落在0.80-1.25的等效范圍內(nèi)。 重要的是其強效活性代謝產(chǎn)物E-3174的AUC0-¥ 、Cmax和Tmax在兩種制劑之間均無明顯差異。因此，根據(jù)本研究結(jié)果，可以認為口服杭州默沙東產(chǎn)50mg氯沙坦鉀片劑與英國默克產(chǎn)50mg氯沙坦鉀片劑的吸收程度為生物等效。
, 百拇醫(yī)藥
據(jù)研究[4]，氯沙坦鉀在人體內(nèi)約有14%轉(zhuǎn)化為E-3174，雖然如此，E-3174在血漿中的濃度較氯沙坦鉀高，這是由于E-3174在清除率比氯沙坦鉀的清除率要低得多，而且E-3174的消除不受氯沙坦鉀轉(zhuǎn)化為E-3174的速率所限制，從而掩蓋了由制劑間氯沙坦鉀吸收速率的差異對E-3174的Tmax、Cmax所造成的影響。
參考文獻
1. Sachinidis A, Ko Y, Weisser P, et al. EXP3174, a metabolite of losartan (MK 954, DuP 753) is more potent than losartan in blocking the angiotensin Ⅱ-induced responses in vascular smooth muscle cell. J Hypertens, 1993; 11:155~162.
, http://www.www.srpcoatings.com
2. Stearns RA, Chakravarty PK, Chen R, et al. Biotransformation of losartan to its active carboxylic acid metabolite in human liver microsomes. Role of cytochrome P4502C and 3A subfamily members. Drug Metab Dispos, 1995; 23: 207~215.
3. Alain M, Yves C, Jurg N, et al. Drug concentration response relationship in normal volunteers after oral administration of losartan, an angiotensin ii receptor antagonist. Clin Pharmacol Ther, 1992; 51:513~521.
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19999-11-06
2000-01-20, http://www.www.srpcoatings.com
單位：韋陽 邵慶翔 張美云 王恪申 郝轉(zhuǎn)業(yè) 桑國衛(wèi)(浙江省醫(yī)學科學院，杭州 310013)；黃慧芳 孫東升(浙江省人民醫(yī)院，杭州，310014)；陳建新(杭州默沙東制藥股份有限公司，杭州，310006)
關(guān)鍵詞：氯沙坦鉀；E-3174
中國臨床藥理學雜志000208摘 要 18名健康男性志愿者交叉單劑量口服杭州默沙東產(chǎn)50mg氯沙坦鉀片和英國默克產(chǎn)50mg氯沙坦鉀片，以HPLC-UV法測定血漿中氯沙坦鉀及其活性代謝產(chǎn)物E-3174的濃度，并對兩種制劑進行生物等效性評價。試驗結(jié)果表明：口服杭州產(chǎn)及默克產(chǎn)氯沙坦鉀，氯沙坦鉀Cmax分別為352.20± 196.09和291.20± 124.41m g.L-1， Tmax分別為0.91± 0.38和1.33± 0.69h，AUC0-∞分別為547.44± 226.77和499.52± 157.31 m g.h.L-1，t1/2分別為1.89± 0.49和1.80± 0.51h；E-3174 Cmax分別為545.07± 150.49和534.02± 142.88m g.L-1， Tmax分別為3.15± 1.07和3.37± 0.66h，AUC0-¥ 分別為3641.57± 637.17和3631.72± 687.94 m g.h.L-1，t1/2分別為8.33± 2.05和7.74± 1.22h。統(tǒng)計分析表明，兩制劑間氯沙坦鉀的Cmax、Tmax有顯著差異，而氯沙坦鉀的AUC0-∞、E-3174的Cmax、Tmax 和AUC0-∞ 無顯著差異。
, 百拇醫(yī)藥
RELATIVE BIOAVAILABILITY OF LOSARTAN TABLET IN HEALTHY VOLUNTEERS
WEI Yang, SHAO Qing-Xiang, ZHANG Mei-Yun,WANG Ke-Sheng, HAO Zhuan-Ye, SANG Guo-Wei
(Zhejiang Academy of Medical Sciences, Hangzhou 310013)
HUANG Hui-Fang，SUN Dong-Sheng
(The People’s Hospital of Zhejiang Province)
CHEN Jian-Xin2
, 百拇醫(yī)藥
(Hangzhou MSD Pharmaceutical Co., Ltd.)
Abstract This is an open randomized, two-period crossover study in 18 healthy male volunteers. Subjects receive a single oral dose of 50mg losartan tablet produced by Hangzhou–MSD and by U.K-MERCK .The plasma concentrations of unchanged losartan and its active metabolite, E-3174 are determined by using HPLC method. The main pharmacokinetic parameters are as follows: Cmax of losartan (Hangzhou-MSD) and losartan (U.K.-MERCK) are 352.20± 196.09 and 291.20 ± 124.41mg.L-1, Tmax are 0.91± 0.38 and 1.33± 0.69h, AUC0-∞ are 547.44± 226.77 and 499.52± 157.31 m g.h.L-1, t1/2 are 1.89± 0.49 and 1.80± 0.51h, respectively；Cmax of E-3174 (Hangzhou-MSD) and E-3174(U.K.-MERCK) are 545.07± 150.49 and 534.02 ± 142.88mg.L-1, Tmax are 3.15± 1.07 and 3.37± 0.66h，AUC0-∞are 3641.57± 637.17 and 3631.72± 687.94 mg.h.L-1，t1/2 are 8.33± 2.05 and 7.74± 1.22h,respectively. According to statistic study , the differences of two parameters,Cmax and Tmax of unchanged losartan between two formulations are significant,but AUC0-∞of unchanged losartan and three parameters,Cmax,Tmaxand AUC0-∞of E-3174 show no significant difference between two formulations.
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Key words losartan; E-3174; metabolite
氯沙坦鉀，2 -丁基 - 4 - 氯-1-[[2'-(1H - 四唑-5-基)[1,1'-聯(lián)苯] -4- 基]甲基]-1H-咪唑-5-甲醇單鉀鹽，是一種口服有效的非多肽類血管緊張素Ⅱ受體(AT1亞型受體)拮抗劑，為一類新型抗高血壓藥物。本研究采用標準雙周期交叉研究評價單次口服杭州默沙東產(chǎn)氯沙坦鉀片和英國默克產(chǎn)氯沙坦鉀片后母體化合物氯沙坦鉀及其活性代謝產(chǎn)物2 -丁基 - 4 - 氯-1-[[2'-(1H - 四唑-5-基)[1,1'-聯(lián)苯] -4- 基]甲基]-1H-咪唑-5-羧酸(E-3174)的生物等效性。
材料與方法
1. 藥品與試劑
受試制劑氯沙坦鉀片，杭州默沙東產(chǎn)，規(guī)格每片50mg，批號8442-002；對照制劑氯沙坦鉀片，英國默克公司產(chǎn)，每片50mg，批號9810770。
, 百拇醫(yī)藥
氯沙坦鉀標準品，批號005H069，純度99.7%；E-3174標準品，批號002X008，純度99.1%；內(nèi)標L-158,854標準品，批號000F004，均由杭州默沙東制藥有限公司提供。
乙腈、甲醇、甲基-叔-丁基醚，HPLC級；雙重蒸餾水，自制；磷酸二氫鈉、氫氧化鈉、檸檬酸鈉、檸檬酸、正己烷、異丙醇、磷酸(85%)，AR級。
2. 儀器
HPLC系統(tǒng)：島津LC -10A雙泵、 SPD-10A檢測器、CTO-10A柱溫箱、DGA -10A脫氣儀；7125手動進樣閥；MN公司Nuclesil 100-5CN柱(250×4.6mm)；杭州英譜公司HS色譜數(shù)據(jù)工作站(3.5版)。
3. 受試對象
本研究對象為18名健康男性志愿者，平均年齡20.9± 1.6歲，體重為62.6± 6.1kg。所有受試者在試驗前簽署了知情同意書，并經(jīng)浙江省醫(yī)學科學院醫(yī)學倫理委員會批準進入本試驗。
, 百拇醫(yī)藥
4. 試驗方案
本研究為一隨機、開放、雙周期交叉研究。所有參試對象按隨機表分別先后口服兩種片劑，每次50mg，兩次服藥的間隔洗凈期為14 d。
每次服藥前12h至服藥后36h受試對象在心血管內(nèi)科病房住院觀察，進食統(tǒng)一標準餐；服藥前8h至服藥后3h禁食。受試對象在上午8:00左右以250ml溫開水送服氯沙坦鉀1片。給藥前及給藥后0.33，0.67，1，1.33，1.67，2，3，4，5，6，8，10，12，18，24，36h分別于上肢靜脈取血7ml，離心后得血漿約3ml，-20oC保存待分析。
服藥前1h內(nèi)及服藥后1，2，4，6，8，12，24，36h記錄一次坐位心率/血壓。在整個研究過程中對各種不良反應(yīng)與事件進行監(jiān)測。
5. 分析方法
5.1 色譜條件
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檢測波長：254nm; 柱溫:40oC；靈敏度: 0.001 AUFS；流動相：磷酸鹽緩沖溶液(pH=2.9):乙腈(74:26, v/v)，流速:1.0ml.min-1。
5.2 血漿樣品的預處理方法
15ml圓底試管編號并加入內(nèi)標工作液100m l(1.0 mg.L-1)，用氮氣將甲醇吹干。冷凍血漿在室溫下融化，渦旋20s后于3000r.min-1離心5min，取1.0ml上層血漿至上述試管中，渦旋30s使內(nèi)標溶解，在各試管中加125m l 1.0M H3PO4，渦旋20s，再加甲基-叔-丁基醚(MTBE)8ml，渦旋2min，3000r.min-1條件下離心10min，將試管置于-70oC低溫冰箱中10min使水層凍結(jié)。將有機層傾入預先加有200m l 0.05mol.L-1NaOH的15 ml聚丙烯尖底試管中，渦旋2min，3000r·min-1條件下離心5min，將試管于-70oC放置 7min使水層凍結(jié)，棄去有機相，將殘余MTBE用氮氣吹干，在尖底試管中加入75m l 0.5M pH=4.3的檸檬酸緩沖溶液，渦旋混勻；加入6ml正己烷，渦旋2min，3000r.min-1條件下離心5min，將試管置于-70oC 7min使水層凍結(jié)，棄去正己烷，殘余正己烷用氮氣吹干。加入20 μl 1.0 mol.L-1H3PO4和50m l異丙醇，渦旋混勻，取100m l進樣。
, 百拇醫(yī)藥
5.3 標準曲線的繪制
配制氯沙坦鉀與E-3174濃度均為1000，700，300，100，70，30，10和5m g.L-1的系列標準血漿溶液，按血漿處理方法處理測定，以樣品的色譜峰面積為定量依據(jù)，以待測樣品峰面積與內(nèi)標峰面積的比值(Y)對樣品濃度(X)進行線性回歸得標準曲線方程。
6. 數(shù)據(jù)處理
取可檢測到藥物的最后3個時間點濃度C的自然對數(shù)值lnC對相應(yīng)時間t進行線性回歸分別求得氯沙坦鉀和E-3174在人體內(nèi)的末端相消除速率常數(shù)l ； 用梯形法求算藥時曲線下面積AUC0-t值；計算AUC0-¥ =AUC0-t+l /tn。血漿峰濃度Cmax和達峰時間Tmax取觀測值。
, 百拇醫(yī)藥
AUC和Cmax分別作對數(shù)轉(zhuǎn)換，Tmax不作轉(zhuǎn)換。采用適用于標準2´ 2交叉試驗的方差分析方法分析lnAUC、lnCmax和Tmax。根據(jù)方差分析得出的均方差，參照t-分布計算均值比率或差的90%可信區(qū)間，用方差分析求得均方誤差后按Schuirmann標準雙單側(cè)檢驗程序進行評價，統(tǒng)計軟件SAS。
結(jié) 果
1. 血藥濃度測定方法的評價
在選定的分析條件下，氯沙坦鉀和E-3174的線性范圍均為5～1000m g.L-1，氯沙坦鉀的工作曲線為Y= 0.0078X-0.0084 (r2=0.9992)，E-3174的工作曲線為Y = 0.0146X + 0.0033 (r2=0.9996)。
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在線性范圍內(nèi)，測定各濃度氯沙坦鉀和E-3174的回收率均接近100%，天內(nèi)變異系數(shù)均<5%(表1)。對高(800m g.L-1)、中(200m g.L-1)、低(30m g.L-1)三種濃度的血漿樣品在不同日期共進行12次測定，氯沙坦鉀和E-3174的回收率均接近100%，天間變異系數(shù)均<5%(表2)。
Table 1. Intra-day precision and recovery of plasma standard curves(n=6)
Nominal
concentration (m g.L-1)
Losartan
, http://www.www.srpcoatings.com
E-3174
Found
mean± SD
Recovery
(%)
CV
(%)
Found
mean± SD
Recovery
(%)
CV
(%)
, http://www.www.srpcoatings.com
5
4.82± 0.22
96.40
4.58
5.54± 0.18
110.80
3.23
10
9.47± 0.39
94.70
4.16
10.57± 0.44
, 百拇醫(yī)藥 105.70
4.15
30
28.72± 0.89
95.73
3.10
30.25± 1.58
100.83
5.22
70
69.93± 1.32
99.00
1.88
, 百拇醫(yī)藥
71.40± 2.03
102.00
2.84
100
97.10± 0.96
97.10
0.99
103.69± 4.66
103.69
4.49
300
305.75± 9.92
, 百拇醫(yī)藥
101.92
3.24
294.37± 4.76
98.12
1.62
700
713.98± 17.61
102.00
2.47
696.72± 15.78
99.53
2.26
, 百拇醫(yī)藥
1000
998.09± 18.43
99.81
1.85
1006.21± 9.90
100.62
0.98
Table 2. Inter-day precision and recovery of qualify control samples (n=12)
Nominal
Concentration (mg.L-1)
, 百拇醫(yī)藥
Losartan
E-3174
Found
mean± SD
Recovery
(%)
CV
(%)
Found
mean± SD
Recovery
(%)
CV
, http://www.www.srpcoatings.com
(%)
30
28.83± 0.85
96.09
2.95
29.69± 1.32
98.98
4.45
200
195.88± 4.40
97.94
2.25
, http://www.www.srpcoatings.com 196.11± 7.99
98.06
4.07
800
826.93± 37.20
103.37
4.50
811.11± 34.15
101.39
4.20
在線性范圍內(nèi)比較各濃度經(jīng)提取過程和未經(jīng)提取過程的樣品峰面積，可得各濃度氯沙坦鉀和E-3174的絕對提取回收率分別為96.21%和98.82%。本文所建立的方法對氯沙坦鉀和E-3174的最低檢測限均為5m g.L-1。
, 百拇醫(yī)藥
血漿中雜質(zhì)對測定無明顯干擾， 標準血漿樣品的色譜圖見圖1。
Fig 1. Representative chromatograms of 1 (internal standard), 2 (losartan) and 3 (E-3174).
A: Blank plasma; B: Control plasma spiked with 100ng losartan and E-3174
C: 1h sample from a subject given a single dose of 50mg losartan.
2. 藥代動力學參數(shù)
18名受試對象單劑量口服杭州默沙東產(chǎn)氯沙坦鉀片和英國默克產(chǎn)氯沙坦鉀片后平均藥物濃度-時間曲線見圖2、3。氯沙坦鉀和E-3174在人體內(nèi)的藥代動力學過程均較好地符合二室模型、一級
, 百拇醫(yī)藥
吸收過程。
Fig 2. Mean plasma concentration of losartan following oral administration of 50mg losartan tablet
(t :Hangzhou tablet · : Merck tablet)
Fig 3. Mean plasma concentration of E-3174 following oral administration of
50mg losartan tablet
, 百拇醫(yī)藥
(t :Hangzhou tablet · : Merck tablet)
口服兩種50 mg氯沙坦鉀片劑后氯沙坦鉀和E-3174的Cmax、Tmax、AUC0-t、AUC0-¥ 、l 和t1/2等參數(shù)列于表3。
Table 3. Pharmacokinetic parameters of losartan and E-3174 following
oral administation of losartan tablet(n=18)
Losartan
E-3174
, http://www.www.srpcoatings.com
Parameters
Hangzhou tablet
Merk tablet
Hangzhou tablet
Merk tablet
Cmax(mg.L-1)(mg.L-1)
352.20± 196.09
291.33± 124.41
545.07± 150.49
, 百拇醫(yī)藥
534.02± 142.88
Tmax(h)(h)
0.91± 0.38
1.33± 0.69
3.15± 1.07
3.37± 0.66
AUC0-t(m g.h.L -1)(m g.h.L -1)
, 百拇醫(yī)藥 533.44± 226.10
484.09± 155.38
3566.12± 627.45
3561.93± 688.19
AUC0-∞(mg.h.L -1)(mg.h.L -1)
547.44± 226.77
499.52± 157.31
, 百拇醫(yī)藥
3641.57± 637.17
3631.72± 687.94
l (h-1)
0.39± 0.10
0.41± 0.11
0.09± 0.03
0.09± 0.02
t1/2(h)(h)
1.89± 0.49
1.80± 0.51
8.33± 2.05
, 百拇醫(yī)藥
7.74± 1.22
3. 生物等效性分析
3.1 母體化合物氯沙坦鉀
單劑量口服兩種制劑后，氯沙坦鉀AUC0-¥ 的幾何均值分別為505.2和477.5m g.h.L-1，比率為1.06，90%可信限為(0.97，1.15)在0.8-1.25范圍內(nèi)，表明兩者的生物利用度相仿。Cmax的幾何均值分別為298.6和264.5 m g.L-1，比率為1.13，90%可信限為(0.89，1.42)，表明受試片的Cmax高于對照片。Tmax分別為0.91和1.33 h，差值-0.42h，差值的90%可信限為(-0.69，-0.16)，表示口服受試片后峰值出現(xiàn)較早。
, 百拇醫(yī)藥
3.2 代謝物E-3174
單劑量口服兩種制劑后，氯沙坦鉀代謝產(chǎn)物E-3174 AUC0-¥ 幾何均值分別為3587.5和3570.6 m g.h.L -1，比率為1.00，90%可信限為(0.96，1.06)；Cmax的幾何均值分別為527.9和516.3m g·L-1，比率為1.02，90%可信限為(0.94，1.12)。Tmax分別為3.15和3.37 h，差值為-0.22 h，90%可信限為(-0.62，0.18)。雙單側(cè)檢驗表明，口服兩種制劑后， E-3174的AUC、Cmax和Tmax均具有生物等效性。
Table 4. Bioequivalence Evaluation
, 百拇醫(yī)藥
Compound
Parameter
N
Geometric Mean
Geometric
Mean Ratio
MSE
90%
Confidence
Interval
Two One-sided Test
Hangzhou Tablet
, 百拇醫(yī)藥
Merck Tablet
t1
t2
Losartan
AUC0-∞
(mg.h.L-1)
(mg.h.L-1)
18
, http://www.www.srpcoatings.com
505.2
477.5
1.06
0.0212
(0.97, 1.15)
5.762
3.438
Cmax
(mg.L-1)
(mg.L-1)
, 百拇醫(yī)藥
18
298.6
264.5
1.13
0.1576
(0.89, 1.42)
2.602
0.770
E-3174
AUC0-∞
(m g.h.L -1) (m g.h.L -1)
, http://www.www.srpcoatings.com
18
3587.5
3570.6
1.00
0.0048
(0.96, 1.05)
9.867
9.462
Cmax
(mg.L-1)
18
, http://www.www.srpcoatings.com
527.9
516.3
1.02
0.0228
(0.94, 1.12)
4.874
3.992
Compound
Parameter
N
Arithmetic Mean
Arithmetic
, 百拇醫(yī)藥
Mean
difference
MSE
90%
Confidence
Interval
Two One-sided Test
Hangzhou Tablet
Merck Tablet
t1
t2
, 百拇醫(yī)藥
Losartan
Tmax(h)(h)
18
0.91
1.33
-0.42
0.2128
(-0.69,-0.16)
1.028
4.498
E-3174
Tmax(h)(h)
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18
3.15
3.37
-0.22
0.4722
(-0.62,0.18)
1.973
3.913
4. 安全性
所有參加試驗的18名志愿者均列入安全性評價范圍，但沒有一位志愿者主訴感覺不適。其它安全性測試，包括生命體征、體檢和心電圖沒有發(fā)現(xiàn)有臨床意義的異常。
討 論
, 百拇醫(yī)藥
氯沙坦鉀是一種血管緊張素II受體拮抗劑，是一類新型抗高血壓藥物系列的首創(chuàng)藥物。治療高血壓的起始和維持劑量對一般病人為50mg，每天服藥一次。
根據(jù)以前進行的氯沙坦鉀生物等效性研究中資料，氯沙坦鉀AUC的幾何均值之比為0.97，均方誤差(MSE)為0.0188。據(jù)此估算，招募18例對象可足以有90%的把握及90%的概率觀測到兩種產(chǎn)品的AUC幾何均值比率落在等效區(qū)間(0.8，1.25)以內(nèi)。
本研究結(jié)果表明，氯沙坦鉀片劑的血藥濃度時間過程有很大的個體差異。以默沙東50mg片劑為例，母體藥物氯沙坦鉀的Cmax的范圍為127.35 - 733.92 m g.L-1，Tmax從20min到約2h，AUC0-¥ ?范圍為238.11 - 1136.39 m g.h.L -1。
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多項研究報道表明，口服氯沙坦鉀后的羧基化代謝產(chǎn)物E-3174對血管緊張素Ⅱ受體的抑制作用比氯沙坦鉀強得多[1-3]。E-3174在很大程度上決定了氯沙坦鉀片對人體的抗高血壓作用，它使后者的藥效一直持續(xù)至服藥后24h之后[3]。本研究表明，氯沙坦鉀血漿濃度達到峰值后，下降很快，10h內(nèi)降至檢測限以下；E-3174血漿濃度在氯沙坦鉀之后2h左右達到峰值，其高濃度狀態(tài)持續(xù)時間較長，消除較慢。
本研究結(jié)果顯示，單劑量口服杭州默沙東產(chǎn)50 mg氯沙坦鉀片劑后，氯沙坦鉀的平均Tmax較小，平均Cmax較高，推測可能與兩種制劑的崩解時速差異有關(guān)。但作為生物等效的主要判斷指標AUC0-¥ ?幾何均值比率的90%可信限為(0.97，1.15)，落在0.80-1.25的等效范圍內(nèi)。 重要的是其強效活性代謝產(chǎn)物E-3174的AUC0-¥ 、Cmax和Tmax在兩種制劑之間均無明顯差異。因此，根據(jù)本研究結(jié)果，可以認為口服杭州默沙東產(chǎn)50mg氯沙坦鉀片劑與英國默克產(chǎn)50mg氯沙坦鉀片劑的吸收程度為生物等效。
, 百拇醫(yī)藥
據(jù)研究[4]，氯沙坦鉀在人體內(nèi)約有14%轉(zhuǎn)化為E-3174，雖然如此，E-3174在血漿中的濃度較氯沙坦鉀高，這是由于E-3174在清除率比氯沙坦鉀的清除率要低得多，而且E-3174的消除不受氯沙坦鉀轉(zhuǎn)化為E-3174的速率所限制，從而掩蓋了由制劑間氯沙坦鉀吸收速率的差異對E-3174的Tmax、Cmax所造成的影響。
參考文獻
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